マウスの頸部リンパ管およびリンパ流の収縮率を生 体内 で2光子イメージングするための再現可能なセットアップ

サマリー

本論文は、マウスにおける頸部リンパ管およびリンパ流の収縮性を 体内で研究 し、頸部リンパ管(cLVs)のさまざまな生理的機能を検証し、脳の排出およびクリアランスというリンパ調節機構の調節のための治療戦略を示唆しています。

要約

cLVsの収縮力はリンパ流の原動力であり、脳毒素浄化の重要なメカニズムです。ここでは、cLVsの収縮率をin vivo で2光子イメージングし、マウスのcLVにおけるリンパ流による赤血球の除去を長期的に観察する革新的な手法を紹介します。構成要素には、マウスの首に適応したミニヒートパッドがあり、cLVの収縮力とリンパ流を維持しつつ、最大5時間の画像撮影ウィンドウを拡大できます。湿度管理;保護ケース、また、cLVの安定した光学可視化を維持できる位置決めシステムも備えています。この方法は再現性と他の二光子顕微鏡や幅広い対物レンズとの互換性を確保し、最大500μmの深さを持つ高品質画像を維持します。プロトコルには、正常なcLVの収縮力を提供する生理的環境を維持するためのcLVの外科的準備の詳細な段階が含まれています。

概要

頸部リンパ管(cLVs)の収縮力は、脳の排出や代謝物・毒素からのリンパ管除去に重要な役割を果たします(^1,2,3)。cLVsのこの主要な機能の減少は、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、脳がんなど多くの脳疾患に伴う脳毒素浄化の抑制につながります(4,5,6,7,8,9)。したがって、cLVの収縮力を研究することは、脳排出と^{クリアランスの}リンパ調節機構の調節に関する新たな治療戦略の開発において重要なアプローチ^です。

本研究は、異なる年齢のマウスにおけるcLV収縮力およびリンパ流量をリアルタイムで2光子イメージングする革新的な手法を提示します。この装置の重要な構成要素には、動物の首に装着すると最大5時間の画像撮影時間延長が可能であり、収集リンパ管の収縮活動とリンパ流の安定性を維持します。

血液循環系とは異なり、血液は特定の速度(人間の小動脈では10 mm/s、矢状洞では13 cm/s)で様々な種類の血管を通過しますが、リンパ管のリンパ充填は空のリンパ管と代謝中に生成される間質液の量との間の圧力勾配の増加に依存します^{。14、15、16、17、18、19}。同時に、リンパ管内のリンパ流は0から1 mm/sまで間欠的で、20,21,22です。最近の人間MRI研究では、髄膜リンパ管(MLVs)内のリンパ流量が1〜3 mm²³であることが示されています。ただし、単独の人間でもMLVのリンパ流量は時間帯によって変動し、0にまで落ちることもあることに注意が必要です。したがって、リンパ管内のリンパ流は代謝過程の速度に依存し、さらに代謝過程の速度に依存し、その代謝過程は温度²⁴に依存するため、不安定です。実際、生化学反応の速度は温度によって大きく直接的に影響されるため、リンパ管の自発収縮にも大きな影響を与え、リンパの排出^や輸送を変化させる^{可能性があります。}

したがって、体温を維持することは、リンパ管の生理環境を正常な収縮性とリンパ流を支えるために重要な条件です。しかし、市販のヒートプレートの使用では、cLVが位置する首の深く光学的にアクセス可能な部分に必要な温度の維持が保証されません。これは特にcLV収縮率とリンパ流の二光子イメージングにおいて重要であり、この光学技術²⁷には必要な19°Cの低温実験室で行われます。

この点で、圧倒的多数のin vivo研究では、市販の加熱板を用いたリンパ収集血管の収縮率は3〜5分に制限されています(最大効果は通常数秒以内に観察されます。3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37)。その後、リンパの充填と収縮力が低下します。このアプローチはリンパ管生理の観察時間を大きく制限し、収縮力やリンパ流への長期的な影響を評価することが不可能になるため、マウスの首に適応したミニ温熱パッドを開発し、cLVの収縮性と安定したリンパ流を維持しつつ、画像撮影の時間を最大5時間延長することを目指しました。

