Method Article

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、大腸菌からエラスチン様ポリペプチド(ELP)を精製するための迅速かつ再現性のある有機溶媒ベースの抽出および沈殿法を説明 しており、 従来のELP精製法に代わる拡張可能な代替手段を提供します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エラスチン様ポリペプチド(ELP)は、哺乳類のトロポエラスチンに見られるモチーフを模倣した反復的なペンタペプチド配列から作られた設計された生体高分子です。その独自の特性により、薬物や遺伝子の送達から組織工学、標的分子イメージングに至るまで、幅広い生物医学応用に理想的な候補となっています。大 腸菌 (E. coli)発現からの従来の精製方法は、包摂体の形成によりELPには効果がない場合があります。逆遷移サイクリング(ITC)などの他の方法は、ELPの低臨界溶液温度(LCST)特性を利用してリポ多糖(LPS)などの汚染物質から分離しますが、通常は複数の加熱・冷却工程が必要で時間がかかり、ELP構成要素の配列、濃度、分子量によっては回収率が低くなることがあります。これらの課題に対処するため、ELPの本来の疎水性を活用した有機溶媒ベースの抽出-沈殿ワークフローを開発し、大 腸菌 細胞ペレットから直接迅速かつ堅牢かつ広く適用可能な精製を可能にします。この方法は極性有機溶媒を用いて細胞破壊を助け、ELPを一段階で選択的に溶解させます。その後の沈殿工程では、残留有機溶媒、低分子量不純物、エンドトキシンを効果的に除去し、3時間以内にLPSレベルが1EU/mL未満の非常に純度の高いELPが得られます。原子間力顕微鏡のデータによると、この方法で精製されたELP融合タンパク質は自己組織化して逆ミセル様構造となり、融合タンパク質の機能を維持することが示唆されています。この急速精製法は、研究者にELPを単純化し、拡張可能な方法を提供し、ELPとその融合タンパク質を材料および生物医学応用の柔軟な構成要素として活用する新たな可能性を生み出します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エラスチン様ポリペプチド(ELP)は、繰り返し(VPGXG)nモチーフ1,2,3,4,5,6,7,8,9からなる生体高分子です。ペンタペプチド単位内のゲスト残基Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であったことがあります。Xの変動は、ELP構造の疎水性、熱遷移挙動、機能特性を調整し、モジュール式の生体適合性材料を作成するために用いられます。これらは様々な生体医学応用で広く探求されています10,11,12。

化学合成は短いペプチドの生....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 材料の準備

  1. 細菌株:大 腸菌 BL21(DE3)の化学的に適格な細胞を発現宿主として使用します。
    注:これらは高い形換え効率と組換えタンパク質生産に適した特性が評価され、選ばれました。
  2. 発現プラスミド:アンピシリン耐性9のELP-I-Cm2融合タンパク質をコードするpET21(+)ベクターを使用します。プラスミドベクターはaddgeneから購入してください。インテインの末端にあるBsrG I部位を使ってCm2遺伝子を挿入します。
    注:このタンパク質のプラスミドDNA配列は 補足ファイル1に記載されています。
  3. 成長培地:1200 mL培地用のTerrific Broth(TB)培地準備
    1. トリプトン16g、酵母エキス32g、プロリン16g、グリセロール6.8mL、超純水1100mLを加えて培地(パート1)を準備します。すべての成分を溶かすために十分に混ぜます。最終的な容量を超純水で1200mLに調整します。
    2. リン酸カリウムバッファー(パート2)は、KH2PO4 23.1gとK2HPO4 125.4gを混ぜて準備し、超純水で1Lま....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルの最終段階を経た後、次のステップはSDS-PAG分析とクマッシーブルー染色による抽出-沈殿結果の可視化です。有機抽出前に溶解段階がある場合、顕著なELPバンドが見られます。ELP-I-Cm2の場合、このバンドは100 kDaで現れます(図3A)。

