骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

サマリー

骨再生をさまざまな階層レベルで評価するためのプロトコルを提案します。このマルチモーダル手法により、異なる長さスケールでの構造解析が可能となり、試料準備の課題に効果的に対処できます。また、骨再生促進におけるバイオマテリアルの効果を評価する信頼性の高いワークフローも提供しています。

要約

インプラントの臨床的成功は、骨修復を促進し、骨統合を促進する能力に大きく依存しています。新しい足場の設計において大きな進歩はありましたが、さまざまな骨長スケールでのインプラント成功率の徹底的な評価はまだ十分に研究されていません。骨は階層的に組織化された組織であり、ナノメートルおよびマイクロメートルスケールでのコラーゲン線維の組織と鉱化から、マクロな緻密で円序骨の配列まで複雑な構造を持っています。この階層的な組織は、骨の機能と機械的な性能を確保するために極めて重要です。この文脈では、複数の長さスケールで生体材料が骨修復に与える影響を包括的に評価することが、埋め込み材料の有効性と安全性を評価するために不可欠です。しかし、統合マルチモーダル解析のための試料準備には技術的な課題があります。本研究では、骨再生をさまざまな階層レベルで評価し、新たに形成された骨と埋め込まれた足場のインターフェースを解析するためのプロトコルを提示します。このアプローチは、骨修復誘導における足場の効果を評価するための堅牢な方法を提供します。選択された3Dおよび2D画像技術の組み合わせは、骨の治癒過程で形成される複雑な石灰化組織を適切に評価するために極めて重要です

概要

骨は複雑で階層的に組織された組織です ^1,2。その構造的組織を理解することは、細胞が組織構造にどのように寄与し、構造変化が^{機械的機能}にどのように影響するかという基本的な疑問に取り組むために不可欠です。この文脈において、損傷後の骨の再構築は研究の中心的なテーマとなっています。骨折治癒は複雑な多段階のプロセスであり、初期の炎症反応から始まり、その後血管新生、前駆細胞が軟骨細胞および骨芽細胞へと分化^します。生体材料が骨統合を刺激する役割については、特に生体適合性と繊維性被覆を防ぐ能力について多くの議論^{があります。}

生体材料刺激骨統合を評価するために一般的に採用されている方法の一つが光学顕微鏡であり、定量的および定性的組織学的解析を可能にします。このアプローチは骨インプラントの成功を評価する信頼性と効果的な方法であることが示されています^7,8。しかしながら、骨の階層的配列に関するいくつかの問題は、特に組織学^{的アプローチを}単一の画像診断手法で探ることはできず、少なくとも部分的には拡大率の制限があるためです。

三次元画像診断の進歩は、骨の階層的組織を理解する上で不可欠であることが証明されています。マイクロコンピュータ断層撮影(microCT;シンクロトロン放射または従来の実験室ベースのX線^源)9,10,11、スライス・アンド・ビュー断層撮影(12,13,14)および透過電子断層撮影(^15,16)に関連する二重ビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)などの技術は、多スケールの骨構造に関する新たな知見をもたらしました。

異なる3Dイメージング手法に基づき、骨の階層的組織モデルが提案され、当初は9つの異なる骨構造組織レベルを特定しました^。このスキームは最近、約12の階層レベルを包含するよう改訂・拡大されており、^骨組織の構造と機能の関係を探るための貴重な参考資料となっています^2,17。重要なのは、この提案された階層モデルが、損傷後の骨修復の成功を評価する基盤を提供していることです。再生骨組織が本来の階層構造を再現しているかどうかを評価することは、特に損傷部位に生体材料が使用される骨治癒の質を評価する重要な基準です。

骨の組織を調査するための複数の画像技術の利用については6^{、7、18、19、20}年に議論されていますが、異なる画像手法を統合して複数の空間スケールにわたる骨の組織を評価するワークフローについてはほとんど探求されていません。前述の通り、骨は有機相(細胞、コラーゲン、高分子)と鉱化マトリックスからなる複雑な複合組織です。試料準備の観点から見ると、この複雑さは試料を通じた溶媒の浸透、硬試料の断片化、同一試料に対する異なるイメージング戦略の統合に関する技術的課題をもたらします。

この研究の重要な革新は、三次元イメージングと補完的技術を用いた再現可能で相関的かつ多スケールのイメージングワークフローの確立です。 図1Aに示すように、ワークフローは同じサンプルを異なる画像手法で順次検査できるように設計されています。これらの技術の中には破壊的なものや断面化が必要なものもあるため、作業の流れは非破壊的な方法から始まり、切断や材料の除去を伴うアプローチへと進んでいきます。

このサンプル準備および分析のワークフローは、皮質骨や小梁骨、移植前の足場、移植後の骨と生体材料の界面評価など、硬質または鉱化された標本に広く適用可能です。異なる視野や解像度範囲にわたるイメージングモダリティを組み合わせることで(図1B)、センチメートルスケールからマイクロメートル、ナノメートルスケールまでのサンプルの分析が可能となります。シーケンスは単一の標本の相関解析をサポートするように最適化されていますが、各技術は実験目標に応じて独立して適用することも可能です。このアプローチにより、生体材料の骨統合の詳細な評価や治癒領域における再生骨成長の評価が可能になります。