もう一つの構成要素は湿度制御・位置決めシステムを備えた保護ケースで、水浸しなしでcLVの安定した可視化を可能にし、0.17mmカバーガラス用補正された長距離空気浸透レンズ(例:CFI Plan Apochromat Lambda D 10x(MRD70170)およびCFI Plan Apochromat Lambda D 20x(MRD70270))を使用した場合にも高解像度画像を保存します。

提案された方法は、温度・湿度制御やレンズからの作業距離などの環境特性を考慮しつつ、他のタイプの二光子顕微鏡およびケースに適合する様々な対物レンズとの再現性と互換性を確保しつつ、最大500μmの深さと最大5時間の時間窓を持つ高品質な画像を維持し、マウスにおけるcLVsやリンパ流の収縮性を高品質に長期解析することを可能にします。

cLVsが頸動脈の分岐部付近にある解剖学的位置、すなわちバロレセプターが位置していることを考慮することが重要です。バロレセプターへの機械的影響は血圧や心拍数の不安定化を引き起こします。これにより静水圧に大きな変化が生じ、その結果リン^パ流の障害が生じます。したがって、提案された方法には、近傍頸動脈の分岐や血圧の変化に機械的影響が及ぼさず、脳内のリンパ流障害、結果としてcLVのリンパ流および収縮力の障害を防ぐため、深部頸部のcLVを穏やかに隔離するための手術プロトコルの詳細な説明が含まれています。

結果は、マウスにおけるcLVの収縮力の加齢による低下と治療的光刺激効果に対する感受性の低下を示しています。さらに、長期観察(5時間以上)で初めて、cLVが右外心室から赤血球を除去するためのトンネルとして機能することを明確に示しました。右側心室は脳毒素浄化の重要なリンパ経路^です。全体として、cLV収縮率およびリンパフローのin vivo 2光子イメージング法は、脳の排出やクリアランスの調節、脳からの代謝物や毒素の除去、さらにcLV生理機能の調節に関する新しい治療技術の試験を目的としています。

プロトコル

すべての手順は、実験動物のケアと利用に関する指針、科学目的で使用される動物保護に関する指令2010/63/EU、およびロシア連邦科学・高等教育省の指針(1984年11月13日付第742号)に従って実施され、これらはサラトフ州立大学の生命倫理委員会(議定書第7号)によって承認されています。 22.09.2022).

注:本プロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 をご参照ください。

1. マウスを修理するための技術的な装置

1. スチール製の光学レール(SOR、長さ270mm、幅43mm; 図1A)インスタレーションの土台として。
2. SORの上に2つのポストホルダー(3PH-25)を175mmの間隔で設置します(図1B)。取り付けポスト(3MP、直径12mm)を3PH-25の中に取り付け、M6ネジでしっかり固定します(図1C)。
3. ポストカラー(3PC)を両方の取り付けポストに取り付けます(3MP; 図1D)。頸部リンパ管の光学モニタリング中に、生理食塩水を継続的に供給しカテーテルを固定するためにポストカラーが必要です。
   注意:これは手術後に蓄積した血液を除去するために定期的に研究部位を洗浄するためで、光学モニタリングを複雑にすることがあります。
4. 直角固定ポストクランプ(3RPC-12)を3MPの取り付けポストの一つに取り付け、M6ネジでしっかり固定します(図1H)。
   1. 直径12mmの取り付けポストを3RPC-12の側面穴に挿入します(図2B参照)。
      注意:取り付けポストは、水浸しでない二光子レンズの保護カバーの後続の固定に必要です。
   2. 3Dプリンターで印刷したホルダーを側面の取り付けポストに取り付け、M3ネジ2組でしっかり固定します(図2C参照)。
   3. UV硬化用接着剤を使い、3Dプリンターで印刷した保護ケースの裏側に直径12mmのカバーガラスを取り付けます(図2D、F)。その後、M4のネジナットペアを使って保護カバーをホルダーに取り付けます(図2参照)。
5. 垂直移動用の精密パンタグラフテーブル(02TV004)(図1E)を、2つのテーブルクリップ(3TC5)とネジ、ナット、ワッシャーのセット(M6)を使ってSORベースに取り付けます(図1F)。
6. テーブルの上に3Dプリントされたケース(長さ155mm、幅110mm)を置き、これは生理食塩水の蓄積の貯蔵庫として使われます(図1G)。

