横紋筋肉腫におけるチアゾロン誘導体の治療の可能性を探るためのネットワーク薬理学および in vitro 細胞実験研究

サマリー

横紋筋肉腫に対するチアゾロン誘導体の治療可能性を、ネットワーク薬理学と計算化学に基づいて体系的に調査し、 in vitro 細胞実験を通じて検証と評価を行う研究を紹介します。

要約

横紋筋肉腫 (RD) は横紋筋芽細胞に由来する悪性腫瘍であり、小児や青年の健康に深刻な脅威をもたらします。この研究は、さまざまな生物学的活性におけるチアゾロン誘導体の可能性に基づいて、ネットワーク薬理学と in vitro 細胞実験を組み合わせることにより、RD の治療におけるチアゾロン誘導体のメカニズムを体系的に調査することを目的としています。ネットワーク薬理学を通じて、ハイスループットデータを統合して、チアゾロンの潜在的な標的を予測しました。さらに、AutoDock Vina ソフトウェアを使用して化合物と標的タンパク質分子の結合エネルギーを計算し、RD に関連するシグナル伝達経路を明らかにしました。最後に、 in vitro 細胞実験により、化合物の腫瘍抑制効果がさらに検証されました。RDの治療におけるチアゾロン誘導体の標的を分析するためにネットワーク薬理学を使用し、組み合わせと重複排除によって最終的に172の標的遺伝子が得られました。結合エネルギーの低い5つのタンパク質標的を、化合物と標的タンパク質分子PIK3CD、AKT1、GSK3B、HSP90AB1、およびITGB1との間のドッキングによってスクリーニングしました。in vitro 細胞培養実験の結果は、特定のチアゾロン誘導体が RD 細胞株に対して有意な阻害効果をもたらすことを示し、RD の治療に新しい標的と効果的な化合物の発見に科学的根拠を提供します。この研究は、ネットワーク薬理学と in vitro 実験の組み合わせを通じて、RD の治療におけるチアゾロン誘導体のメカニズムを明らかにし、将来の医薬品開発と治療戦略に新たな視点を提供しました。

概要

横紋筋肉腫 (RD) は、小児の健康に重大な脅威をもたらす非常に攻撃的な小児軟部肉腫であり、治療の選択肢は限られています。疫学研究によると、RD は発生率が比較的低い一方で、悪性度が高く、予後が悪いため、臨床上大きな課題が生じています。RDは、胚性、肺胞性、紡錘細胞/硬化性、および多形性の4つの異なる組織学的サブタイプに分類され、胚性横紋筋肉腫(ERMS)が^{最も一般的な形態です1,2,3}。新たに診断された低リスクERMS患者に対する現在の治療戦略は、主にビンクリスチン、ダクチノマイシン、シクロホスファミドなどの化学療法剤と組み合わせた限局性腫瘍の外科的切除を含む。高リスク患者は通常、イホスファミドとエトポシドを組み込んだ強化された多剤化学療法レジメンを受けます ^4,5。手術、化学療法、放射線療法を組み合わせた集学的アプローチは、局所腫瘍制御の達成と微小転移の根絶に有効性が実証されていますが⁵、重大な課題が残っています。神経毒性や不可逆的な腎臓および膀胱の損傷⁶ を含む、現在の化学療法剤の実質的な毒性プロファイルは、小児および青年の患者に特にリスクをもたらします。さらに、RD の固有の不均一性とその再発傾向は、より効果的で標的を絞った治療薬を開発する重要な必要性を強調しています⁷。

これに関連して、ここでの研究は、異なる薬理学的特性を持つチアゾロン誘導体のクラスに焦点を当てています。チアゾロン誘導体は、有意な抗炎症作用、抗酸化作用、およびアポトーシス調節活性⁸ を示し、幅広い生物学的活性と医薬品開発の有望な可能性を示しています ^9,10。Elgubbi et al. による分子ドッキング シミュレーションにより、チアゾロン誘導体の攻撃的な腫瘍で過剰発現する低酸素誘導性酵素であるヒト炭酸脱水酵素 IX (CA IX) などの主要な標的に対する強い結合親和性が明らかになり、それらの抗増殖効果のメカニズムが示唆されました¹¹。この計算研究により、チアゾロン誘導体とがん関連タンパク質の間の分子相互作用が解明されます。2024年、El-Helf.らは、ベンゾキノリンベースのチアゾロン誘導体ががん細胞株に対して強力な活性を示し、チアゾレチオンとチアゾール類似体が最高の有効性を示していると報告しました¹²。機構研究^10,13 は、これらの化合物が、(1) 抗酸化経路の調節による酸化ストレスの誘導と (2) 増殖の直接阻害という 2 つの経路を通じて腫瘍細胞の生存率を破壊することを示唆しています。これらの発見は、抗炎症作用や抗菌作用を含むチアゾロンの幅広い薬理学的プロファイルを強調しました。特に、ピオグリタゾン¹⁴ やトログリタゾン¹⁵ などの化合物は主に 2 型糖尿病の治療に使用されていますが¹⁶、4-チアゾロン誘導体は白血病細胞に対して抗増殖効果を示します¹⁷ (図 1)。これらの化合物は、臨床研究で大きな治療の可能性を示すだけでなく、腫瘍細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、細胞周期の調節など、複数の細胞シグナル伝達経路を特異的に標的としています。チアゾロン誘導体の抗がんメカニズムには、PI3K/Akt 経路や NF-κB 経路などの重要な経路を調節することにより、腫瘍細胞の増殖と生存を効果的に妨げるいくつかのシグナル伝達経路が関与しています。さらに、チアゾロン誘導体は、血管新生の阻害や免疫応答の調節など、腫瘍微小環境に対する調節効果も示しています¹⁸。チアゾロン誘導体の多面的なメカニズム作用により、チアゾロン誘導体は新しいがん治療薬の開発の理想的な候補として位置づけられています。

