デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を用いた土壌中の微生物バイオマスの測定

サマリー

本研究は、土壌微生物バイオマスおよび菌類と細菌の比率を定量化するための迅速なddPCR法を提示します。ddPCR由来の微生物バイオマス炭素はクロロホルム燻蒸推定値との相関は弱いものの、追加の土壌サンプリングや厳しい手法を用いずに微生物の存在量を評価するための感度が高くスケーラブルな分子アプローチを提供します。

要約

土壌は陸上最大の有機炭素プールですが、過去200年間で土壌から133トン以上の炭素が失われています。特に炭素と栄養循環を駆動する主要な分解者である菌類や細菌を含む土壌微生物バイオマスの正確な定量は、土壌生態学的機能と健康を理解する上で不可欠です。クロロホルム燻蒸抽出やPLFA分析などの従来の手法は、高いサンプル要件と生化学マーカーを微生物バイオマス推定値に変換する際の不確実性により制限されています。ここでは、16Sおよび18S rRNA遺伝子を標的としたデジタルドロップレットPCR(ddPCR)を用いて土壌中の細菌および菌類の個体量を定量化するための最適化ワークフローを紹介します。この手法により、微生物の遺伝子コピーの絶対定量化、遺伝子コピー数補正因子を用いた細胞数への変換、そしてその後の微生物バイオマス炭素の推定が可能になります。このプロトコルを、土壌質地、土地利用、有機物含有量が異なる5つの世界的に分布する農業システムの土壌に適用しました。ddPCR由来の推定値と、従来のクロロホルム燻蒸推定値による微生物バイオマス炭素の推定値が比較されました。ddPCRは微生物の存在比を高解像度で定量化し、全ゲノムシーケンシングよりも土壌タイプ横断のF:B比のより広範かつ感度の高い推定値を実現しました。ddPCR由来のMBCはクロロホルム燻蒸値との相関が弱いものの、この方法は微生物バイオマスやF:B比などの生態学的指標を評価するための効果的な分子アプローチを提供します。このプロトコルは、微生物の存在比測定と組成解析を統合し、土壌健康評価を進めるための再現性かつ拡張可能な戦略を提供します。

概要

土壌は陸上最大の有機炭素プールであり、植生と大気中の炭素^{を合わせた}よりも多くの炭素を保持しています1.過去200年間で土壌から失われた炭素は133ギガトン(Gt)を超えており、土壌炭素の回復と維持に向けた継続的な取り組みは、世界の土壌健康にとって不可欠です^。土壌の膨大な炭素貯蔵能力を考えると、これらの炭素蓄積の主な寄与源を正確に特定することは根本^{的に重要です。}微生物は土壌内の栄養循環に基本的な役割を果たし、微生物バイオマスは土壌有機炭素(SOC)の重要な構成要素です³。菌類と細菌は土壌環境における主要な分解者であり、これらの生態系の生地球化学的サイクルに不可欠です ^4,5。細菌優勢の土壌では、有機物の分解と栄養塩の鉱化が菌類優勢の土壌よりもはるかに速い^5。菌類対細菌(F:B)比率は土壌健康の指標としてますます利用されています ^6,7;したがって、菌類と細菌の両方を正確に評価することが極めて重要です。

土壌中の微生物バイオマス推定は、クロロホルム燻蒸などの破壊的な化学処理に依存する^{ことが多い8。}他の手法では、基質誘導呼吸やリン脂質^脂肪酸(PLFA)分析などの技術を通じて活動中の微生物群集を選択的に標的とする手法もあります。PLFA分析は微生物群集組成の評価やF:B比の推定に広く用いられています。しかし、異なる菌類や細菌種間で細胞サイズに大きなばらつきがあるため、PLFA濃度をバイオマスや集団ベースのF:B比率に変換する際に不確実性が生じ、そのような推定は信頼性が低い^{可能性があります。フロー}サイトメトリーなどの他の手法は、土壌中の細菌の存在量を決定するためのサンプルスループットを増やすために用いられます。しかし、非微生物粒子が微生物と類似したサイズ、形状、自己蛍光特性を持つため、精度が低下する^{ことがあります。クロ}ロホルム燻蒸は微生物バイオマスを推定するために比較的大量の土壌(>10 g)を必要としますが、市販キットでの抽出を行う際は500 mgのサンプルサイズで十分です。以前のDNA法とクロロホルム燻蒸の比較では、両手法とも微生物バイオマスの推定が可能であるものの、併用することで土壌微生物バイオマスのより信頼性の高い評価が得られることが示されました¹²。

