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方法論記事

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

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DOI:

10.3791/69465

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2026年1月9日

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1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、大腸菌からエラスチン様ポリペプチド(ELP)を精製するための迅速かつ再現性のある有機溶媒ベースの抽出および沈殿法を説明 しており、 従来のELP精製法に代わる拡張可能な代替手段を提供します。

要約

エラスチン様ポリペプチド(ELP)は、哺乳類のトロポエラスチンに見られるモチーフを模倣した反復的なペンタペプチド配列から作られた設計された生体高分子です。その独自の特性により、薬物や遺伝子の送達から組織工学、標的分子イメージングに至るまで、幅広い生物医学応用に理想的な候補となっています。大 腸菌 (E. coli)発現からの従来の精製方法は、包摂体の形成によりELPには効果がない場合があります。逆遷移サイクリング(ITC)などの他の方法は、ELPの低臨界溶液温度(LCST)特性を利用してリポ多糖(LPS)などの汚染物質から分離しますが、通常は複数の加熱・冷却工程が必要で時間がかかり、ELP構成要素の配列、濃度、分子量によっては回収率が低くなることがあります。これらの課題に対処するため、ELPの本来の疎水性を活用した有機溶媒ベースの抽出-沈殿ワークフローを開発し、大 腸菌 細胞ペレットから直接迅速かつ堅牢かつ広く適用可能な精製を可能にします。この方法は極性有機溶媒を用いて細胞破壊を助け、ELPを一段階で選択的に溶解させます。その後の沈殿工程では、残留有機溶媒、低分子量不純物、エンドトキシンを効果的に除去し、3時間以内にLPSレベルが1EU/mL未満の非常に純度の高いELPが得られます。原子間力顕微鏡のデータによると、この方法で精製されたELP融合タンパク質は自己組織化して逆ミセル様構造となり、融合タンパク質の機能を維持することが示唆されています。この急速精製法は、研究者にELPを単純化し、拡張可能な方法を提供し、ELPとその融合タンパク質を材料および生物医学応用の柔軟な構成要素として活用する新たな可能性を生み出します。

概要

エラスチン様ポリペプチド(ELP)は、繰り返し(VPGXG)nモチーフ1,2,3,4,5,6,7,8,9からなる生体高分子です。ペンタペプチド単位内のゲスト残基Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であったことがあります。Xの変動は、ELP構造の疎水性、熱遷移挙動、機能特性を調整し、モジュール式の生体適合性材料を作成するために用いられます。これらは様々な生体医学応用で広く探求されています10,11,12。

化学合成は短いペプチドの生成に用いられますが、高分子量のELPや融合タンパク質の機能性保持にはあまり適していません(13,14)。これらの理由から、ELPは通常大腸菌で組換え発現され、配列定義による大量生産を可能にします。しかし、このアプローチには課題も伴います。大腸菌での発現中、ELPsはしばしば高密度包摂体内に蓄積するため、機能的タンパク質を抽出するために効率的な回復戦略が必要です15。さらに、細菌発現は精製時にELPから分離しなければならない宿主細胞タンパク質、核酸、リポ多糖(エンドトキシン)などの不要な生体分子を導入します。洗剤(例:ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)やトリトンX-100)や尿素のようなカオトロピック剤を用いた従来の溶解法は、ELP融合配列において限定的な成功にとどまっています。私たちの経験では、トリトンと尿素はペレット相からELPを抽出できず、SDSは部分的な溶解を可能にしましたが、下流の親和性精製を妨げ、疎水性ELP配列から完全に除去するのが困難でした。

現在に至るまで、逆遷移サイクリング(ITC)はELPの精製法として最も広く使われています。この技術はLCSTの挙動を利用して、ELPを温度および塩分勾配で選択的に沈殿し再溶解させます16。しかし、分子量の低いタンパク質では、ITCは時間のかかる多段階プロセスであり、包摂体に閉じ込められたELPには適していません。複数のITCサイクルが必要で、各ステップ7,16でタンパク質が失われる可能性があります。

