がん細胞に対する初期免疫活性評価のための新生児静脈内移植モデル

サマリー

このプロトコルは、新生児マウスへの小児がん細胞の静脈内投与における側頭静脈注射を実証し、がんに対する初期免疫応答の正確かつ再現可能なモデル化を可能にします。この方法は、免疫調節や治療などの介入を新生児期に適用した場合の効果を評価することを可能にします。

要約

小児がんの半数以上は子宮内で発症し、新生児期を通じて明らかな疾患への進行が続きます。免疫療法は多くのがん患者に新たな治療法を提供していますが、早期免疫ががんの進行や治療反応にどのように影響するかはまだ完全には解明されていません。このギャップを解消するには、免疫応答が後期の子ども期や成人期とは根本的に異なる新生児期における治療的介入の評価が必要です。

ここでは、生物発光型in vivo画像診断と統合した新生児移植モデルを説明し、幼児期の免疫調節が小児がんに与える影響を調査します。

子宮内開始がんから由来するルシフェラーゼ標識細胞の側頭静脈注射は、生後1〜2日の合成受容者において再現可能な腫瘍移植を実現し、手技関連死亡率がなく、生物発光イメージングで高い手術成功率を得ました。感染駆動の免疫調節を実験変数として用いると、移植後5日目のマウス細胞巨型ウイルスによる腹膜内感染は急性リンパ芽球性白血病(ALL)の負担を著しく減少させることを示しましたが、神経芽腫(NB)は減少しませんでした。このプラットフォームは、がん特異的な早期免疫調節反応の違いの研究を可能にし、初期の免疫とがんの相互作用をモデル化する際に腫瘍の文脈の重要性を強調しています。

この手法は、がん免疫監視、感染駆動型免疫調節、治療的介入に関連する新生児免疫機構を検証するための多様で再現性の高いプラットフォームを提供します。ALLおよびNBを超えて、このアプローチは追加の小児悪性腫瘍や免疫調節戦略にも適応でき、初期がん介入の機構的研究や前臨床評価を支援します。

概要

免疫療法の最近の進歩により、特定のがん患者の治療結果は著しく向上しましたが、幼児に最適に適用するには、発達中の免疫システムがどのようにがん細胞を特定し排除するかを十分に理解する必要があります。小児がんの約50%は子宮内に発生しており、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)やNBを含むが、増え続ける証拠は出生後の出来事が疾患の進行や^臨床転帰に重要な影響を与えることを示唆している^1,2。

新生児の免疫応答は成人と量的・質的に異なります。³.完全に発達した適応免疫がない場合、新生児の保護は母体抗体と自然免疫細胞に大きく依存します。しかし、これらの生得効果因子は細胞内反応性の低下と免疫抑制経路の活性化の強化により、成体エフェクターに比べて機能的に効率が劣り、新生児は特に感染にかかりやすい^4,5,6。しかし、これらの特性が未成熟な免疫系が効果的な抗がん応答を発動する能力に与える影響は、依然として十分に解明されていません。

早期の抗がん免疫のモデル化には、免疫機能が制限される短い出生後ウィンドウ内に、がん細胞や免疫調節因子、病原体を正確かつ再現可能に送達する必要があります。側頭静脈注射は、これらの要件を最もよく満たす新生児静脈内(IV)投与法であり、高い手技成功率、低い死亡率、最小限の取り扱い負荷、そして感染挑戦や治療的投与などの連続的介入との適合性^{を提供します。}

本研究では、既に検証済みの新生児静脈内投与技術と生体発光インビクターイメージングの多様性を基に、幼児がん細胞の進行に対する早期感染の影響を研究する移植モデルを記述しました。このアプローチにより、ルシフェラーゼ標識されたB-ALLまたはNB細胞を生後1〜2日目の子犬に静脈内投与し、出生後7日目(P7)にマウスサイトメガロウイルス(mCMV)の腹膜内投与による免疫調節が可能となります。がん進行は感染後10日後に評価されました(P17)。

側頭静脈へのアクセスは出生後の限られた時間帯(P0–P3)に限定されますが、この手法は再現性と実験的コントロールを高め、早期免疫機構ががん免疫監視、感染・がん相互作用、免疫療法への応答に与える影響を調査するための多様なプラットフォームを提供します。さらに、このアプローチは移植細胞の効率的なホーミングを支援し、メカニズム的調査のための病気モデルの再現性確立を可能にします。