微生物群集評価は土壌健康のあまり活用されていない指標であり、土壌の測定と理解の方法を変革する可能性を秘めています¹³。メタバーコーディング手法は従来、土壌微生物群集の決定に用いられ、細菌の相対的な個体数は16S rRNA遺伝子の増幅領域を評価し、菌類分類群は18S rRNA遺伝子または内部転写スペーサー(ITS)領域¹⁴を用いて標的化されます。菌類のメタバーコーディング手法は異なるゲノム標的領域に依存し、同定された菌類種の多様性と個体数に影響を与えます。菌類種間のITSの長さが不均一であるため、優先増幅や配列決定を促進し、その結果、存在量の誤った推定ができ、菌類群集の誤った評価につながる^{可能性があります。}Fungiquantプライマーは、18S rRNA遺伝子内の特定の可変領域を標的とし、他の真核生物と比較して多様な菌類を包括的にカバーし特異性を示すために開発されました¹⁶。

ほとんどの細菌や菌類は標的遺伝子のコピーを複数持っており、そのため細胞数の推定に偏りが生じます。さらに、菌類は細胞ごとに異なる数の核を持つ多核細胞を持つ^{ことが多いです。}分類群内および分類群間でrRNA遺伝子コピー数の変異が大きく、原核生物では通常15コピー未満、菌類¹⁷では28から511の範囲と推定されています。この変異のため、微生物群集構造を解析する分子技術は半定量的と考えられており、^群集内の種の相対的な個体数の推定を歪めることがあります。測定された遺伝子コピー数(GCN)は、関心分類群18,19,20の推定平均GCNを用いて細胞存在比に通常変換されます。

一部の研究ではメタゲノム的アプローチが用いられており、増幅バイアスの除去や微生物群集全体を包括的に調べる能力など、メタバーコーディングに比べていくつかの利点^{があります。さらに}、真菌と細菌の組成やそれらの相互関係を同時に比較することも可能に^{します。一般的に}、RT qPCRは微生物の含有量^と機能の検出に一般的に用いられます。qPCRは阻害剤に対する感受性が高いため、絶対定量においてデジタルドロップレットPCR(ddPCR)と比較すると^{外部標準を必要とする}ため、制限があります。

ddPCRは、個々の増幅反応を個別の液滴に分割する画期的な技術です。テンプレートはその後、各液滴で個別反応として増幅されます。ddPCRは酵素阻害剤に対する感度が低く、qPCR²⁵よりも精度、再現性、感度、細菌および菌類定量において優れています。さらに^{、土壌中の}細菌や菌類の絶対定量にも利用可能です。ddPCRは微生物組成の変化を評価するために抽出されたDNAと同じものに依存しているため、ddPCRからの存在比データはコミュニティ組成データ²⁶ に直接関連付け、土壌微生物バイオマスの定量に利用できます。

本研究は、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を用いて土壌中の菌類と細菌を定量化する方法を提供します。この最適化された手法は、5つの異なる世界的地点および土地利用の土壌に適用されました。サンプルの位置は、土壌特性、環境条件、管理慣行の幅広いスペクトラムを包含するように選ばれ、多様な環境における当社のアプローチの堅牢性と一般性の評価を可能にしました。これらのデータは、土壌生態学的質の分子バイオ指標としてのF:B比の決定を可能にしました。最後に、微生物ddPCRデータと従来のクロロホルム燻蒸法との推定微生物バイオマスの比較が行われました。

プロトコル

これらのプロトコルの全体回路図は 図1に示されています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 土壌サンプリング

1. 5つのグローバル地点から複合表土サンプル(0〜20cm)を採取し、各地点から25mの範囲内のランダムに選ばれた3点からサンプルを採取します。
   注:すべてのサンプルは、所在する地域の土地利用を代表する農業システムから採取されました。土壌の質感はレーザー回折を用いて特徴付けられ、レーザー回折粒子サイズ分析装置で測定されました(表1)。サンプルは常温で輸送され、4°Cの温度で保存され、さらなる分析が待たれました。