これらの制約を克服するために、有機溶媒を用いた抽出および沈殿ワークフローを採用しました。Yakhninらは1998年にエタノールと塩の勾配を用いたGFP精製のための疎水性駆動の分割戦略を初めて実証しましたが、私たちが開発した新規法は有機溶媒混合物を用いて大腸菌細胞からELP融合タンパク質を直接抽出するものです7。SweetらとDarjiらはこの手法をELP融合に応用し、有機溶媒抽出が構造の完全性と生物活性を維持しつつ機能的なELPの迅速な回復を可能にすることを示しました8,9。この方法は超音波処理と有機溶媒を用いて細菌細胞を溶解し、ELPを一度に抽出しつつ、宿主タンパク質や核酸の大部分を沈殿させます。ELP豊富な有機相の回収と、溶媒や可溶性不純物からELPを分離するための急速沈殿により、非常に純度の高いELPが得られます。この方法は、内毒素レベルが1EU/mL未満の大腸菌ペレットから3時間以内に純ELPを得ることも可能です7,8。

これまでの研究では、この方法は分子量や等電点が異なるELP構成体やELP融合タンパク質を、複数のITCサイクルや溶解段階を経ずに精製できることが示されています(図1)。原子間力顕微鏡(AFM)および透過電子顕微鏡(TEM)イメージングは、この方法で精製されたELP融合タンパク質が逆ミセル状構造を形成することを示唆しており(図2)、これにより有機溶媒抽出時にELP融合ドメインの構造と機能の保存に寄与しています。この効率的なワークフローにより、多様な生体医学アプリケーション向けのELP精製がより迅速かつ信頼性の高いものとなります7,8。特に、Aayushらはこの方法で精製されたELP構成要素が表皮成長因子受容体結合機能18を保持していることを報告し、この方法が純粋なELP物質を生成するだけでなく、融合タンパク質ドメインの活性も維持していることを示しています。

ELP酵素融合の単離におけるこの方法の有用性をさらに示すため、ELP-インテイン-コリスメイトミューターゼ2(ELP-I-Cm2)構成要素を精製するための詳細な有機溶媒ベースの方法を記述します(図3)。この方法は、薬物送達やナノ材料用途のための他のELPの急速精製にも有用かもしれません。

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プロトコル

1. 材料の準備

  1. 細菌株:大 腸菌 BL21(DE3)の化学的に適格な細胞を発現宿主として使用します。
    注:これらは高い形換え効率と組換えタンパク質生産に適した特性が評価され、選ばれました。
  2. 発現プラスミド:アンピシリン耐性9のELP-I-Cm2融合タンパク質をコードするpET21(+)ベクターを使用します。プラスミドベクターはaddgeneから購入してください。インテインの末端にあるBsrG I部位を使ってCm2遺伝子を挿入します。
    注:このタンパク質のプラスミドDNA配列は 補足ファイル1に記載されています。
  3. 成長培地:1200 mL培地用のTerrific Broth(TB)培地準備
    1. トリプトン16g、酵母エキス32g、プロリン16g、グリセロール6.8mL、超純水1100mLを加えて培地(パート1)を準備します。すべての成分を溶かすために十分に混ぜます。最終的な容量を超純水で1200mLに調整します。
    2. リン酸カリウムバッファー(パート2)は、KH2PO4 23.1gとK2HPO4 125.4gを混ぜて準備し、超純水で1Lまで増やします。
    3. 部品(パート1とパート2)は別々にオートクレーブしてください。オートクレーブ後、結核塩基を4つの300 mLアリコートに分けて培地を組み立てます。各アリコートに33 mLのリン酸塩緩衝液を無菌条件下で加えます。
  4. 表現のための加算
    1. IPTG:最終濃度1.2 mMでIPTGを用いた誘導を行います(例:396 μLの1 M IPTGを330 mLの培養に加える)。
    2. 抗生物質:最終濃度100 μg/mLにアンピシリンを加え、プラスミド選択を確実にします。
  5. 溶解バッファー(pH 8.5):溶解バッファーに10 mMのトリス塩基と22 mMのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を準備します。必要に応じてHClまたはNaOHを使ってpHを8.5に調整してください。
  6. 抽出用の有機溶媒
    1. ELP-I-Cm2融合タンパク質を包有体から抽出するために、さまざまな有機溶媒(表1)を用います。これらの溶媒を個別および二進の組み合わせ(1:1のボリューム:ボリューム)でテストし、効率とELP純度を評価します。
      注:使用されたすべての溶媒はHPLCグレードで、アセトニトリル(オプティマグレード)、エタノール(USPグレード)、1-ブタノール(99%純度)を除く。
      注意:上記のすべての溶媒は揮発性かつ可燃性です。適切なPPE(白衣、ニトリル手袋、目の保護具)を用いて化学換気フード内で取り扱う必要があります。多くのプラスチック製品は有機溶剤とは互換性がありません。ポリプロピレンプラスチック製の器具は、有機溶媒を用いた抽出・沈殿実験に強く推奨されます。それ以外の場合、使用するプラスチック製品は貴重なサンプルなしで検査し、使用に適しているか確認してください。溶剤廃棄物の処分は、関連する機関の有害廃棄物ポリシーに記載された手順に従うべきです。