プロトコル

すべての処置(図1)はカナダ動物ケア協議会のガイドラインに従って実施され、ブリティッシュコロンビア大学動物ケア委員会(プロトコルA23-0169)によって承認されました。

1. ルシフェラーゼ標識白血病細胞の生成

1. 白血病性Eμ-Retマウスからの白血病細胞の単離
   1. 1Lの誘導チャンバーで5%イソフルランと1L・^min-1 酸素を投与し、深い手術面(正しい反射の喪失とゆっくりとした規則的な呼吸)が得られるまで麻酔します。
   2. 深麻が確認されたら、イソフルランを中止し、動物をチャンバー間で移動させずに高流量(標準の徐進置換速度の3〜4倍、例:10Lのチャンバーで6〜8L·min)で二酸化炭素(CO₂)を投与します。呼吸停止後少なくとも5分間CO₂曝露を維持し、死を確実にしてください。
   3. 廃ガスを排気し、回収してからチャンバーを開けましょう。
   4. 心拍と呼吸の欠如による死亡を確認し、その後、施設の規定に従い副次的な身体的手段として子宮頸部脱臼を実施します。
   5. 死骸をバイオセーフティキャビネットに移し、死亡を再確認し、性別と体重を記録し、外側に70%エタノールを散布します。
   6. 腹部の中央に切開し、皮膚と腹膜壁を反射させ、脾臓を5mLの無菌PBSに切除します。
   7. 両脚の脛骨と大腿骨を剥離し、余分な組織を除去し、脾臓を無菌状態で切除します。直ちに脾臓を5mLの無菌・氷冷のリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)溶液に移し、細胞の生存能力を保ちます。
   8. 脾臓を処理してください。
      1. 脾臓組織を1×赤血球(RBC)溶解緩衝液1 mLで均質化します(脾臓には2 mL>200 mg使用)。室温で2〜3分間培養します。
      2. 溶解は10 mL PBS+2%胎児用牛血清(FBS)(FACSバッファー)を加え、40 μmのストレーナーでろ過し、350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
      3. 脾臓ペレットを5mLのFACSバッファーに再懸浮させます。
   9. 骨髄を処理します。
      1. 両骨幹を切除し、1mLのFACSバッファーで1mLのFACSバッファーを15mLのチューブに挿入し、29ゲージ針を装着します。
      2. 細胞懸浮液を遠心分離し、上清液を捨てて細胞を1×赤血球溶解バッファー1 mLに再懸浮させ、RTで2分間インキュベート、10 mLのFACSバッファーを加えてクエンチ溶解を行い、40 μmのストレーナーでろ過し、350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
      3. 上澄液を捨て、BMペレットを上下ピペットで1 mL FACSバッファーに再懸濁させます。
      4. 必要に応じて40μmのストレーナーで優しく渦を流し、ろ過します。
      5. 200 μLの細胞培養培地(例:Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM))に0.5 × 10^6の白血病細胞を再懸濁し、20%のFBSおよびインターロイキン7(IL-7;250 pg·^mL-1)を補足します。
         一時停止:細胞の懸濁液を最大2時間氷上に置いてから染色してください。
2. 白血病細胞のレンチウイルス伝達:
   1. 種子マウス骨髄由来の間質細胞を、24ウェルプレートの1×10^5細胞に置き、24ウェルプレートの24時間前に、付着を促し70–80%のコンフルエンシーを達成する。
   2. 非組織培養液で処理済み24ウェルプレートで白血病細胞(最終体積200μLの0.5 ×10^6個)をプレート化します。