2. DNA抽出

注意:製造元の指示に従い、土壌DNA抽出キットを使用してDNA抽出を行いましょう。すべての工程の室温は20°Cでした。

1. 2 mLのビーズビードチューブを短く回して、ビーズが底に沈殿していることを確認します。土壌100mgと溶液CD1 800 μLを加えます。混合のために短時間ボルテックスを流します。
2. サンプルはビーズミルホモジナイザーを用いて徹底的に均質し、サンプルは6 m s⁻¹の角度で40秒ほど溶解されます。
3. 機械的細胞溶解用のビードビーディングチューブを遠心分離し、15,000 x g で室温で1分間加熱します。
4. 上清液を2mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   注意:上清液にはまだ土壌粒子が含まれている場合があります。
5. 200μLの溶液CD2を加え、5秒間ボルテックスします。
6. 15,000 x g で室温で1分間遠心分離機にします。
7. ペレットを避けて、最大700μLの上清液をきれいな2 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。ペレットは見えるようにします。
8. 600μLの溶液CD3を加え、5秒間ボルテックスします。
9. 650μLの溶解液をスピンカラムに積み込み、室温で15,000 x g の遠心分離機で1分間処理します。
10. フロースルーを廃棄し、すべての溶解液がスピンカラムを通過していることを確認するためにステップ2.9を繰り返します。
11. スピンカラムをきれいな2 mLの収集チューブに入れます。
12. スピンカラムに500μLの溶液EAを加えます。室温で15,000 x g の遠心分離機で1分間加熱します。
13. フロースルーを廃棄し、スピンカラムを同じ2mLの収集管に戻します。
14. スピンカラムに溶液C5を500μL加えます。室温で15,000 x g の遠心分離機で1分間加熱します。
15. フロースルーを廃棄し、スピンカラムを新しい2 mLの収集チューブに入れます。
16. 最大16,000 x g で室温で2分間遠心分離機にします。
17. スピンカラムを新しい1.5 mLの洗脱チューブに入れます。
18. 白色フィルター膜の中心に50〜100μLの溶液C6を加えます。
19. 室温で15,000 x g で遠心分離機で1分間処理します。スピンカラムは廃棄し、溶出液は-20°Cで保存します。

3. 精製DNAの定量化

注:精製DNAは、製造元の指示に従い、蛍光計と二本鎖(dsDNA)広範囲(BR)アッセイキットを用いて定量化されました。

1. バッファーと試薬の比率を199:1で作動溶液を準備します。
2. 各DNA標準基を10 μLを190 μLの作業液に加えます。
3. 180〜199μLの作業液に精製DNA1〜20μLを加えます。最終体積は200μLであるべきです。ボルテックスおよび標準DNAサンプルを常温で2分間培養します。
4. 画面上の指示を使って、蛍光計のDNAサンプルを分析する前に標準を分析してください。

4. プライマーの選択

1. 土壌微生物の分析には、関連する文献に基づいて特定のプライマーを選択してください。細菌には16S rRNAプライマーが^25,27、真菌には18S rRNAプライマーが¹⁶で使用されました。
2. DNA結合型染料ベースのリアルタイムPCR(qPCR)マスターミックスとサーマルサイクラーを用いて増幅を行います。プライマー配列は 表2に示されています。