2. 加熱要素

1. 周辺機器の組み立て。
   1. 配線と加熱素子1の接続点を薄いシリコーンの層で覆います(図3)。温度センサー1をマットに固定し、シリコンで密封します(図3B)。
   2. 加熱素子と温度センサーの配線を多線ケーブルにはんだ付けし、接続部をシリコーンで埋め、シュリンクラップで閉じます(図3)。
   3. 加熱要素2と温度センサー2をフォームローラーに入れます(図4)。
2. 制御ユニットの組み立て
   注意:制御 https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg のケース印刷用のダウンロードファイルへのリンクです。
   1. 制御ユニットのケースを3Dプリンターで印刷します(図5B参照)。
   2. 電源ケーブルと電源ボタンの接続端子をケースの壁に取り付けてください(図5C,D参照)。
3. エンクロージャー内に24V DC電源、DCステップダウンコンバータ、2つのMOSFETモジュールを設置します(図5A、G、H、I)。
4. 回路を組み立てるには、以下の手順に従ってください(図6)。
   1. 降圧コンバータを電源に接続し、電圧を9Vに設定します(図6)。
   2. Arduino UNOのVINピンをコンバータのOUT+コネクタに接続し、GNDをアウトコネクタに接続します(図6)。
   3. 電源のV+ピンをMOSFETモジュールのVIN+ピンに、VピンをVINピンにそれぞれ接続します(図6参照)。
   4. 加熱素子1のVピン+をモジュールMOSFET1のVOUT+に接続し、V-をVOUTに接続します(図6)。
   5. 加熱素子2とMOSFET 2の手順を繰り返します(図6参照)。
   6. MOSFET 1および2モジュールのGNDピンをArduino UNOのGNDに接続し、PWM MOSFET 1をArduino UNOのD11コネクタに接続し、PWM MOSFET 2をD10コネクタに接続します(図6)。
   7. 温度センサー1のVINピンをArduino UNOのGNDコネクタに接続し、VIN+をArduino UNOの5Vコネクタに接続し、SIGをD3に接続します(図6)。
   8. 温度センサー2のSIG接点をArduino UNOのA1に接続し、GNDセンサーをArduino UNOのGNDに接続し、さらに100 kΩプルアップ抵抗器も接続します(図6)。
5. ArduinoのUNOと蓋のハウジング内のキーボード画面を修理してください(図7I参照)。

3. 温度制御ソフトウェアガイド

1. Arduinoスケッチ(.inoファイル)をダウンロードし、Arduino開発環境(IDEバージョン:2.3.5-nightly-20241212)で開いてください。
2. 正しいCOMポートを選択してファームウェアをダウンロードしてください。インターフェースには2つのボタンがあります。移動する場合は左右のボタン(図7B,D)を使って移動します。選択インジケーターは列の左側に配置されています(図7F)。
3. 温度選択フィールドは画面の左列にあります(図7H)。上ボタンと下ボタンを使って調整してください(図7C)。
4. START/シャットダウンフィールドは画面の右列(図7G)にあります。この列を選択するには、キーボードの 右 ボタンを押し、次にセレクト(図7A)を押してください。プロセスが実行中だと、アクティビティインジケーターが点滅し、RUNボタンのラベルがOFFに変わります。

4. 動物を技術装置に固定する

注:実験は25〜28g、2、18、24ヶ月のオスBALB/cマウスを対象に実施されました。各グループには7匹の動物がいました。

1. ケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ100 mg/kg、10-156 mg/kg)を準備し、マウスの体重に応じて腹腔内注射で注入します。
2. 手術中に眼球が乾燥しないように、まぶたに眼軟膏を塗ってください。必要に応じてこの手順を繰り返してください。
3. 後ろ脚を引っ込めて尾を折る反射が止まったら、ネズミを背中の加熱要素の上に置き、腹部へのアクセスを可能にします。
4. 制御ユニットをコンセントに接続します(入力電圧範囲175-240 V AC、周波数範囲50-60 Hz、交流電流1.8A/230 V AC)。デバイスの動作温度を37〜38°Cに設定してください。
5. 医療用テープを使い、動物をテーブルの表面と平行に固定し、頭部を矢状軸に対して角度をつけて、首の右側または左側がローラーの上に乗るようにします(図8A)。
   注意:マウスの頭部の固定は、実験条件に応じて首の右側または左側を顕微鏡レンズに向かって約5mmの高さまで持ち上げるために必要なものです。したがって、dcLNとcLVの面積は気管とほぼ同じレベルになります。
6. 結紮を上切歯に巻きつけ、医療用テープを使って動物の体温を保つために装置の背面に取り付けます。
7. シェービングマシンを使って、首の生え際の部分を剃ります。剃った後は残った毛を取り除き、動物を覆って無菌フィールドを保護します。手術およびその後の眼科検査では、切開部にリドカイン/ブピバカイン(それぞれ1 mg/mLおよび0.25 mg/mL)を皮下注射します。
   1. 一次消毒では、アルコール綿棒で皮膚を脱脂し部分的に消毒し、その後抗菌処理のためにクロルヘキシジン0.5%またはヨウ素2%の溶液を皮膚に塗布します。消毒の手順をさらに2回繰り返します。
8. 直線解離ハサミを使い、下顎から鎖骨あたりまで約2cmの長さの縦切開を行って首の皮膚を皮膚切開します(図8B)。
9. 曲がったピンセットを用いて顕微外科的曲がったハサミで筋膜切開を行い、唾液腺と首の浅い筋肉を押し広げ、胸鎖乳突筋を露出させます。出血を防ぐために目に見える血管を損傷させないようにしましょう。過度の組織損傷を防ぐために、手術部位を常に生理食塩水で湿らせてください。
10. 顕微外科的はさみを用いて、動物の気管と頸動脈の間の領域にアクセスするために胸鎖乳突筋の筋切開術を行います。
11. 筋肉と筋膜の拡大を続け、筋膜切開術を行うことで、深部頸部リンパ節および5〜7mmの深さで求心性・遠心性リンパ管を位置づけます(図8C)。

5. 顕微鏡でマウスを固定する方法

1. 固定された動物と一緒に装置を顕微鏡の可動テーブルに置き、M6ネジでしっかりと接続します。これは可動式テーブルに恒久的な設置場所を確保するために必要です。
2. 制御ユニットをコンセントに接続します(入力電圧範囲175-240 V AC、周波数範囲50-60 Hz、交流電流1.8A/230 V AC)。デバイスの動作温度を36〜37°Cに設定してください。
3. 生理食塩水を満たしたカテーテルを医療用テープでマウントポストに取り付けます。
4. 動物の頭部側面の加熱要素の下に直径1cmのローラーを置き、可動式顕微鏡テーブルに対して45°の傾き角を確保します。これは頸部リンパ管を水平に置き、その後の気管への圧力を減らすために必要です。
5. 手術後は首の部分に固定カテーテルを開けて、動物の鎖骨の側面に位置させます。
   1. 生理食塩水の供給をオンにし、開いた首の部分が生理食塩水で完全に満たされるまで待ちます。
   2. 生理食塩水で満たされた首の部分に保護ケースを下ろし、リンパ管の中心に位置し、動物の気管が圧迫されないようにします(図9A)。
   3. 保護ケースの取り付けには、双眼鏡で二光子顕微鏡に接続するものを使用することが推奨されます。保護ケースを気管に当て、圧迫されないようにします。保護ケースを下げる際に気泡が溜まらないように注意してください。保護プレートが首の上部の筋肉に位置し、cLVを圧迫しないようにして、加熱された生理食塩水が血管内に流れ込み、cLVの機械的変形を防ぐようにしてください。
6. 水浸しのない二光子レンズを保護ケース内にこのレンズの作業距離に対応する深さまで下げ、その後頸部リンパ管の二光子可視化を行います(図9B)。
   注意:最初のスキャンを行う際は、リンパ管が全長にわたって完全な構造を持ち、マウスが呼吸している間に可動性があることを必ず確認する必要があります。これにより、保護ケースによって変形や押しつぶされることがありません。