   3. 自己不活化(SIN)レンチウイルスベクターを添加し、クリックビートルレッド(CBR)ルシフェラーゼと強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)からなる二重融合レポーターをコードし、構成的ユビキチンプロモーターによって駆動されます。感染の多数(MOI)は10–20、ウイルス価は≥ 1 × 10^8 TU·^mL-1 (トランスデューシング単位/ミリリットル)、最終トランスデューション容積200 μLにポリブレン(8 μg·^mL-1;シグマ、H9268-5G)。
      注意:ポリブレンは高濃度で細胞毒性があります。8μg·^mL-1を超えないようにしてください。レンチウイルスはバイオセーフティレベル2(BSL-2)の封じ込めで取り扱います。
   4. プレートをパラフィルムで密封し、遠心分離機で1,200×gの室温( RT)で20分間保存します。
   5. スピノキュレーション後、トランスデューションされた白血病細胞を間質単層に移し、37°Cで24時間培養し、DMEM中に5%のCO₂+20%FBS+IL-7(250 pg·^mL-1)を投与して細胞生存とレポーター発現を支援します。
      注意:必要に応じて抗生物質は24時間後に追加可能ですが、ウイルス導入中は避けるべきです。
   6. 24時間後、非接着性白血病細胞を採取し、滅菌リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)350 × g で4°Cで20分間20分間洗浄し、 残留ウイルスとポリブレーンを除去します。
   7. 移植のために無菌PBS中に10^7細胞・^mL-1 ×で再懸浮させます。
      一時停止点:洗浄後、必要に応じて移植の48時間前まで同じ培養状態を維持できます。
3. 成体のNSG(NOD.Cg-Prkdc^{scid Il2rg tm1Wjl}/SzJ)マウスへの移植
   1. 4〜6週間齢のNSGマウスを受令官として使います。
   2. マウスを5分間温め、ウォーミングパッドやヒートランプを使って尾の血管を拡張させます。
   3. アクリル製拘束具でマウスを拘束します。
   4. 100μLの無菌PBSに100μL×10^6細胞を29ゲージインスリン注射器を外側尾静脈から注入します。麻酔は不要(機関のガイドラインで義務付けられている場合を除く)
   5. 出血を防ぐために注射部位に優しく圧力をかけてください。
      注意:漏出を避けてください。静脈注射が成功した場合、目に見える腫れはありません。
   6. マウスの病気の発生を週に2回監視してください。
4. GFP⁺ 白血病細胞の選別
   1. 病気が発症したら、白血病性NSGマウスから糞便または脾臓を採取してください。
   2. 上記のように単一セル懸濁液を準備します。
   3. 生存性染料(7-AAD)を用いた染色細胞。
   4. GFP+白血病細胞の選別には蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてください。
   5. 選別には高速細胞ソーターを使用し、前方散乱(FSC)対側散乱(SSC)のゲート戦略を用い、破片を除外→FSC-A対FSC-H、特定のシングルレット→、生存性染料陰性→選択生細胞、GFP+ゲート→報告者陽性白血病細胞を分離するというゲーティング戦略を用います。
   6. 選別された細胞をDMEM+20%FBSを含むチューブに採取します。選別後の標的純度:≥95%のGFP+細胞。
      一時停止: 選別された細胞は冷凍保存の2時間前まで氷に保管されることがあります。
5. 選別細胞の凍結保存
   1. 選別済み細胞を5×10^6細胞/mLで再懸浮し、90%FBSおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む冷凍培地に浸します。
   2. 1クライオビル1mLを別に分け、バイアルをイソプロパノール系の冷凍容器に入れて−80°Cで一晩(12〜18時間)保存します。
   3. バイアルを液体窒素(LN₂)に移して長期保存します。
      注意:DMSOは有毒で皮膚を通じて容易に吸収されます。手袋をして素早く取り組んでください。
      一時停止点:細胞は新生児移植実験で使用するまで液体窒素に長期保存されることがあります。