5. ddPCRを用いた微生物定量

1. 解凍してボルテックスし、すべての試薬を氷に保管してください。
2. ddPCR反応を次のように設定します:0.1 μL(10 μM)順方向および0.1 μL(10 μM)逆16Sまたは18Sプライマー、10 μL ddPCR Evagreen Supermix、0.5 ng テンプレート DNA X μL、ヌクレアーゼフリー水(NFW)を用いて最終反応体積を22 μLに調整します。各カラムのテンプレートの代わりにNFWを加えてネガティブコントロールを作成します。
3. DG8をカートリッジホルダーに入れます。
4. 反応混合物の合計20μLをカートリッジ内の試料ウェルに投入します。
5. エヴァグリーン用の液滴生成オイル70μLを、「オイル」とラベル付けしたカートリッジに加えます。
6. カートリッジをドロップレットジェネレーターに入れ、ガスケットでカバーします。
7. 生成された液滴の40μLを96ウェル(半スカート付き)プレートに移し、PCR増幅を行います。
8. 96ウェルプレートをプレートシーラー(温度、180°C、5秒間)でシールします。
9. 加熱蓋を105°Cに設定し、以下のサイクル条件を用いてください。
   注:(a) 細菌:98°Cで5分間、40サイクル;94°Cで30秒、61°Cで60秒、4°Cで5分、98°Cで10分。(b)菌類:95°Cで5分間、40サイクル;95°Cで30秒、55°Cで1分、72°Cで30秒、4°Cで5分、90°Cで5分。
10. 96ウェルプレートをプレートリーダーに転送してください。
11. QuantaSoftバージョン1.2を用いて各井戸のコピー濃度を評価します。振幅の閾値を調整して、負の液滴と正の液滴を分離します。
12. 反応中のDNA1 ngあたりの遺伝子コピー数を、コピー/μLに最終反応体積(20 μL)を掛け、反応へのテンプレートDNA入力総量で割って次のように計算します:(コピー数^μL-1 ×反応体積)×反応への総DNA入力量。
13. 抽出したDNAあたりの総遺伝子コピー数を、ngあたりの遺伝子コピー数に抽出された総DNAを掛けて計算します。(ngあたりの遺伝子コピー数×抽出された総DNA)。
14. 抽出したDNA1ngあたりの総遺伝子コピー数を、抽出時に処理された土壌の乾燥重量量(g)で割って、グラムあたりの遺伝子コピー数を計算します。
    遺伝子コピー数/グラム=(抽出されたDNAの総遺伝子コピー数/抽出時に処理された土壌の乾燥重量(GDW)/グラム)。
15. 平均遺伝子コピー数(GCN)を用いて、次の式に従って遺伝子コピーを変換して、gdwあたりの細胞数を計算します。
    細胞数 = 1グラムあたりの遺伝子コピー数 / 平均遺伝子コピー数 細胞¹)。
16. 以下の式を用いて細胞番号を微生物バイオマス炭素(MBC)に変換します。
    16S(mg C ^g-1土壌)= 細胞 gdw-1 ×(100 fg ^cell-1) × 10⁻¹⁵(g ^fg-1) × 10³(mg ^g-1)²⁸
    18S(mg C ^g-1土壌)= 細胞 gdw-1 ×(6 fg ^cell-1) x 10⁻¹² (g ^fg-1) × 10³(mg ^g-1)²⁹
    全体のプロセスは 図2に説明されています。
    注:46の細菌門²⁰の平均16S rRNA遺伝子コピー(平均標準± SD)を計算し、細菌の補正係数として使用し、最終値は2.48とされました。一方、菌類については、Lofgrenら¹⁷による補正係数113で遺伝子コピー数が計算されました。微生物バイオマス炭素(MBC)はddPCR由来の細胞数から推定され、細胞内炭素含有量を188あたり100 fg、真菌細胞あたり6 pgと推定^{しました。}

6. 全ゲノムシーケンスによる土壌分子解析

1. Native Barcodeding Kit 24 V14(SQK-NBD114参照)を用いて、Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114プロトコルに従ってシーケンスライブラリを作成します(材料 表参照)。キットに付属している1つのバーコードを各サンプルに必ず使用してください。
2. Oxford Nanopore Technologies R10.4.1フローセルを用いて準備済みライブラリをシーケンスします。
3. シーケンス実行中にMinKnowでベースコールを行い、スーパー精度(SUP)モデルを選択し、バーコードトリム「ON」を選択します。Doradoバージョン:0.7.2+9ac85c6。
4. DNA配列リードの分類を、Kraken2(v2.1.3)³⁰ を用いてNCBI非冗長タンパク質(nr)データベースに対して分類を行います。信頼度0.05。
5. Kraken2の報告ファイルで細菌および菌類の総リード分類を確認してください。
6. 各サンプルごとに細菌や菌類の相対的な存在量を計算してください。

7. クロロホルム燻蒸による土壌微生物バイオマス炭素推定

1. 新鮮な土のサンプルをあらかじめ計量されたフライパンに入れ、105°Cのオーブンで24時間乾燥させます。
2. 乾燥土重量を新鮮土重量から差で割って土壌水分含有量を計算します。
   含水率(%) = _((W 湿潤 –_W乾燥)_{/ W乾燥}) × 100
3. 土壌の水分含有量を使って乾燥物を計算します。
   乾物質(%)=100 – 水分含有量(%)
4. 5gの土を、燻蒸されていないラベルを付けた50mLの遠心分離機チューブ2本に加えます。
5. 燻煙されていない標識チューブに合計25mLの0.5 M K₂SO₄ を加えます。
6. 燻蒸されていないサンプルを軌道シェーカーで室温で1時間振る。
7. エタノールフリークロロホルム2mLを、燻蒸ラベル付きのチューブに直接土壌に加えます。蓋を閉じてパラフィルムで固定し、室温の暗い場所で24時間培養します。
8. 燻蒸されていないサンプルを室温で2,500 x g で10分間遠心分離します。
9. 燻蒸されていないサンプルから上清液をデカントし、0.45μmセルロースフィルターで濾し、-20°Cで保存します。
10. 燻蒸した試料の蓋を外し、フルームフードで2時間排気した後、K_2SO-4抽出(ステップ5-9を繰り返し)を行い、-20°Cで保存します。
11. 全有機炭素分析装置を用いて、燻蒸済みおよび非燻蒸用サンプルの抽出物の炭素濃度を測定してください。
12. 次の式で微生物バイオマス炭素(MBC)を計算します:MBC = (燻蒸済みC含有量-未燻蒸C含有量)/0.45。乾燥重量1グラムあたりの土壌に対して正規化します。

8. 土壌有機物含有量の推定

1. 磁器のるつぼを対流オーブンで105°Cで30分間乾燥させ、その後20°C(W_C)まで冷やしてから計量します。
2. 最大2gの土を乾燥したるつぼに入れて、再度計量します。
3. 充填されたるつぼで土壌サンプルを105°Cの対流オーブンで24時間乾燥させます。
4. 密閉された乾燥器に入れて冷やし、再度重さを量ります(_WS)。
5. マフル炉を550°Cまで予熱し、土を含む坩堝を炉に4時間置きます。
6. 炉から土と一緒にるつぼを取り出し、乾燥器に入れて冷ます。
7. 坩堝と土(W_A)を重さ合わせてください。
8. 550°Cでの培養前後の土壌乾燥重量の差を計算してSOMの割合を測定します。
   SOM_LOI = [(W_S – _{W A})/(W_S –_{W C})] × 100

結果

土壌サンプルは5か所から採取され、土壌有機物含有量は着火損失によって測定されました。研究で使用された各土壌で土壌有機物含有量は3.38%から10.34%の範囲でした(表1)。DNA抽出は各土壌サンプルに対して三倍ずつ行われ、その結果のDNA収量は乾燥土壌1グラムあたり32 ngから4,590 ngの範囲でした(図3A)。

有機物含有量が異なる土壌間でDNA濃度は有意に異なりました(一方元ANOVA p < 0.0001、R²=0.97)。有機物含有量が最も低い土壌Aは、最も低いDNA濃度を示しませんでした。しかし、有機物含有量が最も高い土壌Eは、他のすべての土壌からのDNA濃度が有意に高く(A–D、p < 0.0001)、一方土壌Bは最も低く、AおよびDと大きく異なっていました(p < 0.05)。ddPCRプロトコルは、16Sおよび18S rRNA遺伝子プライマーを用いて各土壌サンプルから精製したDNAに対して実施されました。16S(図3B)および18S rRNA(図3C)遺伝子の1グラムあたりの遺伝子コピー数はddPCRを用いて算出されました。すべての土壌サンプルにおいて、18S rRNA遺伝子のコピー数は16S rRNA遺伝子よりも少なかった。Tukeyの事後検査では、土壌Bが最も16Sおよび18S rRNA遺伝子コピーが最も少なく、乾燥土壌1グラムあたり平均8.8 x 10⁷および4.6 x 10⁶遺伝子コピーであることが示された。土壌Eは他のすべての土壌と大きく異なり、乾燥土壌1グラムあたりそれぞれ4.4 x 10⁹および2.5 x 10 9遺伝子コピーと18S rRNA遺伝子コピーが最も多く存在しました。土壌A–Dの菌類コピーは互いに有意な差はなく、土壌Dの細菌コピーは土壌BおよびEと有意に異なっていました。

各土壌サンプルから精製されたDNAに対して全ゲノムショットガン(WGS)シーケンシングが用いられ、NCBIのnrデータベースに対してKraken2を用いて分類分類が行われました。細菌および菌類に対して分類されたDNA配列リードの総数を用いて、各土壌の菌類:細菌比(F:B)を計算し、ddPCRで推定された遺伝子コピー数から算出された菌類:細菌比と比較しました(補足図1)。ddPCRで得られたF:B比はすべての土壌サンプルで0.022から0.66の範囲で、全ゲノムシーケンスよりも高かったです。最も高い平均F:Bは土壌Eで観察され、ddPCRでF:Bは0.56、WGS法では0.038でした。さらに、ddPCRを用いた土壌サンプルでは、WGSよりもF:B値の範囲がより広がりました。さらに、ddPCR法で決定されたF:B比とWGSデータとの間には正の相関(r = 0.59、R² = 0.35、p = 0.019)が観察されました(補 足図1に示されています)。