以前の研究では、銅触媒による遠位不斉プロパーギル化反応により、隣接するキラル中心を持つチアゾロン誘導体を効率的に構築しました。プロパーギルエステルとチアゾロンを基質として使用し、フェニル置換ピリジンビス(オキサゾリン)リガンドの存在下でCuIによって反応を触媒しました。反応条件を最適化することにより、これらのチアゾロン誘導体の合成において高い効率を達成しました¹⁹。ネットワーク薬理学は、システム生物学のアプローチとして、薬物、標的、疾患経路間の複雑な相互作用を明らかにし、がんのような複雑な疾患の治療法の理解と開発に革命をもたらします²⁰。この研究は、RD の治療における新規チアゾロン誘導体の潜在的な治療的価値を明らかにすることを目的としています。統合されたネットワーク薬理学と細胞実験を通じて、PIK3CDやAKT1を含む5つのコアターゲットを協調的に調節することでマルチターゲット治療効果を発揮し、PI3K-Aktなどの主要なシグナル伝達経路に影響を与える可能性のある優れた活性を持つ化合物が同定されます。分子ドッキングと分子動力学シミュレーションを使用して、化合物タンパク質と標的タンパク質の間の結合特性を実証します。さらに、予備的な構造活性関係モデルが確立され、その後の構造最適化の参考となります。この研究は、横紋筋肉腫の医薬品開発のための新しい候補分子を提供するだけでなく、薬物の多標的治療メカニズムの探索における学際的な戦略の積極的な役割も浮き彫りにしています。

プロトコル

すべてのネットワーク薬理学手順は、ネットワーク薬理学評価方法のガイドライン²¹ に従って実施されました。この研究で採用された包括的なネットワーク薬理学ワークフローを 図2に概略的に示します。

チアゾロン誘導体の合成
この研究のチアゾロン誘導体は、銅触媒による遠隔不斉プロパーギル化反応を通じて、以前の研究¹⁹で合成されました。この反応では、CuIを触媒として、キラルなPyboxリガンド(L1)を立体制御コアとして、DIPEAベースとメタノール溶媒系で-10°Cで48時間使用し、プロパーギルエステルとチアゾロンの間の高いエナンチオ選択的カップリングを達成しました。目標生成物は、最大89%の収率、97.8:2.2のエナンチオマー比(er)、および17.8:1のジアステレオマー比(dr)で得られました。この一連の化合物の合成方法の詳細については、以前の研究¹⁹を参照してください。この方法は、アリール(オルト置換基、メタ置換基、パラ置換基)、脂肪族鎖、縮合環プロパーギルエステル、およびさまざまな置換チアゾロンに対応し、51%から98%の範囲の収率で、幅広い基質適用性を示しました。この戦略は、マルチキラル中心チアゾロンフレームワークをワンステッププロセスで初めて効率的に構築し、医薬品化学における重要な応用の可能性を秘めたキラル薬物分子の合成に高度に選択的で簡単なアプローチを提供します。

ネットワーク薬理学的予測
チアゾロン誘導体のターゲット予測: チアゾロン誘導体の構造表現は KingDraw ソフトウェアを使用して生成され、対応する構造ファイルはその後、Open Babel ソフトウェアを介して SMILES ID に変換されました。RDに対する潜在的な治療標的を予測するために、SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)、TargetNet(http://targetnet.scbdd.com)、SuperPred(https://prediction.charite.de)の3つの異なる標的予測データベースを利用した包括的な計算アプローチを採用しました。TargetNet解析では、確率>0の遺伝子を選択することで、厳格なフィルタリング基準を実装しました。SuperPredデータベースでは、より厳密な選択パラメータを適用し、モデル精度>90%、確率>60%を示す遺伝子のみを保持し、信頼性の高いターゲット予測を確保しました。

