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方法論記事

胎児および新生児マウス卵巣の全マウント免疫染色

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DOI:

10.3791/69455

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2026年4月28日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、発生中のマウス卵巣の全額免疫標識法を説明し、他の小組織への応用も含みます。

要約

卵巣予備は、女性が繁殖のために利用できる卵母細胞で構成され、原始卵胞に存在し、それぞれに1つの卵母細胞が複数の顆粒細胞で囲まれています。卵母細胞は最初は生殖腺の外側に形成される原始的な生殖細胞として始まり、胚発生中に発生中の卵巣へ移動します。卵巣に達すると卵巣となり、有糸分裂によって分裂し、不完全な細胞分裂で生殖細胞嚢胞と呼ばれる相互連結した細胞の塊を形成します。嚢胞内では、細胞が減数分裂に入り卵母細胞になります。マウスでは、出生の2日前に嚢胞が分解され始め、各卵母細胞は原始卵胞に包まれます。この過程で生き残る卵母細胞は一部だけで、残りはアポトーシスを起こします。嚢胞の分解や原初卵胞形成の調節は部分的にしか解明されておらず、関与する分子の特定がこの過程を理解する上で極めて重要です。発生中のマウス卵巣の全マウント免疫染色は、潜在的な調節分子の局在を特定し、卵母細胞および体細胞マーカーを用いて変異やその他の分子変化による原初卵胞形成への影響を評価するために用いられます。胎児または新生児のマウスから卵巣を採取し、ホルムアルデヒドで固定し、閉塞します。卵巣は関心のあるタンパク質に対する抗体にさらされ、その後蛍光タグに結合した二次抗体が一次抗体を検出します。最後に、卵巣を装着し、共焦点顕微鏡で検査します。この手法は複数の関心のあるタンパク質を検出でき、胎児マウスの精巣など他の小さな組織にも適用可能です。

概要

ホールマウント免疫染色と共焦点イメージングの組み合わせは、切片なしで小組織のタンパク質発現や細胞形態を解析する強力な方法です。この方法では、まず組織を採取し、固定・ブロッキングし、その後、関心のあるタンパク質に対する抗体に曝露します。抗体は蛍光分子に直接接合するか、一次抗体を認識する蛍光分子に結合した二次抗体で標識されます。その後、細胞核を観察するために蛍光染料4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で培養されます。このステップは組織画像化時に空間的な向きを示すために重要です。最後に、組織を固定し、共焦点顕微鏡で観察します。組織形態学の研究に用いられているもう一つの技術は、パラフィンに組織を埋め込み、切片し、ヘマトキシリンやエオシンなどの染料や抗体による標識付けです。あるいは、凍結切片を準備して免疫染色を行うことも可能です。残念ながら、これらの技術はどちらも断面化を伴い、三次元情報の損失を招きます。連続セクションは役立ちますが、分析は面倒で多数のセクションを閲覧する必要があります。したがって、ホールマウント法は、光学切片で可視化可能な組織の三次元構造を保持する利点があります。

原始生殖細胞(PGC)が卵母細胞へと発達し、卵母細胞が原始濾胞に組み立てられることは、女性の生殖能力に不可欠です。PGCは胚外で形成され、胚発生時に卵巣へ移動しなければなりません。PGCが卵巣に到達し、マウスの胚発生日(E)10.5頃から始まり、卵巣2型に分類されます。卵原体は有糸分裂を行いますが、不完全な細胞分裂で、生殖細胞嚢胞と呼ばれる相互連結した細胞群を形成します。卵胚はE13.5から減数分裂に入り卵母細胞となり、前期Iを経てディプロテーン期へと進行します。卵母細胞が発達するにつれて嚢胞が分解され、各卵母細胞は顆粒状細胞の層に囲まれ、原初卵胞が形成されます。それぞれに二分割性停止卵母細胞4が含まれています。嚢胞の分解と同時に多数の卵母細胞が失われることがあり、これは原初卵胞形成時の品質管理に重要と考えられています。原始卵胞における二枚閉鎖卵母細胞の数は、生殖可能な卵巣の卵母細胞の予備数を構成し、生殖能力に直接関係しています。卵胞形成が妨げられると、卵巣予備箱が減少し、女性の生殖期間が制限される可能性があります。