2. ルシフェラーゼ標識NB細胞の生成

注:TH-MYCNトランスジェニックマウスは自然発生性NB腫瘍を発症し、承認された施設動物ケアプロトコルの下で管理されています。使用されるレンチウイルスベクターは、セクション1.2で説明されているものと同じです。

1. 腫瘍収穫と組織解離
   1. 承認された動物ケアガイドラインに従い、腫瘍を持つTH-MYCNマウスの安楽死を行います。
   2. 皮下または腹部のNB腫瘍を無菌条件下で採取します。
   3. 腫瘍組織を計量し、滅菌ハサミで約1〜2mmの断片に刻みます。
   4. 組織を15mL円錐形チューブ内の15mL円錐形チューブに組織を移し、DMEM、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I;50–100 U·^mL-1)、およびコラーゲン酵素ベース酵素ブレンド(最終濃度10 μg·^mL-1 )から構成します。
   5. 37°Cで150rpmの振動インキュベーターで30分間孵化させます。
      注意:酵素性消化試薬は皮膚や目の刺激を引き起こす可能性があります。手袋と目の保護具を着用してください。
   6. 消化後は、組織をさらに解離するために優しくピペットを上下に動かします。70μmのセルストレーナーを通して新しいチューブに懸濁液を流します。
   7. 300 × g で室温(20–22°C)で5分間遠心分離機にします。
   8. 上清液を廃棄し、10%FBSを補足したDMEMで再懸濁ペレットを投与します。
   9. 前述の第1.1節で説明した通り、RBS溶解バッファーを使用して赤血球溶解を行います。
   10. 300 × g で遠心分離機で5分間過ごし、10 mLの高グルコースDMEMに10% FBSおよび50 μM 2-メルカプトエタノールを補足して再懸浮させます。
       注意:2-メルカプトエタノールは有毒で揮発性があります。化学ファンムフードでの取り扱いを行います。
       一時停止点:細胞は最大1時間氷に保管してからトランスダクションを行うことができます。
2. レンチウイルストランスダクション
   1. ペレット2×10^6 NB細胞を300 × gで5分間投与し、上清液を完全に除去します。
   2. 細胞ペレットを14μL濃縮レンチウイルスベクターに直接再懸濁します(1.2節で説明したベクターと同じです;ウイルス価≥1 × 10^8 TU·mL-1、おおよそMOI: 10–20)。
   3. 細胞-ウイルス混合物を37°Cで加湿インキュベーター(CO₂濃度)で5分間培養します。
   4. 200μLの高グルコースDMEM+10%FBSを加え、37°C、5%CO₂で2時間の培養を続けます。
      注意:レンチバイラルベクターはBSL 2の条件下で取り扱う必要があります。
   5. 残留ウイルスを除去するために高グルコースDMEMで4回の細胞を洗浄します。
   6. トリパンブルー排除を用いて生存可能な細胞を数えます。
      重要:早期ゲル化を防ぐため、マトリックス準備は常に氷の上に保管してください。
3. NSGマウスへの皮下移植
   1. 細胞を100μLあたり5個×10^6個の細胞を冷地下膜マトリックス(成長因子還元細胞外マトリックス)で再懸浮させます。
   2. 6〜8週間のNSGマウス(セクション1.1参照)には、吸入したイソフルラン(酸素中2〜3%)を用いて麻酔します。
   3. ロードセルとマトリックスの混合物を、27ゲージの針を装着した事前冷却された1 mLシリンジに注入します。
   4. 100μLの総容量で10^6細胞×5個を皮下側腹部に注入します。
   5. 麻酔から完全に回復するまでマウスを監視してください。
      注意:マトリックスと混ぜ直後、注射器内で固化を防ぐためにすぐに注射してください。
   6. 腫瘍を直径~1cmまで成長させてください。
4. セルソート
   1. 腫瘍を採取し、セクション2.1–2.2に記載されたように単細胞懸濁液を生成します。
   2. GFP発現に基づくFACSによるルシフェラーゼ標的細胞の濃縮(ゲーティング戦略)を第1.4節で説明しています。
   3. 2回連続して選別を行い、95%のGFP正純度≥達成します。
5. 低温保存
   1. セクション1.5に記載されたクリオプロザーブの選別セル。
      一時停止点:細胞は将来の移植実験のために液体窒素に長期保存できます。

3. 側頭静脈注射のための細胞懸濁液の準備

1. ルシフェラーゼ標識された白血病細胞(NB細胞)を37°Cの水浴で急速に解凍し、小さな氷結晶が残るまで続けます。
2. バイアルの外側を70%エタノールで直ちに消毒し、その後、内容物を15mLの円錐形チューブ内の9mLの予温DMEM+10%FBS培地に移します。
3. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を吸引し、ペレットを無菌・氷冷PBSに再懸濁させます。
4. トリパンブルー排除と血液細胞計(または自動細胞計)を用いて生存可能性を判断します。80%の実効性≥サスペンションのみを使いましょう。
5. 細胞懸濁液を40μmのセルストレーナーに通し、塊を除去します。
   注意:細胞塊は注射失敗や組織損傷を増加させます。
6. 1×10^4個の白血病細胞を含む新生児1人あたり20μL(白血病移植用)、または5個×10^4個のNB細胞(NB移植用)を準備するよう濃度を調整します。
7. 細胞懸濁液を氷の上に置き、注射器を装填する前に優しく混ぜて均質を保ちます。
   一時停止:生存率が80%≥であれば、注射前に細胞を最大2時間氷封させてください。

