一次ヒト気道上皮培養における蛍光ベースのカルシウムイメージング(自動細胞分割法による)

サマリー

カルシウムシグナル伝達の生細胞イメージングは、単分子層で培養された安定した細胞株におけるカルシウム移動の研究に広く利用されています。このプロトコルは、複雑な一次組織に対するカルシウムシグナル伝達の生細胞蛍光イメージングを用い、機械学習ソフトウェアを活用して数千個の細胞の蛍光強度を同時に定量化することで解析を効率化します。

要約

カルシウムシグナル伝達は多くの生物学的プロセスにおいて重要であり、一次組織中のカルシウムフラックスを研究する方法の開発の必要性を強調しています。複雑な一次上皮培養における単一細胞分解能でのカルシウムシグナル伝達の研究は困難であり、そのため研究は十分に進んでいません。本研究は、一次気道上皮培養における生カルシウムシグナル伝達のモニタリングに適応した手法と、機械学習に基づく解析の新しいアプローチを提示します。患者由来の一次気道上皮培養をALI(空気-液体界面)で分化し、外因性蛍光指示色素を充填し、エピ蛍光顕微鏡を用いてカルシウム移動を単細胞分解能で測定しました。私たちは、機械学習を用いた細胞分割を活用し、時間経過とともに異なる細胞に蛍光強度を割り当てる新しいソフトウェアを開発しました。全体として、適応されたイメージングセットアップとソフトウェアにより、一次上皮培養内の単一細胞を迅速かつ偏りなく解析することが可能となります。ここで紹介するステップバイステップのプロトコルは、一次上皮培養を構成する個々の細胞および細胞タイプのカルシウムの将来的研究を可能にします。

概要

細胞内カルシウム動員の変化は、遺伝子発現の変化や自然免疫応答の調節など、多様な細胞過程を決定します^1,2。細胞内カルシウムレベルは、小胞体やミトコン^{ドリア1,2,3}などの細胞内カルシウム貯蔵からの放出によって変化します。細胞外カルシウムの細胞内移動は、受動的および能動的輸送の両方を通じて細胞質カルシウムを変化させることができます^。カルシウム移動の生細胞イメージングは主に細胞内染料または遺伝子コードされた染料GCaMP(Green Calcium-activated Multimer/^Protein)4によってアッセイされます。文献でよく見られているのは、色素が細胞膜^5,6,7,8を貫通できるAM(アセトキシメチル)共役染料です。細胞内に入った後、AM半は内因性の細胞内エステラーゼによって切断され、染料は負の電荷を帯びて細胞質空間⁹に閉じ込められます。この電荷の獲得により、染料は細胞膜に常駐する有機陰イオンチャネルによって排出されます。したがって、有機陰イオン排出トランスポーターの阻害剤であるプロブネシドが添加され、染料の細胞流出を防ぎ最適な細胞質シグナルを保持します^10,11。研究では、比例系染料であるFura-2 AMと強度系染料であるFluo-4AMを用いて、単分子層で培養された安定した細胞株のカルシウムシグナル伝達をアッセイしています。本研究は、最近開発された強度計量カルシウム染料Cal-520 AMを用いて、空気-液体界面で培養した多層培養のエピフル蛍光イメージングに適応したプロトコルを用いています。Cal-520 AMはFluo-4 AMよりも感度が向上しています。したがって、複雑な一次上皮培養から微小なシグナルを単細胞分解能で強固に可視化するのに適しています。現在の文献には、安定した細胞株からのバルク応答の生カルシウムイメージングが豊富にあります。しかし、現在では、生体内では組織が多様な細胞構造を構成し、組織恒常性を維持するために異なる細胞型特異的役割を担うことが一般的に^{知られています。}このような一般的な知識にもかかわらず、異なる細胞タイプがカルシウム信号を調整し、カルシウムイオン恒常性を調節するメカニズムは依然として解明されていません。したがって、ここで提示された方法は単細胞によるカルシウムシグナルの検出を可能にし、一次気道組織における下流解析のスループットを向上させることを目指します。

我々は、これまでに発表され厳密に検証されたヒト鼻上皮の一次上皮培養モデルを活用し、より生物学的に関連性の高いモデルで生細胞・細胞質カルシウムをイメージングするツールとして活用しています(16,17,18)。簡単に言えば、上皮細胞は患者の鼻ブラシから分離され、半透膜のトランスウェル上で培養されます。トランスウェルは培養ウェル内に懸濁され、空気-液体界面(ALI)を維持します。この界面と特殊培地の組み合わせは、異なる細胞タイプ^16,17,18の存在に対して直交技術を用いて厳密に検証されています。さらに、現在の方法は一次鼻腔培養と同様の方法で培養される一次気管支培養にも応用可能であることが示されています¹⁹。