全マウント免疫染色を用いて胚、胎児、新生児の卵母細胞発生中のタンパク質の発現を同定・解析しました。検査対象の分子には、MSY2、SYCP3、ESR1、ESR2、CYP19A1、3βHSD、KIT、STAT3 5,6,7,8,9が含まれます。この技術は、原始卵胞形成の制御過程を明らかにするためにも広く用いられています。胎児または新生児の卵巣を培養し、シグナル伝達分子や阻害剤にさらされました。培養卵巣内の卵母細胞はin vivo10と同様に原始卵胞形成を行います。卵巣培養は、この卵巣発生段階におけるステロイドホルモン6、10、11、KIT8、PI3Kシグナル伝達12の検査に成功裏に用いられています。培養後、卵母細胞質で発現するタンパク質であるDEADボックスヘリケース4(DDX4、別名マウス血管相同体(MVH))に対する抗体を用いた全マウント免疫染色が用いられます。その後、卵巣を共焦点顕微鏡で調べ、原初卵胞形成の状況を評価します。

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プロトコル

マウスを用いたすべての処置は、シラキュース大学施設動物ケア・使用委員会(IACUC)によって審査・承認されました。以下のプロトコルは、出生後1日目から5日目に新生マウスの卵巣を標識するためのものです(概略図は 図1 参照)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 収穫と卵巣固定

  1. NIH(国立衛生研究所)の「実験動物のケアと利用に関するガイド」およびIACUC承認の動物プロトコルに従って、新生児C57BL/6マウスの安楽死を行ってください。卵巣を1xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で解剖します。
    注:この手技では、IACUC動物プロトコルで承認された新生マウスの頭部切断による安楽死が行われました。C57BL/6マウス系統のオスとメスは、オスの肛生殖器開口部の間に小さな暗い斑点があることで新生児を区別できます。卵巣を切り離すには、まず胃を切って腸をすくい取ります。次に腹部を開き、尾の正中線切開をしてから、横に2回切開します。各腎臓の下に卵巣を見つけ、各卵巣を隔離し、余分な組織を除去します。
  2. 卵巣を室温(RT)のマイクロフュージ管内に直接600μLの5.3%パラホルムアルデヒド(PFA;16%電磁グレードPFAを1x PBSで希釈したもの)(固定)に入れます。卵巣を固定型で4°Cで一晩(O/N)に培養します。
    注意:パラホルマルデヒドは有毒です。排気フードや換気の良い場所で使用してください。手袋、保護具、保護服を着用し、皮膚や目線の接触を防ぎましょう。有害廃棄物として処分すること。
  3. 卵巣を1mL 0.1%トリトンX-100で2回、1xPBS(PT)で素早く洗浄し、その後1mL PTで少なくとも30分間RTで洗浄します。1mL PT+5% BSA(ブロック)で少なくとも30分間、RTでNuAtorで培養するか、4°Cで最大2週間保存します。

2. 一次抗体および二次抗体のインキュベーション

  1. 一次抗体を500μl PT+5% BSA O/Nで希釈し、4°CのNutatorでインキュベートします。1 mL PT + 1% BSAで3回洗い、30分 RT で Nutator にかけて洗います。
    注意:希釈は抗体によって異なります。ここに示されている代表的なデータは、DDX4を希釈した1:200でラベル付けされています。一次抗体が2つの異なる種で作られ、一方の二次抗体がもう一方の二次的抗体が認識する種に作られていなければ、2種類の異なるタンパク質に対する抗体は同時に使用できます(ヤギ抗マウスAlexa 488やロバ抗ヤギ抗体Alexa 568は使わないでください)。
  2. 一次抗体で卵巣を培養する際、希釈した二次抗体を500μL PT+5% BSA O/Nの500μL PT+5% BSA O/Nで4°Cのナテーター(ホイルで覆い)でインキュベートし、二次抗体の非特異的結合を減らします。二次抗体を6000 x g で30秒遠心分離し、底の残留粉末を採取します。サンプルチューブに二次移送する際に、この残留物を吸い込まないように注意してください。
    注意:希釈は抗体によって異なります。ここに示されている代表的なデータは、ヤギの反ウサギ用Alexa 488を希釈した1:200でラベル付けされています。
  3. 事前に吸収された蛍光二次抗体(ステップ2.2で作成)を投与し、RTで2〜4時間ナテーターでインキュベートします。ここからはホイルで覆いましょう。1 mL PT + 1% BSAで3回洗い、30分間、RTでヌーターを装着します。