2. 細胞溶解と調製(図4A)

  1. 再懸濁:細胞ペレット1gを計量し、新たに調製した4mLの溶解バッファーに再懸浮させます。ペレットが完全に分散しバッファーと混合されるまで、優しく渦巻きます。
  2. 酵素溶解:細胞壁の消化を助けるために~5mgのリソザイムを加えます。懸浮液を4°Cで1時間孵化させます。これにより部分的な酵素的消化が促進され、細胞溶解を促進します。
  3. 超音波検査:インキュベーション後、サンプルを超音波処理して細胞溶解とゲノムDNAの切断を完成させます。過熱を避けるために、短時間のマイクロチッププローブソニック(350Wデバイス、パワーレベル3)を間隔をあけて使用してください(例:5秒オン/10秒オフ、必要に応じて繰り返す)。サンプルを氷上で超音波処理し、超音波エネルギーを適用して、目に見える粒子のない均一な溶合液が得られるまで約5〜8分間処理します。
    注意:超音波検査が完了した後は、抽出および沈殿の前後の精製経過を監視するため、ELP発現解析のために100μLのサンプル(または解離液)を保存してください。
  4. 遠心分離およびエクスプレス解析。
    1. 10,000gで20°Cで遠心分離し、10分間溶解液を清算し、その後上清液(可溶性分数)をペレット(不溶性/包有体部分)から慎重に分離します。
    2. SDS-PAGEで両方の分画におけるELP発現を評価します:上清液のアリコート(例:10-20 μL)を抽出し、同等のペレット質量を溶解バッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA)で同じ体積に再懸濁します。それぞれに4×ラエムリバッファーを混ぜて最終1×にし、95°Cで5分間加熱し、同じ量を充填して直接比較できるようにします。
    3. 標的ELPが主に可溶性であれば、清算された上清液を用いた有機溶媒抽出を進めます。もし主に不溶性(包摂体)であれば、上清液を廃棄し、有機溶媒抽出で処理して包摂体処理(洗浄・溶解・抽出)を続けます。
  5. ペレット洗浄と乾燥(包有体内のELPのみ):遠心分離機チューブを反転させ、残留溶解バッファーの重力補助排水を可能にします。液体が見えて排出されたら(~1〜2分)、ペレットを室温で5〜10分間自然乾燥させ、過剰な水分がない状態を確認してから有機抽出に進みます。

3. 有機抽出(図4B)

注意:各ELPには高純度抽出のための独自の好ましい溶媒条件があります(例: 図1の交流性能)。したがって、28種類の有機溶媒とその組み合わせを最初にスクリーニングし、PAGEによって分離株を解析して、対象の構成要素に対する最適な溶解効率条件を特定する必要があります。