4. 側頭静脈注射(P1–P2子)

注:新生児側頭静脈注射は麻酔なしで行うことができます。しかし、短時間の低体温固定は動きを抑え注射精度を向上させるために一般的に用いられます。低体温固定の使用は一部の施設動物ケア委員会では許可されていません。研究者はこの処置を行う前に関連する機関委員会に相談しなければなりません。所属機関で承認された場合、以下の手順は低体温性固定に効果的です。

1. 滅菌ナプキンを敷いた小さな容器を用意し、氷の上に置いて冷やします。
2. 子犬を置く(出生後1〜2日目;P1–P2)を容器内のナプキンに貼り、低体温性の固定のために2〜3分間、自発的な動きが著しく減少するまで使用します。
   重要:子犬が氷に直接触れないようにしてください(常に容器とナプキンのバリアを使いましょう)。
3. セル懸流液60μLを100μLのガラス注射器に注入し、30ゲージの針を接続します。サスペンションをチューブに戻し、注射器と針の死んだ容量を満たします。デッドボリュームがプライミングされたら、20μLの細胞懸濁液を吸引して注入し、気泡が存在しないことを確認します。白血病細胞とNB細胞の受容体として、それぞれBALB/cとTH-MYCNマウスを使用します。
4. プレキシガラスのプラットフォームの下に冷たい光源を置いてトランスイルミネーションのステージを準備します。
5. 注射部位を観察するために拡大眼鏡(または立体顕微鏡)を着用してください。
6. ステージに中央の穴の開いた無菌ナプキンを置き、子犬を側頭静脈が見えるように位置させます。
7. 注射時に針を安定させるために、子犬の頭の隣に小さなモデリングクレイ(粘土)を置いてください。
8. 針の斜面向上を見える側頭静脈に挿入し、細胞懸濁液をゆっくりと注入しながら血管充填を確認し、静脈内投与の成功を確認します。
9. 注射後は、滅菌綿棒で注射部位に優しく圧力をかけます。子犬を温めた回復面(約37°C、例:タオルバリアを敷いて低温の温熱パッド)に置き、通常の動きとピンク色が戻るまで待ってください。
10. 回復後5〜10分間子犬を観察し、その後ダムに戻します。
    注意:回復中の過熱を避けてください。バリア層を使い、継続的にモニタリングしてください。
11. すぐにPBSで注射器をすすぐ後、注射器用の洗浄液で洗い流し、仕上げに70%エタノールを塗ります。

5. ウイルスの調製と感染

1. BSL-2封じ込めの下で、機関のバイオセーフティおよび動物ケアの承認に従い、マウス細胞巨型ウイルス(mCMV)に関するすべての手技を実施すること。
2. 認証済みクラスII生物学的安全キャビネット内でウイルスストックを取り扱い、指定されたBSL-2手順領域内で動物感染を実施します。
3. ウイルスの調製と取り扱いは、認定クラスIIの生物学的安全キャビネットで行われ、指定されたBSL-2手順エリア内で動物感染を実施します。
4. 実験用コートや使い捨てガウン、手袋、目の保護具など、適切なPPEを着用してください。ウイルスを含むすべての材料(注射器、寝具、ケージ、表面)は感染の可能性があるものとして扱いましょう。
5. 鋭利な武器の使用を最小限に抑え、針は承認された生物災害用の鋭利な容器に即座に廃棄してください。使用後は作業面や機器を除染してください。すべての固体および液体廃棄物は、機関の手続きに従って生物有害廃棄物として処分してください。
6. マウスはP7(白血病細胞移植後5〜6日後)に感染します。
7. ウイルスのアリコートを氷で解凍し、逆回転で優しく混ぜ、調理中は氷のまま保管します。繰り返される凍結・解凍サイクルは避けてください(使い捨てのアリコートを使用)。
8. ps中に2×10^5プラーク形成ユニット(PFU)/mLをmCMVを準備し、30ゲージ針を用いて50 μL PBSの腹腔内(ip.)で1×10^4 PFUを注射します。腹部右下腹部に浅い角度で注射し、腹部の臓器を避けてください。
   注意:mCMVは感染性(BSL-2)です。適切な封じ込めと除染を行ってください。
9. 動物の識別、年齢、実験グループ、ウイルスの投与量、体積、注射の詳細を記録します。