3. DAPIによる核の標識とスライド上の卵巣のマウント

  1. PBSで90分間、DAPI 1:1000でRTで培養します。1mL 1x PBSで1回洗浄します。
  2. 200μLの幅広マイクロピペットチップを使って卵巣を顕微鏡スライドに移します。余分なPBSは針や注射器で除去します。卵巣にマウンティング培地を3滴加えます。
  3. 卵巣の上にカバースリップを優しく貼り、取り付け媒体がカバースリップの端に広がるようにします。カバースリップの縁をネイルポリッシュで封印し、乾かしてから-20°Cで保存します。

4. 胚粉の調製

  1. 氷のように冷たい1倍PBSの最小容量で、マウス胚を均質化します ~ E 12.5–E 14.5。氷で冷たいアセトンを4巻加え、混ぜて氷の上で30分間培養します。
    注意:アセトンは可燃性で、目や皮膚の刺激物質です。排気フードや換気の良い場所で使用してください。手袋、保護具、保護服を着用し、皮膚や目線の接触を防ぎましょう。有害廃棄物として処分すること。
  2. 10,000 x g で遠心分離機で10分間、上清液を取り除き、その後氷のように冷たいアセトンでペレットを洗い、再度回転させます。
  3. ペレットをろ過紙の上に広げ、プラスチックトレイに入れて化学フードでO/Nを乾燥させます。細かい粉末にすりつぶし、完全に自然乾燥させてから-20°Cで保存します。

5. 共焦点顕微鏡によるタンパク質発現の解析

  1. 目的のタンパク質を標識した後、共焦点顕微鏡で可視化します。タンパク質発現の検査には、通常3〜4匹(6〜8個の卵巣)を使い、各卵巣の画像を複数枚撮影します。
    注:代表的な結果セクションで記述された画像は、回転円盤共焦点顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡のいずれかで取得されました。使用されるパラメータは代表的な結果のセクションで説明されており、使用される顕微鏡によって異なります。

6. 共焦点顕微鏡による原初卵胞の形成と発生の解析

  1. DDX4のような細胞質卵子マーカーにて卵巣を標識した後、各卵巣ごとに可視化のためにランダムに2つの領域(「コア」)を割り当てます。
    注:コアは4つの主要な光学セクションで構成され、それぞれ212×212μmの深さで15〜20μmの間隔があります。4つの光学セクションは皮質と延髄の両方にまたがり、卵巣のすべての領域が評価されることを保証します。各卵巣には2つのコアがあり、4つの光学セクションがあり、合計8セクションとなります( 図2参照)。
  2. 解析用にメインの光学セクションを撮影した後、メインセクションの上に5枚、下に5枚ずつ、それぞれ1μm間隔でZスタックを撮影します。各主要なセクションごとに、そのセクション内の卵母細胞の総数を数えます
  3. その後、メインセクションの各卵母細胞について、メインセクションとセクションのスタックを調べて、メインセクションの卵母細胞が焦点面の上または下の卵母細胞に関連しているかどうかを判断します。最後に、すべての卵母細胞について、卵胞の発生段階(初代、一次、二次)を特定します。
    注:統計的に有意なデータを得るためには、少なくとも4頭(8個の卵巣)を分析することが推奨されます。

7. 代替核マーカーとしてのヨウ化プロピジウムの使用

  1. ステップ2.3の後、0.1 mg/mlのRNase A(10 μLの10 mg/ml、1 mLのPT+1% BSA)で30分間インキュベートします。RNase Aを除去し、10 μg/mLのプロピジウムヨウ化物(10 μL 1 mg/mL 1 mL を1 mL PT + 1% BSA)で20分間、ヌーテーターでRTでインキュベートします。ここからはチューブをホイルで覆いましょう。
    注意:プロピジウムヨウ化物は有毒で変異原性があります。排気フードや換気の良い場所で使用してください。手袋、保護具、保護服を着用し、皮膚や目線の接触を防ぎましょう。有害廃棄物として処分すること。
    注:トト-3は核マーカーとしても使用できます。
  2. ヨウ化プロピジウムを除去し、1 mL PT+1% BSAで30分間洗います。ステップ3.1(DAPI染色)は飛ばしてください。

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結果

ここで説明する免疫染色法の典型的な結果を示します。図3、図4、図5、図6の画像は、40倍油対物レンズNA 1.3を用いてスピニングディスク共焦点顕微鏡で撮影され、露光時間は100〜250ミリ秒、レーザー出力は0.01〜0.1%です。図3では、新生マウスの卵巣に、マウス卵母細胞質で発現するタンパク質DDX4に対する抗体と、核マーカーのプロピジウムヨウ化物が標識されています。出生後1日(PND)マウスの卵巣の共焦点切片は図3A–Cに示されており、原始卵胞にいくつかの卵母細胞が存在しますが、ほとんどは生殖細胞嚢胞内にあります。対照的に、