6. cLV収縮率の2光子 in vivo モニタリング

注:2光子画像は多光子顕微鏡(パルスレーザー、励起波長970 nm)で取得されました。画像は解像度20倍(f/0.75)で取得されました。各画像は1つの視野角ズーム×3.0(212.13 × 212.13 μm)で構成され、512 x 512のドットで構成されていました。cLVの画像は、1分間の30フレーム/秒の動画撮影によって取得されました。2光子画像は、1チャネルで488nm波長の蛍光LYVE-1をcLVで励起し、525nm波長で発光したもので取得されました。

1. cLV直径解析および自動収縮性評価
   1. 30分映画、30フレーム/秒、3倍倍率で、関心領域(ROI)のcLVの直径を測定します。カスタムPythonコードを用いて、リンパ流計算に使われる同じ区間でcLV直径の時間プロファイルを測定します。
   2. 手動で2点を選択し、 сLV の反対側の壁に対応します。Lucas-Kanade光フローアルゴリズム(OpenCVのcalcOpticalFlowPyrLK関数)を用いて、測定のサブピクセル精度を得て、その後のフレームでの位置を決定します。直径を追跡点間の距離をピクセル単位からマイクロメートル単位に変換して計算します。スライドウィンドウの中央分帯フィルターを使って、モーションアーティファクトを除去しましょう。1つのROIには少なくとも20の直径測定が必要です。
   3. 脈動の内部周波数を求めるには、直径の平滑化された時系列を用います。SciPyライブラリのfind_peaks関数を使って信号の最大値と最小値を自動的に検出します。この関数は振幅閾値やピーク間の最小距離に基づいて時間信号の局所的な極値を特定します。
   4. 平均直径の3%未満、間隔が2秒未満のcLV収縮は除外します。30分間隔の平均頻度を、1分間の陣痛の頻度として計算します。

7. cLVsにおけるリンパ流の二光子解析

注:リンパ流解析は、慢性カテーテルを介して自己血液が右側心室に導入されてから5時間以内にcLVs内の赤血球の移動によって評価されました。

1. マウスに1%イソフルランで麻酔をかけます(⁴⁰号に発表されたプロトコル参照)。⁴⁰で説明されたプロトコルに従って、カテーテルを右側心室に埋め込みます。
2. ステップ7.1、7.3-7.5に従い、マウスを2光子 in vivo でcLVのイメージングを行う準備を行います。
3. 血液採取および注射時の凝固を防ぐため、ヘパリンであらかじめフラッシュされた無菌マイクロ遠心分離チューブで10μLの針刺しで尾部静脈から血液を採取します。
4. 右側心室に血液を注入します(AP = −0.5 mm;ML= −1.06 mm;DV = 2.5 mm)をマイクロインジェクションポンプで0.1 μL/minの速度で測定しました。
5. cLV中の赤血球運動の二光子解析を行う。^41,22に掲載されたプロトコルを使ってリンパ流量を計算してください。

8. cLV収縮率の光生変調

1. cLVのPBMについては、⁴⁰の先行公開された技術とプロトコルを用いてください。

結果

保護ケースの使用は、子宮頸部リンパ管の長期モニタリングにおいて最も重要な利点 を提供します。例えば、手術部位を外部環境から隔離し、リンパ管および周囲組織を生理食塩水に浸かせ、体内にカテーテルを通じた生理食塩水の継続的な供給を維持できます。さらに、顕微鏡スライドに取り付けられ、リンパ管周囲の組織と密接に機械的に接触することで、保護カバーは動物の自然呼吸および心拍活動中に観察視野の機械的安定性を確保し、観察中の血管の総動域を5時間の観察中に数分の一マイクロメートル以内に制限します。