異なる有機溶媒の組み合わせのスクリーニングでは、抽出効率にばらつきがあり(図3B)、各組み合わせで異なる濃度と純度が得られることが示されました。融合タンパク質の純度と機能性アッセイに基づいて抽出-沈殿に最適な組み合わせを選び、その後の大規模ELP精製に用いています。AG(イソプロパノール:アセトニトリル)とBG(ブタノール:アセトニトリル)1:1の混合物は、ELP-I-Cm2の場合、他の組み合わせと比較して最も高いタンパク質回収率(2.2〜2.6 g/L)を生み出しました。

有機抽出後に精.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITCは以前、ELP19の非クロマトグラフィー精製に使用されてきました。しかし、時間がかかり、収穫量も低い方法となることがあります。上記の方法では、ELP-I-Cm2融合タンパク質の急速精製アプローチを説明し、有機溶媒を用いた抽出沈殿法が多様なELPおよびELP融合の精製に効果的に利用できることを示します。有機溶媒プロトコルはITCよりも高速であるだけでなく、ITC法に挑戦できる短いELP配列に対してもはるかに効果的です。また、産業用途においてはITCよりもスケーラブルな代替手段となる可能性があります。このアプローチは、ワークフローの各段階で核酸、LPS、代謝物、宿主細胞タンパク質などの不純物を効率的に除去します。我々の研究室の過去の研究では、この手法は配列長や等電点に関わらず幅広いELP構成要素で効果的であることが示されており(図1)、ITC 7,9,18<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは何も明かすことはありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究の支援をいただいたパデュー大学がん研究所およびNIH CCSGプログラム(CA23168)に感謝いたします。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-メルカプトエタノールバイオ・ラッド161-0710SDS-PAGEコンポーネント
30% アクリルアミド/ビスアクリルアミドTCIA3218SDS-PAGEコンポーネント
アセトンフィッシャー・サイエンティフィックA949有機溶媒
アセトニトリルフィッシャー・サイエンティフィックA996有機溶媒
アンピシリンゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーA-301-25抗生物質
APS(過硫酸アンモニウム)バイオ・ラッド1610700SDS-PAGEコンポーネント
ブタノールフィッシャー・サイエンティフィックL13171有機溶媒
EDTAフィッシャー・バイオリエージェントBP118-500リシスバッファーコンポーネント
エタノールデコン・ラボUN1170有機溶媒
エチルアセテートフィッシャー・サイエンティフィックE195有機溶媒
グリセロールリサーチプロダクツ・インターナショナルG22020-0.5Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
塩酸フィッシャー・サイエンティフィックA144SI-212リシスバッファーコンポーネント
インスタントクーマジーステインアブカムAB119211SDS-PAGEコンポーネント
IPTGゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー12481C25タンパク質発現成分
イソプロパノールフィッシャー・サイエンティフィックA451-1有機溶媒
K2HPO4(リン酸カリウムモノカルシウム)ウォーズの科学470302-246パート2 バッファ成分
KH2PO4(リン酸二塩基ポタシウム)ウォーズの科学470302-254パート2 バッファ成分
L-プロリンリサーチプロダクツ・インターナショナルP5200-500.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
リソザイムゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーL-040-1リシスバッファーコンポーネント
メタノールフィッシャー・サイエンティフィックA452有機溶媒
ネイティブサンプルバッファバイオ・ラッド161-0738SDS-PAGEコンポーネント
プロテインラダーゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーP008-500SDS-PAGEコンポーネント
解析ゲルバッファバイオ・ラッド1610798SDS-PAGEコンポーネント
ソディム・ドデシル硫酸塩(SDS)サーモ・サイエンティフィックJ18220-36SDS-PAGEコンポーネント
水酸化ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィックS318-500リシスバッファーコンポーネント
スタッキングゲルバッファバイオ・ラッド1610799SDS-PAGEコンポーネント
テメッドバイオ・ラッド1610801SDS-PAGEコンポーネント
トリス・ベースフィッシャー・バイオリエージェントBP-152リシスバッファーコンポーネント
トリプトンリサーチプロダクツ・インターナショナルT60065-1000.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
酵母エキスリサーチプロダクツ・インターナショナルY20025-1000.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles