上部胴体神経叢損傷に対する自家神経移植と複数神経移動:ラットモデル研究

サマリー

神経移植または神経移植で修復された左上幹の上腕神経叢損傷のラットモデルを確立したところ、両群は類似の筋力を達成していることがわかりました。移植された動物は優れた運動協調を示しました。

要約

上半身(C5-C6)の腕神経叢損傷は肩の外転や肘の屈曲を妨げます。近位切断が保存されたC5-C6断裂の場合、神経移植(NG)が従来のアプローチとして使われています。神経移動(NT)はC5-C6脱離において唯一有効な選択肢です。NTの現在の世界標準には、三重の移植手技があります:脊髄副神経(SAN)から鞍上神経(SSN)、オーバリン手技、リーカヴェングボング手技です。最近の臨床傾向では、NTの適応が根断裂シナリオも含むように拡大しており、遠位NTが軸索再生距離を著しく短くするという理由に基づいています。直接比較を可能にするため、本研究ではこれらの臨床戦略を模擬する2つのラットモデルを確立しました。1) C5-C6切断部をSSNおよび上部幹に接ぎ木したNGモデル;2) 上記の3つの手法からなる多重NTモデル。機能回復(落合スコア、バルト足部損傷検査、テルジスグルーミング検査)、電気生理学的パラメータ、再生感覚軸索数は術後8週および16週に評価されました。8週時点で、グループ間で機能的アウトカムに統計的に有意な差は認められませんでした。16週時点で落合スコアとテルジスの結果はほぼ同等のままでしたが、NGはバルトテストで著しく優れた成績を示した。電気生理学的には、NTは8週間時点で筋皮神経、腋麻神経、肩甲上神経の回復率が有意に良好を示しました。しかし、これらの電気生理学的利点は16週までに統計的に有意でなくなっていました。8週時点で、NGはすでに筋皮神経および腋窩神経に再生した感覚軸索を多く持っており、SSNの数は同様でした。16週までに、NGは3本すべての神経で感覚軸索数でNTを上回りました。鋭いC5-C6切断のラットモデルにおけるこれらの所見は、術後16週間以内にNGがNTと同等の機能的および電気生理学的回復を達成し、感覚および協調運動機能の優れた回復をもたらすことを示しています。しかし、これらの発見の翻訳的関連性を明らかにするには、より長期の追跡期間を持つさらなる研究が必要です。

概要

腕神経叢損傷は一般的に、上側幹損傷(C5–C6、C7の関与の有無にかかわらず)、下部幹損傷(C8–T1)、および全身神経叢損傷(C5–T1)に分類されます。頭部と肩にかかる圧縮力は通常、上部胴体の損傷を引き起こします。C5–C7の上根部の経孔靭帯が外傷力の上方伝達を部分的に分散するため、これらの根、特にC5が椎間孔で断裂することは珍しく^{ありません。}しかし、激しい暴力でも根部剥離が生じ、下部幹にまで及ぶこともあります。上肢が水平面で強く注意をそらされると、下部幹の根の剥離が優勢です。より強い力では、完全な腕叢剥離が起こることがあります。C8–T1根を保護する上空孔靭帯が存在しないため、ほぼすべての外傷性下幹損傷は根切断です^。したがって、根損傷のパターンに関しては、C5–C6根は破裂しやすい一方で、C7–C8–T1根は剥離しやすいです。これらの病態解剖学的特徴は、適切な手術戦略を選択する上で極めて重要です。

上部胴体の損傷は、臨床的には肩の外転喪失と肘の屈曲を特徴とします。近位根断骨が有効なC5–C6断裂患者では、従来の戦略として神経移植(NG)が行われてきました。残存するC5およびC6根は通常、臍側神経の自己移植を用いて上部幹の前後の枝と、そして鞍上神経3に橋渡し^します。C5およびC6の根が剥離されると、神経移動(NT)が唯一の再建手段となります。世界中の多くのセンターで採用されている手術アルゴリズムは、3つの手法を組み合わせています:脊髄副神経から肩甲上神経への接続、尺骨神経の1本の束から筋皮神経の上腕二頭筋枝への接続(オーバーリン手技)、そして橈骨神経から腋幹神経前枝への上腕三頭筋の長頭枝(Leechavengvongs手^技)4。