細菌と菌類の平均遺伝子コピー数を用いて、計算された遺伝子コピーを元のサンプル中の細菌および菌類細胞数に変換しました(補足図2)。これらのデータは土壌中の微生物細胞の総数を推定するために統合されました(図3D)、土壌間で有意に異なっていました(一方行ANOVA p < 0.0001)。Tukeyのペアワイズ比較解析では、土壌Eで最も微生物含有量が高く、土壌Bから採取されたサンプルで最も低い微生物含有量が見られ、A、D、Eとは有意に異なっていました。

各土壌サンプルに対してクロロホルム燻蒸を三倍にして実施し、各サンプル中の総微生物バイオマス炭素(MBC)を推定しました(図4A)。使用された土壌全体で乾燥土壌あたり3.6〜9.6 mgの炭素が確認され、各サンプル間で有意差は認められませんでした(一方元ANOVA p = 0.266)。細菌および真菌細胞の平均炭素含有量を用いて、ddPCR推定された微生物細胞数を推定される総微生物バイオマス炭素に変換しました。これらのddPCR由来推定値はクロロホルム燻蒸法(図4B)と比較されました。クロロホルム燻蒸法とddPCR法のMBCの関係を評価するために、ピアソン相関(n = 15)が実施されました。両方法間には正の相関が見られました(r = 0.43、R² = 0.18、p値=0.05)。土壌Eからの外れ値、特に有機物含有量が最も高いものが、このわずかに有意な結果に不釣り合いに寄与した可能性があります(図4B)。

図1:土壌サンプル処理の概要。図は、土壌DNAを用いた微生物定量の分子方法と、微生物バイオマス、炭素、土壌有機物を測定する従来の方法を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

図2:16Sおよび18SのddPCRコピーから最終的な微生物バイオマス炭素推定までの細胞計数プロセスのフローチャートで、プロトコルのステップ5.11–5.16を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:土壌の微生物定量。(A) 各土壌サンプルから精製された平均DNA濃度。(B) ddPCRを用いた土壌乾燥重量あたりの平均16S rRNA遺伝子コピー数。(C) ddPCRを用いた土壌乾燥重量あたり1グラムあたりの平均18S rRNA遺伝子コピー数。(D) 土壌サンプル全体の乾燥重量あたりの平均微生物細胞総数。すべての誤差バーは平均の標準誤差を示しています。一方行ANOVAおよびその後のTukey's Post-hoc検定によるペアワイズ比較が行われ、有意差はコンパクト文字表示(有意閾値=0.05)で示されました。サンプルはOM%が最も低い順に順に並べられています。土壌起源(OM%) A:オランダ(3.38)、 B:イラク(5.14)、 C:中国(6.41)、 D:英国(8.19)、 E:英国(10.34)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:クロロホルム燻蒸抽出および遺伝子ベースの細胞推定で測定された微生物バイオマス炭素。(A) クロロホルム燻蒸で抽出されたMBC-有機物含有量が低いから高い順に並べられています。誤差バーは平均の標準誤差を示します。一方経ANOVAとその後のTukey's Post-Hoc検定によるペアワイズ比較が行われ、有意差はコンパクト文字表示(有意閾値=0.05)で示されました。(B) ddPCR遺伝子コピー数から得てバイオマス炭素に変換された細胞存在比から推定されたMBC(細胞gdw ^-1)を、同じサンプルの全有機物と比べてプロットしたものです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧いただけます。

サンプル	土壌の起源	pH	含水率%	有機物%	テクスチャー	土地利用
A	テクセル、オランダ	7.16	19.04	3.38	砂壌土	園芸
B	イラク、ナジャフ	7.58	8.33	5.14	シルトローム	米
C	江西、中国	4.11	8.45	6.41	シルトローム	ゴマ/レイプシード
D	ケンブリッジ、イギリス	6.81	21.8	8.19	シルトローム	小麦
E	エクセター、イギリス	5.44	20.27	10.34	シルトローム	草原