RDターゲットの予測:GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)とOMIMデータベース(https://omim.org/)に基づいて、横紋筋肉腫の検索を実施しました。GeneCardsデータベースから得られたデータについては、横紋筋肉腫に関連する遺伝子を取得するために、20を超えるスコアで結果をフィルタリングしました。

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築と解析:チアゾロン誘導体の潜在的な標的とRDに関連する遺伝子が交差しました。チアゾロン誘導体によるヒト胚性横紋筋肉腫の治療の潜在的な標的をSTRINGデータベース(https://www.string-db.org/)にアップロードし、信頼性の高い標的PPI(タンパク質間相互作用)関係解析を行いました。PPIネットワークはCytoscapeソフトウェア(http://www.cytoscape.org/)で構築され、度数値に基づいてコアターゲットがスクリーニングされました。

化合物-疾患-標的経路ネットワークの構築:薬物-標的-経路ネットワークは、化合物と疾患の標的と、これらの標的に関与する経路を明確に確認できるため、RDの複合療法の可能な主要な標的と経路を特定できます。まず、スプレッドシートでネットワークテーブルと属性テーブルを作成します。ネットワークテーブルの内容には、主に化合物とコアターゲット間の対応、コアターゲットと関係する経路の間の対応、およびRDとメイン経路の間の対応が含まれます。属性テーブルの内容は、主にネットワークテーブル内のすべての情報を分類して名前を付けることです。その後、Cytoscape ソフトウェアを開き、ネットリストを読み込み場所にアップロードし、開始点、終了点を設定し、属性テーブルをアップロードし、最後に画像形状を変更します。

統合機能アノテーションとネットワーク薬理学解析- 京都遺伝子ゲノム大百科事典(KEGG)の遺伝子オントロジー(GO)濃縮構築:コアターゲットのGOおよびKEGG濃縮解析をDAVIDデータベース(https://david.ncifcrf.gov/)により実施しました。P値の小さいものから大きいものの順に、GOの生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)の上位10項目を分析対象に選択し、KEGGの上位20項目を分析し、コアターゲットのGOおよびKEGGバブルマップを作成しました。

分子ドッキング:PDBデータベース(https://www.rcsb.org/)からコアターゲットタンパク質を選択し、コアターゲットの構造ファイルをダウンロードしました。最初に、PyMolソフトウェアを使用してタンパク質を脱水し、続いてリガンドと受容体を分離しました。続いて、ADFRSuiteソフトウェアを使用してタンパク質を水素化し、AutoDock分子ドッキングソフトウェアのグリッドボックスパラメータを取得しました。チアゾリジノン誘導体とコア標的タンパク質のpdbqtファイルは、AutoDock Vinaソフトウェアを使用して調製されました。次に、チアゾロン誘導体とコア標的タンパク質の分子ドッキングシミュレーションを実施しました。最後に、分子ドッキングモデルをPyMolソフトウェアを使用して視覚化しました。

分子動力学シミュレーション:PDBファイルは、amber99sb-ildn力場とTIP3P水モデルを使用して、GROMACS互換のGRO形式に変換されました。
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
タンパク質から1.2 nmの距離で立方周期境界ボックスを追加しました。
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt cubic
箱にはTIP3P水分子が詰められていました。
GMX 溶媒和酸 -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
システムは、Naイオンを追加することによって中和されました。
gmx grompp -f ions.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ions.tpr
GMX Genion -s ions.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -中立
エネルギーの最小化が実行されました。
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
NVT平衡化は、次の方法で実行されました。
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
gmx mdrun -deffnm nvt -v
NPT平衡化が実行されました。
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
gmx mdrun -deffnm npt -v
生産分子動力学シミュレーションが開始されました。
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
gmx mdrun -deffnm md_0_1 -v

シミュレーションが完了すると、得られた軌道を視覚分子動力学(VMD)とPyMOLを用いて解析し、g_mmpbsaプログラムを用いてタンパク質と低分子リガンド間の結合自由エネルギー解析を行いました。

RD細胞生存率に対する薬物効果の評価
RD細胞(胚性横紋筋肉腫細胞;STR Authenticated)をトリプシン処理して、1 x10⁵ cells/mL の濃度で細胞懸濁液を作成しました。次に、この懸濁液を1 x 10^4細胞/ ウェル(ウェルあたり100 μL)の密度で96ウェルプレートに播種し、細胞接着を可能にするために5%CO₂ とともに37°Cでインキュベートしました。接着後、培地を1%FBSを含む100 μLの無血清培地に置き換え、細胞を12時間飢餓させた。続いて、培地を、さまざまな濃度の試験化合物を含むそれぞれの培地100 μLと交換しました。対照ウェルを溶媒含有培地または通常の培地のいずれかで処理し、細胞のない対応する培地のみを含むブランクウェルを含めました。プレートを37°Cで5%CO₂ とともに24時間インキュベートしました(持続時間は、RD細胞に対するこのクラスの化合物の最大の阻害効果を観察するのに最適であると予備実験によって決定されました。つまり、セル密度のOD値が約1.0に達するのに必要な時間です。その後、10 μLのCCK-8溶液を各ウェルに添加し、プレートをさらに1〜4時間インキュベートしました。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定しました。溶媒処理細胞を対照群として機能し、ブランクウェルをベースライン補正に使用しました。細胞生存率は、吸光度の読み取り値に基づいて計算されました。