過去10年間で、腕神経叢再建におけるNTの適応は徐々に広がり、一部の著者は根部断裂にも移植技術を推奨しており、遠位移植が再生距離を大幅に短縮し、^{運動回復を}加速させると主張^{しています。}しかしこれまでのところ、これらの報告は術後の筋力の成果にのみ焦点を当てています。機能回復の質を決定づける器用さや協調運動の評価は依然として欠如しています。

残存根切断部は感覚繊維の割合^{が高く、再構築後の}長距離皮質再マッピングの必要性を排除するため、C5–C6の神経節破裂後において、再生軸索の源として有効なC5–C6根断端を用いるNGはNTに比べて機能回復の質が優れていると仮説を立てます。ラットは腕神経叢損傷^{および修復の}理想的な実験モデルとして広く受け入れ^{られているため、}NGまたはNTを用いて再構築したC5–C6後神経節病変の成体ラットモデルを2つ確立します。行動評価、電気生理学的評価、再生感覚軸索数を用いて両グループを比較し、仮説を検証します。

プロトコル

このプロトコルは復旦大学動物科学実験科動物福祉倫理委員会により承認されました(承認番号:2019 華山病院 JS-008)。

ラットモデルの確立
左側上部幹の破裂損傷
室温は23〜25°Cに保たれていました。 スプラグ・ドーリーラットには腹腔内1%ペントバルビタールナトリウム(0.4mL/体重100g)で麻酔されました。麻酔誘導後、ラットは手術ボード上で仰向けに置かれ、前肢は体幹から90度外転させられました。首、胸部、腋窩、そしてNG動物のみでは両後肢が剃られました。皮膚はポビドンヨウ素で消毒されました。胸骨の上縁まで、輪状軟骨から胸骨手の上縁まで3cmの頸椎中央切開が行われました。手術顕微鏡の下で、皮下組織と深部筋膜を層ごとに剥離し、胸骨舌骨筋、胸骨突起筋、大胸筋筋、小胸筋を露出させました。これら4つの筋肉は、滅菌された特注のペーパークリップリトラクターで引き戻されました。リトラクターの遠位端はゴムバンドで操作ボードに固定され、テンションを調整して内頸静脈を保護しつつ最適な露出を確保しました。前斜角筋および中斜角筋が特定され、斜角間空間における腕神経叢の鎖骨上部が露出した(図1A)。C5およびC6の根はそれぞれの椎間孔から5 mm遠位で切断され、その後5 mmの断片を切除して明確な隙間を作りました(図1B)。NT群では、C5およびC6の近位切断部が隣接する軟部組織に縫合され、再生軸索が遠位経路に侵入するのを防ぎました。

NGモデルの確立
後ろ足の背側外側、外側の槌骨、そして下腿の側面に沿ってL字型の切開が行われました。手術顕微鏡の下で、皮下組織と深部筋膜を層ごとに剥離し、小さな大合在静脈を保護するように注意深く観察し、その後胸側神経を露出して採取しました。両側の腹側神経は合計8cmの長さに達しました。神経周結合組織をトリミングした後、各神経は8つの1cm節に分割されました。鞍上神経は上部幹から起点で切断されました。1本のグラフトはC5から鞍状上神経への橋渡しに使われました。C5から3つの接ぎ木、C6から上部幹への4つの接ぎ木(図1C)。

NTモデルの確立
頸椎の正中切開部は上腕の方へ約2.5cm遠方に伸びていました。 外側大胸皮枝が現れる地点で、大胸筋は大胸筋と上腕二頭筋の間の繊維方向に沿って切開されていました。深部の小胸筋は鈍く剥離され、大胸筋の下に走る腕神経叢の緒が露出しました。尺骨神経は内側索から発生し、脊髄区間の最も内側を通ります(図1D)。筋皮神経は外側索から始まり、大円尾の下縁を通り腕に入り、最終的に上腕二頭筋の腹部に入り、脊髄の最も外側を走ります(図1D)。橈骨神経は後索から始まり、広背筋腱の下縁を通り、後腕に入り、三頭筋の長頭、内側頭、外側頭に三頭筋を供給する三つの枝を分岐します。腋神経も後索から発せられ、四角形空間を横断し、三角筋に支配する前枝と後枝に分かれます。