本記事では、これらの一次気道上皮培養において、単一細胞分解能で生カルシウムシグナル伝達を測定・解析するための適応型方法を紹介します。これらの多層培養は顕微鏡では視覚化が困難です。しかし、現在の構成により、多層培養内の単層に確実に注目でき、これらの特定の層からのカルシウム動員を検出できます。この構成にはいくつかの利点があり、専用顕微鏡を用いない限り、灌流システムは高価で適応が難しいことが多いです。エピ蛍光顕微鏡法が用いられており、共焦点イメージングに比べて時間的解像度が向上しています。発光ダイオード(LED)の使用により、レーザーベースの共焦点システムに比べて光毒性を最小限に抑えます。ここで示すプロトコルでは、細胞集団全体でカルシウムの急速かつ相対的な変化を可能にする外在強度染料が使用されており、ほとんどの蛍光顕微鏡装置と互換性があります。これは、多くの顕微鏡では利用できない深紫外線(UV)励起を必要とする一般的な比率染料よりも有利です。さらに、GCaMPはトランスフェクションまたはトランスデュクションを必要とし、特定の細胞タイプでより標的を絞ったカルシウムイメージング技術を強化します。一次上皮培養ではトランスダクションおよびトランスフェクション効率が低いため、この技術は細胞集団全体のモニタリングには適していません。

さらに、この研究では、生きた核染色に基づく単一細胞セグメンテーションを可能にする新奇で専門的な機械学習ソフトウェアも開発されました。ソフトウェアは各細胞の蛍光強度値を時間経過とともに記録することができます。当初は安定上皮細胞株(Calu-3)を方法最適化に用いていました。その後、これらの手法は一次上皮培養における単細胞カルシウム動員の研究に応用されました。カルシウム染料およびプロブネシドの濃度、インキュベーションステップのタイミング、画像診断セットアップなどの変数が最適化されました。ここでは、カルシウムシグナルを0.2fps(フレーム毎秒)のフレームレートで記録し、カルシウムシグナルのモニタリングに適しています。より速いカルシウム過渡期を測定するためにフレームレートを上げ^{ることができます。}その後、最適な変数を適用し、より複雑な一次鼻腔培養でさらに最適化しました。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. Calu-3細胞の維持と培養

1. Calu-3細胞をEMEM培養培地に20%のFBSと1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補足して保持します。培地を予温めて交互に交換してください(フラスコ5mL)。
2. フラスコ内の細胞が70%の濃度に達したら、フラスコ内の培地を吸引します。
3. フラスコを5mLのリン酸塩緩衝生息塩水(PBS)1倍で洗います。
4. トリプルLE1mLを細胞に直接37°C、5%_CO2で10〜15分間添加します。すべての細胞がフラスコの底から離れ、単一細胞の懸濁液に解離されていることを確認してください。
5. 反応を4mLの新鮮培地で中和し(ステップ1.1)、その後血清学的ピペットで細胞をよく混ぜて均一なシードを確保します。
6. セルを96ウェルプレートに90%〜100%のコンフルレンス(約40,000セル/ウェル)でプレートします。
   1. シードウェルには、ウェルごとに200 μLのよく混合された細胞懸濁液を加えます。
   2. セルが96ウェルプレートに一晩密着するのを待ちます。
7. 実験準備が整うまで毎日培地を交換します(200 μL/Well)。
8. 井戸内でのコンフューレンシーから2〜5日を経て実験を開始し、分化を促すために実験を始めましょう。

2. Cal 520 AMまたはFluo-4 AMをCalu-3細胞にロードするプロトコル

注意:フルオ4 AMとCal-520 AMはDMSOに溶解しており、これは有害とみなされています。プロベネシドは急性の危険性に指定されています。化学物質を扱う際は、皮膚との接触を避けるため手袋と白衣を着用してください。すべての化学物質は指定された化学廃棄物箱に処分してください。

1. 実験当日には、予温カルシウムバッファー(140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl_2、 10 mM Hepes、pH 7.38(NaOH) 291 mOsmに調整)でピペッティングし、200 μL/ウェルでピペットしてセルを2回洗浄し、死んだ細胞を除去します。
2. 3μMのCal-520 AM、2.5mMのプロブネシド、1:5000ホースト核染色のカクテルをカルシウムバッファー(ステップ2.1)で200 μL/ウェルで、37°Cで5%_CO2を設定したインキュベーターで1時間培養します。
   1. Fluo-4 AM実験では、3μMのFluo-4 AM、2.5mMプロブネシド、1:5000ホエスト核染色をカルシウムバッファー(ステップ2.1)でカクテルした200μL/ウェルで、37°C、5%_CO2で1時間インキュベートします。
      注意:染料のチューブはアルミホイルで覆い、暗闇の中に置いてください。
3. 培養中はカルシウムバッファーでタプシガルギンを準備します(ステップ2.1)。中間のストック濃度を調整し、井戸内の適切な最終濃度を確保します。
   注:ここでは、50μLの薬剤を既存のカルシウムバッファー100μLに加えます。そのため、6μMの中間ストック3本が準備されました。
4. 1時間後にピペッティングで染料を吸引し、カルシウムバッファーで細胞外染料を2回(200 μL/ウェル)洗い流します(ステップ2.1)。
5. 洗浄後、カルシウムバッファーで希釈した2.5 mMプロベネシドを100 μL/ウェルに加え(ステップ2.1)、細胞質空間に染料を保持します。
6. 皿をアルミホイルで包んで光から守ります。細胞はこれで画像化の準備が整いました。

3. Calu-3安定細胞株の顕微鏡設定

1. SuperFluor対物レンズを備えたエピフルオレッセンス顕微鏡、安定した固体光源、CMOS蛍光カメラ(6.5μmピクセルサイズ)を用いて使用しました。照明強度は500mWに設定されています。
2. 96ウェルのプレートアダプターを使ってセルのプレートをステージに置きます。ブライトフィールドを使い、低倍率でセル層にピントを合わせてセルの単層を探します(5倍から10倍の空気対物レンズを使用)。
   注意:このステップは任意ですが、細胞層に効率的に集中させるのに役立ちます。
3. セル層が特定されたら、ブライトフィールドを使い、より高い倍率(空気対物レンズ20倍)に切り替えてセル層に再び焦点を合わせます。
   注意:ブライトフィールドでは単層に適切な焦点を合わせること;細胞の境界は明確であるべきです。
4. GFP(475nm LED)を使ってカルシウム染料信号を特定します。LEDの出力が5%〜10%の間で低下し、光漂白を防ぐために、露出時間は信号が過剰に飽和しない範囲で基準グリーン信号を可視化できるよう、通常300〜500msの範囲にしてください。
   注:再現性と均一な染料負荷を確保するために、細胞層を定性的に解析してください。ほとんどのセルは同じ明るさを示すはずです。刺激剤を加える前に強い蛍光を発する死んだ細胞が少ない視野に注目してください。相対的なベースライン蛍光強度はフィジー(ステップ7.9)を用いて測定できます。染料が均等に積み込まれている場合(ステップ7.9)、細胞間のベースライン蛍光変動は約10%〜15%であるべきです。
5. DAPI(405 nm)LEDを使ってホエクスト核染色を特定します。LEDの出力は2%〜5%で、露光時間は50〜100msの間でした。
   注意:細胞がピントが合っていれば、核は鮮明な輪郭で現れます。核信号が飽和状態にならないように注意してください。核は緑色のチャネルに干渉することがあります。

4. ライブカルシウムビデオの取得

1. 5秒ごとに1フレーム(0.2fps)の間隔で10分間ライブ動画を開始します。
   注意:各フレームで各蛍光チャンネル(DAPI 405 nm、GFP 475 nm)をキャプチャしてください。
2. ビデオが始まったら、作動薬を追加する前に5分間の基準値を設けてください。
3. P200ピペットを用いて、中間ストック3倍のストップにタプシガルギン50μLを、カルシウムバッファー中の2.5 mMプロベネシド100 μLを含むウェルに添加します(ステップ2.1)。薬剤が均等に分散するように、井戸内で1〜2回優しく再懸浮させてください。タプシガルギンを加えた後、5分間続きをお読みください。
   注:薬剤添加のステップは非常に重要です。ピペットの先端がプレートに接触して焦点面をずらしてはいけません。代わりに、ピペットの先端を浮かせて、ウェル内のバッファーにだけ接触させます。薬物が過剰に混ざると、細胞がプレートから離れて信号に干渉することがあります。
   注意:薬物が下流分析のために追加される枠を必ず確認してください。
4. 実験前に撮影した動画とスナップショットを保存してください。データ分析に進みましょう。