表1:微生物バイオマス測定のための5つの土壌サンプル(A–E)の物理化学的性質および土地利用特性。

ターゲット	BP	前方	裏面	参考文献
16S rRNA	180	5′- ACTCCTACGGGAGGAGGCAGCAG	5′- アタックガクククチクチグ	(Le Geayら、2024年;Ovreåsら、1997年)
18S rRNA	351	5′-ググラアクカカッグキャグ	5′-GSWCTATCCACKCACKA	(Liuら、2012年)

表2:ddPCRを用いて16Sおよび18S rRNA遺伝子を標的化するために選ばれたプライマーペア。

補足図1:ddPCR法とWGSによる全土壌サンプルのF:B比の相関。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:ddPCR法を用いて測定した異なる土壌サンプルの細胞数で、対象は以下の通りです:(A)細菌;および(B)菌類。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

土壌微生物は陸上生態系における主要な分解者であり、栄養循環や土壌中の炭素貯蔵に不可欠な役割を果たしています。土壌微生物の重要性にもかかわらず、遺伝子コピーに基づく方法でその絶対的な存在量を正確に定量化することは困難です。これは、種ごとに標的遺伝子の数が異なるなど、多くの要因によるものです。本研究は、ddPCRを用いて原核生物と真核生物をそれぞれ16Sおよび18S rRNA遺伝子コード領域で標的化することで土壌微生物バイオマスを定量できることを示しています。土壌Eで最も高いF:B比が観察され、このサンプルも有機物の割合が最も高かったです。2番目に高いF:B比はサンプルCで見られ、これらの土壌の高い酸性度と相関していました。これはサンプルCとEで予想されており、^pH31が低いほど真菌の成長が増加します。全ゲノムシーケンシングはddPCR法に用いられたのと同じDNA抽出物に対して実施されました。WGSとddPCRのF:B比を比較しました。WGSデータから計算されたF:B比は、ddPCRデータから計算されたF:B比に比べて解析されたすべてのサンプルで低く、しかし、サンプル間のF:B比の全体的な傾向は各方法間で視覚的に比較可能でした。これにより、土壌サンプルのF:B比は全ゲノムシーケンスよりも高く、土壌タイプ間でF:B比の変動が大きいことが示されました。WGSデータから観察されたF:B比の低さは、菌類と細菌のゲノムサイズの違いによると考えられ、菌類配列は濃縮がなければ過小代表されている^{可能性があります。}さらに、土壌Aは有機物含有量が最も低いにもかかわらず、微生物コピー数や微生物バイオマス炭素数が最も少なく、有機物含有量が必ずしも微生物バイオマスと直接相関しているわけではないことを示しています。特に、起源DNA濃度(図3A)と総微生物細胞(図3D)の傾向が視覚的に類似しており、DNA濃度が微生物バイオマスの良い指標であることを示唆しています。

ddPCRは土壌サンプル内の遺伝子コピー数を正確に定量することに可能であり、この方法を用いて微生物全体の細胞数を推定することが可能です。ただし、考慮すべき制限もあります。16Sおよび18S rRNA遺伝子コピーの数は微生物分類群²³間で大きく異なります。そのため、遺伝子コピー数に単一の補正因子を使うと、サンプル³³における微生物の存在量が過大または過小評価される可能性があります。この制約は、^{微生物群集}に関する事前知識を取り入れ、全ゲノムシーケンスデータを活用し、特定の土壌微生物群を代表する適切な遺伝子コピー数補正を適用することで解決できます。分子法は正確なカウントではなく推定を提供しますが、微生物の存在量をより正確に予測できます。群集の構成データと組み合わせることで、相対的な個体数を超えた解釈が可能になります^19,34。

クロロホルム燻蒸を用いて推定した微生物バイオマス炭素(MBC)では、分析サンプル間で有意な差は認められませんでしたが、サンプルA–D間ではMBCの変動が大きく見られました。一方で、ddPCR法で測定された微生物細胞数には有意な差異が検出され、この分子手法は従来の手法よりも高い解像度を提供する可能性があります。しかし、微生物細胞数から微生物バイオマス炭素を計算することには独自の限界があります。細胞サイズの変動は細胞数のバイオマスへの変換に影響を与えることがあります。遺伝子コピー数に単一の変換係数を使うのと同様に、細菌や真菌の炭素含有量に単一の変換係数を使うと、微生物バイオマス炭素の過大または過小評価につながる可能性があります。