脊髄付属神経の上層神経への移動
胸鎖乳突筋は頸椎の正中切開部内で引き戻され、副脊髄神経が露出しました。神経は二腹筋の下から現れ、胸鎖乳突内側境界の中央3分の1に達し、胸鎖乳突支を分岐し、その筋肉の後方境界に沿って続き、首の横側に降りて僧帽筋に神経支配を行います。胸鎖乳突支は、移植後に結合部位を妨害する可能性のある副神経への牽引を除去するために切断されました。僧帽筋の枝は筋肉への入り口で分岐していました。鞍上神経は上部幹の遠位にある起点で切断されました。付属神経の僧帽筋枝は、1本の10-0合成ポリプロピレン縫合糸で鞍甲上神経に接合していました(図1E)。

尺骨神経束から筋肉皮神経の上腕二頭筋運動枝への移動(オーバーリン手技)
筋皮神経の主幹は遠位に動員され、上腕二頭筋の運動枝全体が完全に露出しました。上腕二頭筋運動枝の中央3分の1のレベルで、尺骨神経の外側から6mmの束が採取され、その遠位端が鋭く切断された。上腕二頭筋の運動枝は、起点から筋皮神経幹から切断されました。動員された尺骨束は、10-0合成ポリプロピレン縫合糸で上腕二頭筋運動枝に接合されました。上腕二頭筋運動枝の完全な露出には2つの目的があります。(1)尺骨神経から束束を採取する正確な部位を特定すること、(2)移植後の緊張のない接合を確保すること(図1F)。

橈骨長頭三頭筋の枝を腋窩神経の前枝に移す(Leechavengvongs手技)
ネズミはうつ伏せの姿勢に再配置され、前肢は90度外転して鼻に向かいました。左上腕の背側部分は剃られ、消毒されました。左上腕の背側に3.5cmの縦切開が行われ、肩関節から上腕骨中央まで伸びています。手術顕微鏡の下で、皮下組織と深部筋膜を層ごとに解剖しました。三角筋は引っ込められ、腋神経の主幹とそれに伴う後方の回弦上腕血管が空間から出てくる四角形空間が露出しました。腋窩神経は遠位に動員され、前方および後方の全部分が三角筋腹部に入る直前に完全に露出しました。同じ切開部内で、橈骨神経の主幹が三頭筋の長頭と外側頭の間に位置していました。橈骨神経は遠位に動員され、三頭筋の長頭までの運動枝全体が明確に見えるまで(図1G)。長頭三頭筋の枝は筋肉への入り口で切断され、近位部で腋神経の前枝を近似するために反射されました。腋神経の前枝は主幹から起点から切断され、遠位に反射されました。長頭三頭筋は腋下神経の前枝に分岐し、単一の10-0合成ポリプロピレン縫合糸で接合されていました(図1H)。

すべての神経再建が完了した後、各手術部位は無菌生理食塩水で洗浄され、すべての関節部位が詳細に検査されて完全性が確認されました。すべての切開は層状に閉じられ、大胸筋は5-0本の非吸収性シルク縫合糸(NT群の頸椎切開のみで必要)で近似され、その後皮下筋膜と皮膚が施されました。すべての神経結合が緊張なしで行われたため、術後の上肢固定は不要でした。

行動評価
落合は¹³点
ネズミは尾を持ち上げられ、体はテーブルから30cm上に吊るされ、両前肢の姿勢が観察されました。ネズミは、歩行中の前肢の歩き方を観察するために、テーブルの上の狭い滑走路(長さ50cm×幅10cm)に置かれました。滑走路全体が白い紙で覆われ、スタート地点は黒いインクで湿らせられていた。ネズミが前に進むと、はっきりとした足跡が残ります。0点 – 吊るされたとき、両前肢はリラックスして床に向かってまっすぐ垂れ下がります(図2A-1);歩行中は、どちらの前肢も引きずられることはありません(図2A-2)。1点 – 吊るすと影響を受けた前肢がわずかに内側に内側し、曲げられます(図2B-1);歩行中は肘の屈曲が制限されるため軽い引きずりが見られます(図2B-2)。2ポイント – 吊り下げ時、影響を受けた前肢は完全に屈曲し内転します(図2C-1);歩行時には激しい引きずりが見られます(図2C-2)。

バース足の過失テスト¹³
テーブルから11cm高く設置された水平の金属グリッド(50 cm× 38 cm)が用意されました。各グリッドの正方形は1.5cmです。ネズミはグリッドに配置されました。影響を受けた前肢がグリッドの開口部をすり抜けると、「フットフォルト」として記録されます(図3)。2分間に影響を受けた肢による足の転倒数が数えられました。

テルジスグルーミングテスト¹⁴
ネズミはオープントップの透明な観察ボックスに入れられました。約1〜3mLの生理食塩水をラットの鼻先と顔に散布し、水滴を取り除こうとする試みが観察されました。

グレード0 – 影響を受けた手足に反応なし。
グレード1 – 影響を受けた肢は肘で曲がり口に到達しますが、鼻には届きません(図4A)。
グレード2 – 影響を受けた手足が鼻に到達します(図4B)。
グレード3 – 影響を受けた肢は鼻の上まで届くが、目には届かない(図4C)。
グレード4 – 影響を受けた肢は目まで届くが耳には届かない(図4D)。
グレード5 – 影響を受けた手足が耳やその後ろに到達します(図4E)。

複合筋活動電位(CMAP)
ラットは麻酔、固定、プロトコルの前述の準備を行い、鎖骨上部と腕神経叢の脊髄部分が露出されました。黒い記録針電極は標的筋肉(上腕二頭筋、三角筋、または棘下筋)の腹部に挿入されました。赤い記録電極は同じ筋肉の腱-筋接合部に挿入されました。緑色の基準電極は黒い電極と赤い電極の間に配置されました(図5)。すべての電極は深さ2mmまで挿入され、両側に同じ挿入部位が使用されます。神経は刺激電極で優しく持ち上げられ、検査を受けました。強度0.5 mA、持続時間0.2 msの単一の方波パルスが送信されました。CMAPの遅延と振幅も記録されました。反対側(健康な側)が基準として用いられ(値1が割り当てられました)。レイテンシ遅延率([影響を受けた側のレイテンシ/健康側のレイテンシー]×100%)および振幅回復率([影響を受けた側の振幅/健康側の振幅]×100%)を計算しました。

免疫蛍光染色
ミエリネット線維には抗神経フィラメント200(NF200)が標識され、その中でも、運動ミエリン繊維は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)との共標識によって区別されました。したがって、NF200陽性でChAT陰性の線維は感覚性髄鞘線維に分類^{されました。}

神経移植群では、影響を受けた肢の第二縫合部位の遠位から筋皮神経、腋幹神経、鞍甲上神経の主幹を採取しました。神経移動群では、筋皮神経の上腕二頭筋枝、腋窩神経の前枝、そして鞍嚢上神経がそれぞれの共接部位の遠位に取られました。各神経の3mm区画を4%のパラホルマルデヒドに浸し、4°Cで24時間固定しました。

標本は縦軸に垂直に配置され、パラフィンに埋め込まれ、3μmで連続的に断片されました。脱パラフィン化後、電子レンジを用いて0.01 M EDTAバッファー(pH 8.0)で抗原回収を行いました。切片は4°Cで一晩培養され、一次抗体はPBSで希釈されました(ChAT, 1:200;その後、PBS洗浄と室温での二次抗体(Cy3結合ヤギ抗ウサギ抗体、1:300;Alexa Fluor 488-結合ヤギアンチマウス、1:400)光から守られています。核はDAPIで染色されました。各神経の全断面をスライドスキャナーを備えた蛍光顕微鏡で画像化しました。

NF200は緑色蛍光、ChATは赤色蛍光で可視化されました。NF200陽性/ChAT陰性プロファイルは感覚ミエリン繊維として数えられました。各神経からランダムに選ばれた5つの断片をImageJで解析しました。断面全体における感覚ミエリネ化線維の総数を各断片ごとに数え、5つの断片の平均値をその神経標本の最終カウントとしました。

統計解析
サンプルサイズ(グループあたりn=8)は、感覚軸索数パイロット効果量(コーエンのd=2.31)を用いてG*パワーで前向きに算出し、α=0.05で80%の検出力≥得ました。すべての統計解析はGraphPad Prismを用いて実施されました。データは中央値(四分位数範囲)[M(p25–p75)]として示されています。グループ間比較はマン・ホイットニーU検定で実施されました。P値<0.05は統計的に有意とされました。