生存率% = [(対照群-空白)-(実験群-空白)]/(対照群-空白)x 100%

結果

この研究では、13 のチアゾロン誘導体 (化合物 a-m; 図3、 図4)は、癌細胞に対する阻害活性の評価のために¹⁹ を以前に合成しました(図5)。これらの化合物の中で、100μMの化合物mは、RD細胞(胚性横紋筋肉腫細胞)に対して最も高い阻害率を示しました(STR認証)²²。さまざまな濃度(5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM)を含むその後の実験では、RD細胞のIC50値は53.14 μMであることが明らかになりました(図6B)。 図6Aに示すように、10μMの低濃度の適用は、RD細胞とHepG2細胞の両方で最小限の阻害を示し、有意な効果は観察されませんでした。しかし、RD細胞とHepG2細胞に100μMを適用した場合、R...

ディスカッション

ネットワーク薬理学は、複雑な漢方薬成分内の潜在的な活性分子を予測およびスクリーニングし、漢方製剤における多成分、多標的、および多経路作用の相乗メカニズムを解明するために一般的に使用されています。本研究では、ネットワーク薬理学的アプローチを適用し、化合物-標的-経路-疾患ネットワークを構築することにより、新たに合成したRDに対するチアゾロン誘導体の潜在的なメカニズムを体系的に調査しました。本研究では、ヒト横紋筋肉腫RD細胞の増殖に対する13種類のチアゾロン誘導体の阻害効果を体系的に評価した。それらの構造的特徴に基づいて構造活性相関(SAR)分析を実施しました。すべての化合物はさまざまな程度の抗増殖活性を示し、化合物mは最も強力な阻害を示し、細胞生存率を対照の21.7%に低下させました。RD細胞とHepG2細胞に100μMを適用したところ、RD細胞の生存率はHepG2細胞よりも有意に低く、化合物mは高濃度でもHepG2細胞に対して弱い阻害効果を示したが、RD細胞に対しては特異的な阻害効果を示した。

構造分析により、フェ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CCK-8アッセイキット	ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社	C0038	水溶性のテトラゾリウム塩を還元して着色生成物を形成することに基づいて細胞の生存率と増殖を測定するためのキット。
クリーンベンチ	蘇州安定航空技術有限公司	SW-CJ-1FD	細胞培養やその他の敏感な物質を取り扱うための無菌環境を提供する層流型のワークフローワークステーション。
CO2インキュベーター	ヒールフォース	HF90	細胞培養には、最適な成長条件を維持するために、温度、湿度、CO2制御環境が用いられます。
DMEM高血糖	シチバ	SH30022.01	高グルコース濃度(4.5 g/L)の細胞培養培地で、急速に成長する哺乳類細胞を含むさまざまな細胞タイプに適しています。
FBS	イェーセン	40130ES76	細胞培養培地によく含まれている補助食品で、細胞増殖に必要な成長因子、ホルモン、栄養素を提供します。
倒立顕微鏡	オリンポス	IX51	対物レンズがステージの下に設置され、フラスコやプレート内の細胞培養を下から観察できる顕微鏡。
マイクロプレートリーダー	ディアテック	DR-200B型	マイクロプレート試料中の生物学的、化学的、または物理的な現象を吸収、蛍光、または発光を測定することで検出するための装置です。
PBS	進悟生物医療技術株式会社	GNM20012	バッファー溶液は、細胞洗浄、希釈溶液、pH安定性の維持に生物学的研究で一般的に用いられます。
RD(胚性横紋筋肉腫細胞)(STR認証済み)	上海富恒バイオテクノロジー有限公司	FH0712	この細胞株は短タンデム反送(STR)解析によって認証されており、明確な遺伝的背景と明確な細胞同一性を有し、実験データの信頼性と再現性を確保しています。
RMPI 中型改造(1640年)	シチバ	SH30809.01	ヒト白血球細胞向けに開発された広く使われている細胞培養培地は、現在ではさまざまな哺乳類細胞タイプに使用されています。
トリプシン-EDTA	進悟生物医療技術株式会社	GNM25200	細胞外タンパク質を分解しカルシウムイオンをキレートさせることで、付着細胞を培養表面から剥離する溶液です。