6. 生物発光イメージング(BLI)

注意:以下に記載するように、細胞注射後5〜6日および感染前でP17(感染後10日)にBLIを実施してください。

1. D-ルシフェリンをPBSに10 μg·^μL-1で溶解します。0.22μmのフィルターを用いて殺菌し、光を遮ったまま−20°Cで保存します。
   注意:D-ルシフェリンは光に敏感です。調理や使用時の光曝露を最小限に抑えましょう。
2. 30ゲージの針を使って、1匹あたり50μLのD-ルシフェリンi.p.を注射します。
3. 子犬は酸素(0.8–1.0 L·^min-1)でイソフルラン(誘導3–4%、維持1.5–2%)で麻酔します。体温を温めた画像検査台(約37°C)で維持してください。
   注意:イソフルランは揮発性麻酔薬です。認可された蒸気発生器とスカベンジングシステムを使用してください。
4. 麻酔をかけた子犬を小動物イメージングシステムに入れます(機器の詳細 は材料表に記載)。
5. D-ルシフェリン注射後10分後に一定の露光設定で生物発光およびX線画像を取得します(BLI設定:P7画像は露光時間120秒、P17画像は30秒、P7画像はB4をビニング、視野角(FOV)25、絞り値1.2、物体の高さ1.5、X線設定:解像度高、出力高)を。
   一時停止ポイント:画像処理直後に画像ファイルを保存;分析は後で行うことができます。
6. 適切なBLIイメージングソフトウェアを用いて画像解析を行い、各マウスの全身を含む関心領域(ROI)を定義し、放出光を光子・s⁻¹·cm⁻²·sr⁻¹として定量化します。
7. 定量化されたROI値をエクスポートして、下流の統計分析に利用します。

7. 移植マウスからの白血病細胞の採取

1. セクション1.1に記載されているように白血病細胞を収穫し、単一細胞懸濁液を生成します。

8. フローサイトメトリーの染色および取得

1. カウントセルと遠心分離機を300× g で4°Cで5分間懸浮液で使用し、FACSバッファー内で1×10^7細胞・^mL-1 で再懸浮します。
2. 100μL(10^6細胞1×)をポリスチレンフローサイトメトリーチューブに移します。
3. Fc受容体遮断抗体(抗CD16/32、1本1μL)を加え、室温で5分間インキュベートします。
4. 抗体マスターミックスをFACSバッファーに準備し、各チューブにCD19-FITC、BP1-PE、B220-APC、および系統陰性マーカー(TER119-PerCP、CD3-PerCP、CD11b-PerCP)を100μL FACSバッファー内の1×10^6細胞あたり1μLの抗体を追加します。
5. 暗闇の室温で20分間孵育します。
6. 5 mLのFACSバッファーで洗浄し、遠心分離機で洗浄し、7-AAD(3 μL)を含む200 μL FACSバッファーに再懸浮し、カウントビーズ(6 μL; 6,000ビーズ)を含みます。
7. 抗体キャプチャビーズや細胞を用いて単一染色補償対照を準備し、実験サンプルとともにコントロールを取得します。
8. 標準的なFITC/PE/APC/PerCP検出器設定と中流量でフローサイトメーターでサンプルを取得します。イベントを1,000ビーズ獲得まで収集します。
9. FCSファイルをエクスポートし、フローサイトメトリー解析ソフトウェア( 材料表に記載)を用いて、確立されたゲーティング戦略(図2D)を用いて解析します。
10. 計数ビーズを用いて、1,000ビーズで獲得したターゲットイベントの数にスケーリングファクター6(6,000ビーズ加算)を掛け、染色された細胞の割合(×10^6細胞)に基づいて全臓器細胞数に正規化し、計数ビーズを用いて計数ビーズを計算します。