  1. 溶剤スクリーニング。ステップ1.6で示された個々の溶媒と、それらの1:1(v/v)二元溶媒混合物をスクリーニングします。効果を高めるために追加の混合物(例:1:2、2:1、4:1)を評価してください。
    注:現時点では、最も効果的な溶媒や組み合わせを合理的に選択するためのガイドラインは存在せず、これまでに疎水性タンパク質集合体の溶解に成功した溶媒から選択するためのスクリーニングキャンペーンが必要です。精製に使用される有機溶媒抽出剤の最終選択は、このスクリーニングから得られた分離物のSDS-PAGE分析に基づいて行うべきです。
  2. 抽出手順
    1. 溶媒添加:溶化後に得られた空気乾燥ペレット/上清液に4 mLの有機溶媒または溶媒混合物を加えます。混合組み合わせの場合は、正確な体積比(例:1:1の組み合わせでは各2mL)を確保してください。
    2. 渦巻き:懸濁液を1分間激しく渦巻かせ、溶媒がペレットに完全に混ざり浸透することを確実にします。
    3. 培養(保持時間):懸濁液を20°Cで5分間培養し、ELPが有機相で溶解する間、細胞外タンパク質が凝集・沈殿するのに十分な相互作用時間を確保します。
    4. 遠心分離:13,000 × g で混合物を20°Cで10分間遠心分離し、溶解タンパク質と残留不溶性ゴミを分離します。
    5. 上澄液の採取:ペレットを乱さずに慎重に上澄液を採取します。上清液には溶解したELPが含まれ、ペレットには宿主細胞タンパク質、核酸、脂質が含まれています。
    6. 体積測定:回収された上清液の体積を正確に記録します。上清液にペレット粒子が入っていないことを確認する必要があります。この測定は下流の降水ステップにおいて非常に重要です。

4. タンパク質沈殿

  1. 抗溶媒添加:有機上清液に測定容量の2.33倍の量でアセトンまたはアセトニトリルを加えます。
  2. 孵化:混合物を20°Cで5〜7分間孵育します。
  3. 遠心分離:10,000gで20°Cで10分間遠心分離機を使います。
  4. ペレット取り扱い:遠心分離後、上清液を慎重に捨て、チューブをキャップなしで優しい窒素ガス流の下で10〜15分間自然乾燥させるか、キャップのない遠心分離機チューブを逆さまにしてフムフードに置き、20°Cで1時間培養します(加熱は控えます)。

5. タンパク質ペレットの取り扱いと再懸濁

  1. 再懸濁:沈殿と自然乾燥の後、タンパク質ペレットを50μLのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に再懸浮させます。ペレットが完全に溶けているか確認するために、優しく上下にピペットを動かしてください。
  2. 保存:再懸濁タンパク質を-20°Cで短期間から中期に保存します。タンパク質の機能的完全性を維持するために、繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。

6. SDS-PAGによる検証

  1. サンプル準備:精製タンパク質を4:1の比率で4× SDS-PAGEローディングバッファーと混ぜ、均質性を確保するために短時間ボルテックスを行います。
  2. 電気泳動条件:ELP-I-Cm2の15% SDS-PAGEゲルに装填し、100-120Vでトラッキング染料が底に到達するまで駆動します。
    注意:ゲル中の交橋率は、関心のあるELP構成要素のサイズに基づいて判断してください
  3. 染色と可視化:インスタントブルークマッシー染色または他の適切な染色剤で、20°Cで2時間染色します。 脱イオン水ですすぎて、背景がクリアになるまで除去します。活性アッセイで単離されたタンパク質を検査し、有機溶媒抽出-沈殿精製ワークフロー後に活性保持が起こったか検証します。

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結果

プロトコルの最終段階を経た後、次のステップはSDS-PAG分析とクマッシーブルー染色による抽出-沈殿結果の可視化です。有機抽出前に溶解段階がある場合、顕著なELPバンドが見られます。ELP-I-Cm2の場合、このバンドは100 kDaで現れます(図3A)。

異なる有機溶媒の組み合わせのスクリーニングでは、抽出効率にばらつきがあり(図3B)、各組み合わせで異なる濃度と純度が得られることが示されました。融合タンパク質の純度と機能性アッセイに基づいて抽出-沈殿に最適な組み合わせを選び、その後の大規模ELP精製に用いています。AG(イソプロパノール:アセトニトリル)とBG(ブタノール:アセトニトリル)1:1の混合物は、ELP-I-Cm2の場合、他の組み合わせと比較して最も高いタンパク質回収率(2.2〜2.6 g/L)を生み出しました。

有機抽出後に精製されたELPが機能を維持するかどうかを判断するために、融合タンパク...