結果

術後1日目には、NGラットおよびNTラットの両方で、手術部位の肩外転および肘の屈曲が完全に失われました。拘束中に影響を受けた前肢の背側部分を刺した際、どちらのグループも引き込みや発声は見られませんでした。8週時点で、両群とも肩と肘の機能が改善していました。同じ刺激策が今や撤退を引き起こした。16週目には、まだ完全ではありませんが回復が見られました。背側前肢を刺すとNTラットはもがき、キーキー鳴きましたが、NGラットはより激しく抵抗し、より大きなキーキーという音を出しました。

8週および16週では、落合スコアはNGとNTで差がなく(Pは共に0.05>)、2分間テスト中の足の故障数は8週時も似ていました(P > 0.05)が、16週目にはNGラットの方がNTラットよりも著しく少ない断層を出しました(P < 0.05)。テルジスのグルーミングスコアは両時点で統計的に区別がつかず(両方ともP > 0.05、表1)。

8週時点で、筋皮神...

ディスカッション

本研究の目的は、残存神経根移植による腕神経叢損傷の再建が神経移植と比較して全体的に優れたアウトカムをもたらすという仮説を検証することでした。C5–C6断裂を持つ成体ラットは2つのグループに分けられました。1つは神経移植による上部幹再建を受け、もう1つは脊髄副神経、橈骨神経の長頭三頭筋枝、尺骨神経の束の移動によるものでした。電気生理学的には、神経移植群は神経移動群より優れているわけではありません。実際、移植群の早期回復は移植群に比べて遅れていました。なぜなら、神経移植の再生軸索は追加の共接部位を通過しなければならないからです。しかし、術後16週目には、神経移植動物はバルト足の過失テストで有意に良好な成績を示しました。これらの発見は、筋力回復は両戦略間で差がなかったものの、神経移植後に回復した運動の協調性が神経移植後のものを上回っていることを示しています。

本研究では、ラットモデルにおける前肢全体の機能を包括的に評価するために、3つの古典的な行動アッセイが用いられました。落合スコアは主に、四肢障害が歩行パターンや歩幅に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1×シトレート抗原回収溶液	サービスバイオ	G1219-1L
1×Tris-EDTA抗原回収溶液(pH 8.0)	サービスバイオ	G1207-1L
1×Tris-EDTA抗原抽出液(pH 9.0)	サービスバイオ	G1218-1L
10-0プロリーン	ジョンソン&ジョンソン医療技術者	W2790
5-0 マーシルク	ジョンソン&ジョンソン医療技術者	SA82G
Alexa Fluor 488結合ヤギ抗マウスIgG(H+L)	サービスバイオ	GB25301
抗160 kDaニューロフィラメント ミディキュムマウスmAb	サービスバイオ	GB12763-100
抗コリンアセチルトランスフェラーゼウサギpAb	サービスバイオ	GB11070-1-100
蛍光消光コーティング剤	サービスバイオ	G1401
牛血清アルブミン	サービスバイオ	GC305010-5g
チャット	サービスバイオ	GB11070-1
Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG(H+L)	サービスバイオ	GB21303
ダピ	サービスバイオ	G1012-10
埋め込み機	GET電子(慧州)有限公司	JB-P5
蛍光顕微鏡	ニコン	エクリプスC1
4チャンネル筋電図器	ダンテ族	DT440
G*パワー	ハインリヒ・ハイネ大学DÜセルドルフ	3.1.9.7
高速カメラコントローラー	ニコン	DS-U3
イメージJ	国立衛生研究所	1.8.0
顕微外科器具	寧波承和マイクロインストゥルメント工場	6804
電子レンジ	ガランツ	P70D20TL-P4
操作顕微鏡	上海医療光学機器工場	SXP-1B
ピペット	エッペンドルフ	100221588457
プリズム	GraphPad ソフトウェア	10.1.2
ロータリーミクロトーム	ライカ	RM2016
スキャナー	エプソン	V300
スプラグ・ドーリー・ラット	上海シッペ-Bkラブラドール動物	OR-1001
組織自己蛍光消光器	サービスバイオ	G1221-5ML
組織マーキングPen‌	ジーン・テック	GT1001