9. グラフのプロットと統計解析

注意:BLIおよびフローサイトメトリーデータのグラフ生成および統計解析は、統計ソフトウェアパッケージ(材料表に記載)を使用して行ってください。

1. 平均±標準誤差(SEM)としてデータを提示します。
   注:本研究から除外された動物はいません。
2. BLIについては、P7およびP17でPBS群とmCMV群を別々に比較し、非ペアのMann–Whitney検定を用い、Holm–Šídák補正を適用して複数の比較を比較します。
3. 両側の非ペアリングMann–Whitney検定を用いてフローサイトメトリーの結果を解析します。
4. 統計的有意性をp < 0.05と定義します。

結果

側頭静脈注射により、新生児に白血病および神経芽腫細胞の効率的な移植が可能になります
幼児がん進行に対する早期感染の影響をモデル化するために、白血病性成体Eμ-Retマウス由来のルシフェラーゼ標識B-ALL細胞や、瀕死状態のTh-Mycnマウス由来のNB細胞を側頭静脈を通じて生後1〜2日の同遺伝子子犬に静脈内投与しました。移植後5日後にBLIおよびX線画像を用いて白血病(図2A、n = 7)およびNB(図3A、n = 9)の移植成功が確認され、側頭静脈注射は処置に伴う死亡率なしで100%の処置成功を達成した。

新生児mCMV感染は白血病の進行を抑制します
着床確認後、新生児の子は生後7日で腹膜内注射によりPBS(n=3)またはmCMV(1×10^4 PFU、n=4)のいずれかを無作為に投与されました。感染後10日間、mC...

ディスカッション

初期の免疫発達ががんの進行にどのように影響するかを理解することは、年齢に適した免疫調節戦略を設計する上で不可欠です。本研究では、出生後の免疫未成熟の重要な時期において、がん細胞の移植と免疫調節を正確に時間的に制御できる再現可能な新生児移植プラットフォームを説明します。側頭静脈介在の静脈内投与とBLIを組み合わせることで、初期感染が異なる疾患文脈で小児がんの進行にどのように影響するかを体系的に検証することが可能になります。

この手法を用いることで、新生児mCMV感染は新生児静脈内移植後の白血病進行を著しく抑制する一方、NBの進行は同一の実験条件下で影響を受けないことを示しました。これらの対照的な結果は、感染駆動の免疫調節が早期に文脈依存的であることを浮き彫りにし、小児がんと免疫の相互作用をモデル化する際に疾患特異的生物学の重要性を強調しています。

新生児mCMV感染後の白血病負荷の減少は、我々の前回の研究と一致しています^。

材料

```html

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100µL, Microliter Syringe, Luer Tip	Hamilton	80601	-
30 G Needle	BD	305106	-
7-AAD	Biolegend	420404	-
Ami-X imaging system	Spectral Instruments Imaging	-	-
anti-mouse B220- APC	Biolegend	103212	-
anti-mouse CD19-FITC	Biolegend	152404	-
anti-mouse CD3ε- PerCP	Biolegend	100326	-
anti-mouse Ly-51-PE	Biolegend	108308	Also called BP1
anti-mouse TER119- PerCP	Biolegend	116226	-
anti-mouse/human CD11b- PerCP	Biolegend	101230	-
Aura software	Spectral Instruments Imaging	-	version 4.0.8
BD Accuri C6	BD	-	-
BD Fortessa X-20	BD	-	-
Cleaning solution	Hamilton	18310	-
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	2770930	6 µL contains 6000 beads
D-Luciferin	GoldBio	eLUCK-1G	-
DMEM	Gibco	11965092	-
DNase I	Sigma	1.13E+10	-
Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged	FALCON	352340	-
FBS	Gibco	A5256701	-
FlowJo software	BD	-	v10.8
GeltrexTM	Thermo Fisher Scientific	A1413202	-
GraphPad Prism software	Dotmatics	-	v10.4.1
LE.5209 Cold light source	Euromex	-	-
Liberase™ TM Research Grade	Sigma	5.4E+09	-
NSG mice	Jackson Labrotary	5557	NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
Polybrene	Sigma	H9268-5G	-
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	101301	-
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301	-

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