5. 一次気道セルにCal 520 AMまたはFluo-4 AMを装填するプロトコル

1. 実験当日、トランスウェルから基底外側培地を取り出し、750μLの基外側と300μLのカルシウムバッファーの基底外側を2回洗浄します(ステップ2.1)。
2. 細胞を600μLのCal-520 AMまたはFluo-4 AM染料の基底側染料と200μLの頂端染料で37°C、5%_CO2で1時間培養します。Calu-3細胞と同様に、Cal-520 AM、3 μM Cal-520 AM、2.5 mM プロブネシド、1:5000 Hoechstをカルシウムバッファーで準備します(ステップ2.1)。同じカルシウムバッファーで、Fluo-4 AMの3μMフルーク、2.5mMのプローネシド、1:5000ホエストに対して、
3. 孵化期間中は、3×中間ストックでタプシガルギンを準備し、最終濃度2μM(中間ストック6μM)にします。
4. その後、染料を吸引し、細胞をカルシウムを含む300μLの頂端バッファーと750μLの基底外側バッファーで2回洗浄します(ステップ2.1)。
5. 洗浄後、カルシウムバッファー中に2.5 mMプロベネシドの頂端100 μLと基底外側500 μLを加えます(ステップ2.1)。
6. トランスミッションをプレート内にしっかり収め、プレートをホイルで包みます。細胞はこれで画像検査の準備が整いました。

6. 一次鼻挿入物の顕微鏡検査の設置

1. 画像撮影に適したガラス底のペトリ皿、ピンセット、薄いマスキングテープを用意しましょう。ペトリ皿を70%エタノールで素早く拭き、完全に乾かして清潔に保ちましょう。
2. ガラス底のペトリ皿をエピフルロセンス顕微鏡用の小さな円形アダプターに入れます。
3. ピンセットを使い、インサートをガラス底の皿の中央に慎重に置きます。
   注意:バッファーはインサートの頂端区画に置かれているため、こぼさないように注意してください。
4. 薬剤を加える際にインサートが動かないように、マスキングテープでプラスチックの上部をガラス底の皿の側面に固定します。
5. インサートを取り付けたアダプターを顕微鏡のステージに取り付け、まず10倍の空気明視野対物レンズを使って細胞に焦点を合わせます。
6. GFP(475nm LED)を使ってカルシウム染料信号を識別します。LEDの出力が5%〜10%の範囲に落ちて光漂白を防ぎ、露出時間も過剰飽和せずに基準グリーン信号を可視化できる範囲(通常300〜500ms)にしてください。
   注意:適切なカルシウム染料の投与を確認するために、ステップ3.4の注意事項をご参照ください。
7. DAPI(405 nm)LEDを使ってホエクスト核染色を特定します。LEDの出力は2%〜5%で、露光時間は50〜100msの間でした。
   注:細胞がピントを合わせていれば、核は明確で明確な輪郭で現れます。細胞の最も先端の層に注目してください。顕微鏡のz軸を調整して、細胞が鮮明に焦点を合わせた最高焦点面を特定します。核が信号の飽和状態に達しないように注意してください。核信号は緑色のチャネルに干渉することがあります。
8. ライブカルシウムビデオを入手するには、手順5.1-5.4に従ってください。薬剤添加の段階では、インサートの中央に添加し、P200ピペットを使ってゆっくりと再懸濁します。
   注意:薬物が下流分析のために追加される枠を必ず確認してください。

7. フィジーソフトウェアを用いた分析

1. フィジーアプリを開き、「 ファイル→開く」を選択し、動画ファイルをアップロードし、ポップアップウィンドウでデフォルトの設定を保持してください。
2. 希望すれば、 画像 \ 調整 \ 明るさ/コントラストの「画像」で、それぞれの蛍光チャネルの明るさとコントラストを調整して、細胞の最適な視像を得ることができます。
3. セルトレースを容易にするために、核染色や明視野チャンネルを画像 \ カラー \ マージチャンネルでマージし、ポップアップで各チャンネルごとに適切なファイルを選択します。
4. 細胞境界や核染みに基づいて特定の細胞を追跡するには 、Analyze \ Tools \ ROI Manager を使い、ポップアップで「全て表示」とラベルの両方にチェックを入れてください。
5. フリーハンド選択ツールでセルを慎重になぞり、Tボタンを押してセルを追加します。
   注意:セルは4隅すべてと動画の中央にトレースされていることを確認してください。
6. すべてのセルが正確にトレースされたら、すべてのROIが記載された開いたタブで「 More \ Multi Measure」をクリックし、ポップアップで OK を押してください。
7. 結果として表示されるポップアップのシート全体をExcel ファイルにコピー してください。
   注:結果として得られたシートには、各ROIごとに6つの小見出し(Area1、Mean1、Min1、Max1、IntDen1、RawIntDen1)が付けられ、それぞれの後に数値が付けられます。これはトレースされたセルに対応しています。下流分析で重要な値は各ROIの平均値です。
8. 蛍光強度の変動を監視するために、各細胞のベースライン時の平均蛍光を計算し、パーセント分散を算出します。実験の分散は通常20%〜30%の範囲です。
   