さらに、DNAベースの方法は、細菌と菌類の優性度に大きな差が見られる土壌間で特に問題となることがあります。DNA抽出方法やプライマー設計の選択によってもDNA収量とGCNの両方が影響を受ける^{可能性があり、実験}室間比較が困難になります³⁷。さらに、GCNとDNAの収量方法は、いわゆる「遺物DNA」、すなわち死んだ生物や粘土に結合したDNAのために過大評価されやすい^{可能性があります。}ddPCR法は精度と再現性が向上していますが、Evagreen Chemistry⁵を使用する場合の複雑なプロセス、高コスト、非特異DNA染料の使用など欠点があります。これにより偽陽性が弱くなり、陽性滴と陰性滴の分離が難しくなり、遺伝子コピーが¹⁴未満の場合、わずかな閾値調整の誤りがF:B比に影響を与える可能性があります。このddPCR法で処理可能なサンプル数を増やすために、液体取り扱いロボットによる自動化を用いてDNA抽出や反応セットアップ³⁹を行えます。さらに、新しいddPCRシステムはより大きな多重化を可能にし、96サンプル分のドロップレットを同時に生成します。

すべての微生物バイオマス測定は推定値であり、数値³⁷を算出するために一般変換係数を含んでいることに注意が必要です。したがって、どの方法が最も正確かは不明であるため、方法間の比較は慎重に行うべきです。それにもかかわらず、クロロホルム燻蒸抽出法は過去数十年にわたり広く用いられており、クロロホルム蒸気を利用して土壌を燻蒸しています。これは人間や環境への毒性、土壌^{微生物細胞の}溶解効果のため多くの懸念を引き起こしています。さらに、クロロホルム燻蒸は植物残留物などの非生物源から生成されるMBCの過大評価につながる^{可能性があります。最後に}、この方法は他の分子法に比べて比較的大量の土壌に依存しており、非常に少量の土壌(<500 mg)が必要です。

本研究は、ddPCRを用いた土壌微生物バイオマス測定法が堅牢であり、異なる土壌タイプや潜在的な阻害物質の影響を受けないことの証拠を提供します。この手法の成功は原来DNAサンプルに左右されるため、サンプルからの効果的なDNA精製を確保することが重要です。この方法は、さまざまな土壌タイプや組織における微生物の検出と定量に有望であり、既存の微生物バイオマス推定手法を補完し、地域的またはグローバルなマイクロバイオーム監視のための土壌健康とスケーラビリティのモニタリングにおける将来の貴重な応用を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bettersizer S3 Plus	ベターサイズ、中国	BT-803
遠心分離機	熱科学	SL16
クロロホルム	サーモサイエンティフィック	L14759。補完;
ddPCR 96ウェルプレート	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	12001925
ddPCRドドロップレットリーダーオイル	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1863004
デシケーター	デイヴィシル
DG8カートリッジホルダー	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1863051
QX200/QX100 ドロップレットジェネレーター用のDG8カートリッジ	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1864008
QX200/QX100 ドロップレットジェネレーター用のDG8ガスケット	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	Q33265
DNeasy Power Soil プロキット	ドイツ、キアゲン	47017
二本鎖(dsDNA)ブロードレンジ(BR)アッセイキット	インビトロジェン、ドイツ	Q33230
FastPrep-24 5G	国会議員 生物医学、英国	116005500
GridIONとnbsp;	オックスフォード・ナノポール・テクノロジーズ、英国	GRD-MK1CAPX
K2SO4	メルク、イギリス	7778-80-5
マグバインド磁気ビーズ	オメガ・バイオテック、アメリカ	M1378-01
MinIONフローセル	オックスフォード・ナノポール・テクノロジーズ、英国	FLO-MIN114
こもった炉音	カルボライト	AAF1100
ネイティブバーコーディングキット24	オックスフォード・ナノポール・テクノロジーズ、英国	SQK-NBD114.24
PCRプレート熱シール、ホイル、ピアス可能など;	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1814040
PX1 PCRプレートシーラー	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1814000
量子ビット蛍光計	インビトロジェン、ドイツ	Q33226
QX200 ドロップレットデジタルPCRシステム	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1864001
QX200 ddPCR エヴァグリーン・スーパーミックス	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	186-4033
QX200 EvaGreen 用の液滴生成オイル;	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	1864005
QXDx ドロップレットジェネレーター	バイオ・ラッド、ワトフォード、イギリス	12001049
SENSOQUEST LABCYCLER	ジェネフロー、ドイツ	1120280125