提案された技術は、光バイオモジュレーション(PBM)がcLV収縮力に与える刺激効果に対する感受性の年齢差を調べる研究で検証されました(図10)。この選択は、過去に発表された一連の生外結果に関連しており、加年による頭の排出の減少とPBMの刺激効果に対する鈍感さを示すことを示しています。29,42,43,44,45,46,47,48,49。

ディスカッション

リンパ管の生理学の研究には、非侵襲的な方法を用いながら、正常な収縮性と安定したリンパ流を可能にする特別な環境条件を維持する必要があります。リンパ管の機能を研究するほとんどの方法は、その収縮力の光学的モニタリングとリンパ流速度の評価に基づいています。3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38 ^...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dプリンター	Bambu Lab, 中国	P1S
5ピンコネクタ	Connfly electronic (Zhenqin), 中国	DS1110-01
熱収縮チューブセット	Jupiter, 中国	JP7230-01
Arduino IDE	Arduino LLC	2.3.5-nightly-20241212
BALB/cマウス	「Andreevka」分室 FSBIS SCBT FMBA, ロシア	3-15-16	オス、6ヶ月齢
Chlorhixedin	バイオ製薬工場, ロシア	N/A
Dumont鉗子	Stoelting, 米国	52100-07
Evansブルー染色	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 米国	N/A
細鉗子	Stoelting, 米国	52102-02P
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, スイス	29 G針
発熱体	中国	LFH-9415sg
インスリン針	INSUPEN, イタリア	31G, 0.25mm*6mm
ケタミン	モスクワ内分泌工場, FSUE, ロシア		全身麻酔
キーパッドシールド	diymore, 中国	1602 LCD キーパッドシールド
リドカイン	ORGANICA, ロシア	N/A	鎮痛薬
ロック可能なスイッチボタン	中国	N/A
金属膜抵抗器	TZT, 中国	N/A
マイクロ解剖用バナススプリングシザーズ	Stoelting, 米国	52130-00P
MOSFETモジュール	中国	MOSFETモジュール D4184
マウンティングポスト	Standa, リトアニア	3MP, 直径 12 mm
マウンティングワイヤー	AB小売, ロシア	HB-1
鋭くないピンセット	Stoelting, 米国	52108-83P
3Dプリンター用プラスチック	Bambu Lab, 中国	A00-D0-1.75-1000-SPL.
ポストカラー	Standa, リトアニア	3PC
ポストホルダー	Standa, リトアニア	3PH-25
電源コネクタ	RUICHI, 中国	AC-015
電源	SANPU, 中国	PS200-H1V24
垂直移動用精密パノラマテーブル	「レーザーコンポーネント」, ロシア	02TV004
直角固定ポストクランプ	Standa, リトアニア	3RPC-12
ネジ M3	Standa, リトアニア	N/A
ネジ M4	Standa, リトアニア	N/A
ネジ M6	Standa, リトアニア	N/A
シェービングマシン	Braun,	3310sシリーズ
塩化ナトリウム	Kraspharma, ロシア	N/A
はんだ	金属粉末製造, ロシア	錫-鉛はんだ 61
はんだ付けフラックス	Solins, ロシア	LTI-120 22 ml ブラシ付き
はんだ付けステーション	AOYUE, 中国	N/A
はんだ付けステーション	AOYUE, 中国	N/A
鋼製光学レール (SOR)	Standa, リトアニア	N/A
降圧電圧コンバータ	RUICHI, 中国	EM-825
直径解剖鉗子	Stoelting, 米国	52132-10P
温度センサ	Liludin, 中国	DS1820
テトラサイクリン	JSC Tatkhimfarmpreparaty, ロシア		点眼薬
コントローラ	Arduino, 中国	UNO R3
ピンセット	Stoelting, 米国	52100-03
二光子  顕微鏡	Nikon, 日本	A1R MP
ワイヤー	Partner-Electro, ロシア	P020G-0305-C050
キシラジン	「Alfasan International B.V.」, オランダ		筋弛緩薬
カテーテル	Scientific Commodities Inc., 米国	PE-10, 0,28 mm ID × 0,61 mm OD