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ディスカッション

ITCは以前、ELP19の非クロマトグラフィー精製に使用されてきました。しかし、時間がかかり、収穫量も低い方法となることがあります。上記の方法では、ELP-I-Cm2融合タンパク質の急速精製アプローチを説明し、有機溶媒を用いた抽出沈殿法が多様なELPおよびELP融合の精製に効果的に利用できることを示します。有機溶媒プロトコルはITCよりも高速であるだけでなく、ITC法に挑戦できる短いELP配列に対してもはるかに効果的です。また、産業用途においてはITCよりもスケーラブルな代替手段となる可能性があります。このアプローチは、ワークフローの各段階で核酸、LPS、代謝物、宿主細胞タンパク質などの不純物を効率的に除去します。我々の研究室の過去の研究では、この手法は配列長や等電点に関わらず幅広いELP構成要素で効果的であることが示されており(図1)、ITC 7,9,18<...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究の支援をいただいたパデュー大学がん研究所およびNIH CCSGプログラム(CA23168)に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノールバイオ・ラッド161-0710SDS-PAGEコンポーネント
30% アクリルアミド/ビスアクリルアミドTCIA3218SDS-PAGEコンポーネント
アセトンフィッシャー・サイエンティフィックA949有機溶媒
アセトニトリルフィッシャー・サイエンティフィックA996有機溶媒
アンピシリンゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーA-301-25抗生物質
APS(過硫酸アンモニウム)バイオ・ラッド1610700SDS-PAGEコンポーネント
ブタノールフィッシャー・サイエンティフィックL13171有機溶媒
EDTAフィッシャー・バイオリエージェントBP118-500リシスバッファーコンポーネント
エタノールデコン・ラボUN1170有機溶媒
エチルアセテートフィッシャー・サイエンティフィックE195有機溶媒
グリセロールリサーチプロダクツ・インターナショナルG22020-0.5Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
塩酸フィッシャー・サイエンティフィックA144SI-212リシスバッファーコンポーネント
インスタントクーマジーステインアブカムAB119211SDS-PAGEコンポーネント
IPTGゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー12481C25タンパク質発現成分
イソプロパノールフィッシャー・サイエンティフィックA451-1有機溶媒
K2HPO4(リン酸カリウムモノカルシウム)ウォーズの科学470302-246パート2 バッファ成分
KH2PO4(リン酸二塩基ポタシウム)ウォーズの科学470302-254パート2 バッファ成分
L-プロリンリサーチプロダクツ・インターナショナルP5200-500.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
リソザイムゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーL-040-1リシスバッファーコンポーネント
メタノールフィッシャー・サイエンティフィックA452有機溶媒
ネイティブサンプルバッファバイオ・ラッド161-0738SDS-PAGEコンポーネント
プロテインラダーゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジーP008-500SDS-PAGEコンポーネント
解析ゲルバッファバイオ・ラッド1610798SDS-PAGEコンポーネント
ソディム・ドデシル硫酸塩(SDS)サーモ・サイエンティフィックJ18220-36SDS-PAGEコンポーネント
水酸化ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィックS318-500リシスバッファーコンポーネント
スタッキングゲルバッファバイオ・ラッド1610799SDS-PAGEコンポーネント
テメッドバイオ・ラッド1610801SDS-PAGEコンポーネント
トリス・ベースフィッシャー・バイオリエージェントBP-152リシスバッファーコンポーネント
トリプトンリサーチプロダクツ・インターナショナルT60065-1000.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント
酵母エキスリサーチプロダクツ・インターナショナルY20025-1000.0Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント

参考文献

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