9. すべての測定値を、追跡する各セルの平均強度値を基準線の最初の読み取り値で割って正規化します。
10. 秒単位の 時間 用の追加の列を作成し、最初のフレームはフレーム0に対応し、その後のタイムポイントは0.2fps間隔に対応する5分ずつ増加します。
11. データを分析およびグラフ作成ソフトにコピーし、ベースライン上での蛍光変化曲線を時間とともに生成します。
    注意:単一セルの最大プロットを作成するには、Excelの=MAX()関数を使って各セルで最大蛍光強度に達するフレームを見つけ、GraphPad Prismを用いてプロットしてください。

8. カルシウムスイートを用いた解析

結果

生細胞内のカルシウム動員を測定するために、Calu-3細胞または分化した一次鼻培養を細胞内染料と共に培養します。カルシウム依存性信号の相対的な変化は、細胞内カルシウム貯蔵または細胞外空間から細胞質へのカルシウムの移動増加として測定されます。細胞質へのカルシウムの持続的な増加は、ERに常在するSERCA(サルコ/小胞体カルシウムATPase)タンパク質の不可逆的阻害剤であるタプシガルギン^{が添加された}後に蛍光の増加によって表されます。ここでは、カルシウムアッセイがCalu-3安定細胞株および一次気道鼻腔培養の両方で堅実に機能することが示されています。

顕微鏡を用いたアッセイを用いることで、個々の細胞からの反応に集中できます。細胞質蛍光カルシウム染料に基づいて細胞を手動でトレースし、Hoechstの生核染色の存在によって確認されました(図1A、補足図1)。Fluo-4 AMまたはC...

ディスカッション

本論文では、生の一次鼻および気管支培養、ならびに安定した上皮細胞株における単細胞カルシウムシグナル伝達の解析方法を紹介しています。Cal-520 AMとFluo-4 AMのカルシウムリポーターは、どちらのセットアップでも有用なカルシウム指標です。Cal-520 AMは、Fluo-4 AMの0.16に対し量子収率が0.75と高く、カルシウムへの親和性もやや高いため、感度が高くなります(Cal-520 AMのKdは320 nM、Fluo-4 AMは345 nMです)。さらに、Cal-520 AMはFluo-4 AM²²と比べて細胞保持率の向上が報告されています。しかし、両色素はタプシガルギン介質カルシウム放出の現在の研究では良好に機能しました^22,23。

この生物学的モデルは、ヒト組織から培養された一次上皮細胞を利用する点で独特です。現在の培養法における分...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	サーモフィッシャー	142475
24井トランスウェル挿入部およびnbsp;	コーニング	CLS3470-48EA
96ウェルのフラットクリアボトム黒ポリスチレンTC処理マイクロプレート	コーニング	3603
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130	分割され、-20度で保存;CはDMSOに溶解しています
カルシウムスイートソフトウェア	コードは当研究所グループにお問い合わせください
EMEM、1回	Wisent	320-005-CL	保存温度は4&デグ;注記;
胎児用牛血清	Wisent	080-450	分割され、-20度で保存;C
フルオ4 AM	AAT Bioquest	20550	分割され、-20度で保存;CはDMSOに溶解しています
ヘペス	バイオショップ	HEP001.5	室温で保存
ホエクスト	サーモフィッシャー	H3570	保存温度は4&デグ;注記;
ヒト上皮大腸肛門腺癌細胞株	ATCC	HTB-55
塩化マグネシウム	シグマ	7786-30-3	室温で保存
マイクロディッシュ35mm、低ガラス底	Ibidi	80137	常温で保存し、nbsp;
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液	Wisent	450-200-EL	保存温度は4&デグ;C
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Wisent	3111-010-CL	常温で保存し、nbsp;
塩化カリウム	シグマ	7447-40-7	常温で保存し、nbsp;
プロベネシッド	サーモフィッシャー	P36400	分割され、-20度で保存;C、水溶性
塩化ナトリウム	バイオショップ	SOD004	常温で保存し、nbsp;
タプシガルギン	サーモフィッシャー	T7458	分割され、-20度で保存;CはDMSOに溶解し、nbsp;
TripLEエクスプレス酵素(1X)、フェノールレッド	サーモフィッシャー	12605010	保存温度は4&デグ;C