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ディスカッション

本報告書は、対象タンパク質の全卵巣を蛍光標識する方法を説明しています。この手法は、原始卵胞形成時のタンパク質の発現を決定し、また異なる条件下(4,5,6,7,8,9,10,11)での卵胞形成の変化を特徴付けるために広く用いられています。この方法が組織の切片を行う方法に比べての利点は、三次元構造が保存される点です。

この手技には核標識の工程が...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

画像診断はシラキュース大学のブラットイメージングセンターで行われました。図7の画像は、NIH S10 OD026946-01A1でサポートされたZeiss LSM980とAiryscan2から取得されました。この研究はNIH(MEP)からの助成金R03 HD102016およびR21 HD112756によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンチヒューマンVASA(ヤギ製)R&DAF2030
アンチDDX4/MVH(ラビット製)アブカムAB13840
アンチGCNA1/TRA98(ネズミ製)アブカムAB82527
牛血清アルブミン(BSA)フィッシャーBP-1600
カバースリップ 22 x 22 #1.5ワーナー・インストゥルメンツ64-0721
DAPI(粉末)シグマ・オルドリッチD-9542dH2Oに5 mg/ml溶液を準備します
解剖用スコープ
ドンキー・アンチ・ゴート・アレクサ568インビトロジェンA11057
DonkeyアンチマウスAlexa 488インビトロジェンA21202
Donkey 反ラビット Alexa 568インビトロジェンA10042
Donkey 反ウサギAlexa 647インビトロジェンA31573
Donkey Anti-Rat Alexa 488インビトロジェンA21208
エタノール200プルーフファームコ111000200
ファインシザーズ - シャープファインサイエンスツール14060-09卵巣摘出や余分な組織の切除などの細かい作業に用いられます
鉗子(デュモントピンセット、スタイル5)電子顕微鏡科学72705-01(0209-5-PO)
ヤギの反ウサギAlexa 488インビトロジェンA11008
マイクロ遠心分離機チューブ 1.5 mLサーモ・サイエンティフィック3451PK
顕微鏡スライドフィッシャーブランド12-550-123
ヌーテーティングミキサーLabNetS0500
パラホルマルデヒド 16%電子顕微鏡科学15710
ペトリ皿 100 x 15 mmバイオプラスト製造940-10774
リン酸塩緩衝生理食塩水 1X(フィッシャー)S271-1;         (シグマ)P9541-500G;(フィッシャー)BP332-500;(フィッシャー)P285-500800 mL MQ H2O              80 g NaCl                    KCl の2.0;                       14.4 g Na2HPO4およびnbsp;        2.4 g KH2PO4         HClでpHを7.4に調整します。最終ボリューム1 L 次に10Xから1Xに希釈して使用します
ピンホルダーファインサイエンスツール26016-12まっすぐな針をわずかに曲げて固定するために
ピペットフィルターのチップワンティップ(10uL) 1121-3810;             (20 uL)1120-1810;         (200 uL) 1120-8810;    (1000 uL XL)1122-1830
ピペットの先端OneTIp(10 uL) 1111-3800;         (200 uL) 1111-1800;    (1250 uL) 1112-1820
ピペット 0.2-2、2-20、20-200、100-1000ギルソン(0.1-2 uL)F144054M;   (2-20 uL)F144056M;  (20-200 uL)F144058M;   (100-1000 uL)F144059M
ヨウ化プロピジウム、dH2Oに1mg/mlインビトロジェンP3566
RNase Aパウダーシグマ・オルドリッチRG513-50mg0.1 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)に10 mg/mL溶液を準備します。100<サプリ><>Cで15分間加熱します。冷やしてRTし、1 M Tris-Cl(pH 7.4)の0.1 mLを加えてpHを調整します
ストレートニードル卵巣から余分な組織を切断するために、直針を曲げて曲げて
トライトン X-100サーモ・サイエンティフィックX100-100ML
結核リンシリンジ 28G x 1/2タイコ/ヘルスケア ケンダル・モノジェクト1180128012
ベクタシールドベクターラボラトリーズH-1900
ワーグナー・シザーズファインサイエンスツール14068-12斬首や大きな切り傷のために
ワイドボアピペットチップ 20 ulラボコン1026-965-008-9

参考文献

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