プロトコル

このプロトコルで示された結果は、以前の研究で実施された実験的手法から得られた^ものです。すべての手続きは、ブラジルのフルミネンセ連邦大学における実験動物利用・ケアに関する倫理委員会(CEUA/UFF: 779)の倫理ガイドラインに従って実施されました。簡単に言えば、体重300〜400gのオスWistarラット20匹を、シャム植床とcHAマイクロスフィア着床の2つのグループにランダムに割り当てました。すべての動物は脛骨幹に2mmの欠損ができる手術を受けました。シャムグループは非重大な欠損の骨再生を評価するための血栓管理を担当し、実験グループは欠損部位にCHA37微小球を移植しました。7日目と21日目に、動物は全身麻酔の過剰投与で安楽死され、各グループおよび時期(7日および21日)から脛骨ブロックが採取されました。骨の質および新たに形成された骨の範囲は光学顕微鏡およびマイクロCTを用いて評価されました。

1. サンプル固定と樹脂埋め込み

1. 安楽死直後、埋め込まれた生体材料を含む脛骨を除去し、カルノフスキー固定液(2.5%グルターアルデヒド、4%ホルムアルデヒド、0.1 Mカコジルレート緩衝液)入ったバイアルに移します。サンプルは少なくとも1日間-4°Cで保存してください。
   注意:固定剤は揮発性物質への曝露を防ぐため、フームフードの下で準備・取り扱いしてください。すべての化学物質の取り扱いは適切な個人用保護具(PPE)を使用して行う必要があり、必要に応じて追加の技術的な安全対策を実施する必要があります。
2. フィクサーティブから0.1 Mカコジル酸バッファーを含むバイアルにサンプルを移します。サンプルを穏やかに回転させ、バッファーを10分ごとに2回交換します。この段階で、小さなノコギリでサンプルの縁をトリミングし、樹脂の浸透を容易にします。試料を切断する際は、乾燥を防ぐために0.1 Mのカコジレート緩衝液で湿らせておきましょう。
   注意:サンプルは常にサンプル体積の少なくとも2倍のバッファーに保管してください。このプロトコルで使用されるすべての溶液と樹脂については、このルールに従うべきです。上記の化学物質を扱う際は、排気フード内で作業し、適切なPPEを着用してください。固定液とカコジル化緩衝廃棄物は、明確にラベルが貼られた化学的に適合する容器に適切に装着されたキャップで収集してください。有害化学廃棄物の安全な保管および処分のための機関標準作業手順(SOP)を遵守してください。
3. 脱水プロセスを開始し、アセトンの濃度を徐々に増やして(10%、30%、50%、70%、90%、100%)を始めます。各濃度で30分間、サンプルを回転させ続けます。100%無水アセトンのステップを3回繰り返します。
   注意:アセトンを取り扱う際は、排気フード内で作業し、適切なPPEを着用してください。使用後は、残留溶媒を明確にラベル付けされ、化学的に適合する廃棄物容器に適切に装着されたキャップに集めます。有害化学廃棄物の安全な保管と処分のための機関の標準作業手順(SOP)を遵守してください。
4. スパーレジンを浸透させるには、サンプルを2:1、1:1、1:2の段階的なアセトン対樹脂比率で移し、最終的に純粋な樹脂に移行します。各ステップは12時間続き、室温で回転させて行うべきです。アセトンから樹脂への浸透を段階的に終えた後、純粋な樹脂を2倍交換します。最後に、純樹脂を含む型にサンプルを移し、70°Cで24時間重合します。
   注:樹脂はデータシートに従って中硬度を達成するために準備されました。スパーレジンを扱う際は、フルームフード内で作業し、適切なPPEを着用してください。使用後は、明確にラベル付けされた化学的に適合する廃棄物容器に残留物を収集し、適切に装着したキャップを装着してください。有害化学廃棄物の安全な保管と処分のための機関の標準作業手順(SOP)を遵守してください。

2. マイクロコンピュータX線断層撮影(microCT)を用いたサンプル可視化

注:マイクロCTはインプラントの位置と骨再生の評価に使用されます。また、さらなる分析のための関心領域を特定するのにも役立ちます。この工程はサンプルを樹脂に埋め込んで行うべきです。

1. 製造元から提供されたサンプルホルダーをベースに使い、スキャン中の動きを防ぐためにサンプルがしっかりと位置しないようにしましょう。支持には、発泡スチロール、ガーゼ、マイクロ遠心分離機管などの低密度材料を使用してください。
2. 以下の最適スキャンパラメータを用いて可視化します:管電圧/電流=60 kV/133 mA;角度ステップ = 0.33°;平均フレーム数=5;ボクセルサイズ=5μm;回転モード=180°。金属インプラントを含むサンプルには、360°回転させて0.5mmのアルミニウムフィルターを使用します。
   注:骨再生時、小梁状編成骨の厚さは通常、従来のマイクロCT画像診断の解像度範囲内です。小梁骨の従来の形態測定パラメータ(小梁の厚さ、間隔、数)を正確に定量化するためには、最小のボクセルサイズ(指定の5μm)を使用することが推奨されます。この標準解像度で視野角(ROI)が視野角(FOV)を超える場合は、まずマルチスキャン機能を使ってROIをタイル状にします。マルチスキャンでROIを捉えられない場合は、ボクセルサイズの拡大を最終手段として検討してください。
3. スキャン後、生の取得データは一連の番号付き画像ファイルで構成されます。製造元が提供するソフトウェアを使用して再構成を行い、試料の関心領域におけるアーティファクトの最小化に重点を置いてください。
   注:画像の境界線、特に解析されない領域で画像アーティファクトが見られることはよくあります。最終的なボリュームは、メーカーのソフトウェアを使ってこれらの領域をトリミングできます。
4. Avizo、VGStudio Max、CTVox、Dragonfly²²などの3D可視化ソフトウェアを使って再構築体積を分析します。デジタル画像フィルターを使ってアーティファクトを除去しましょう。この場合、非局所的手段のノイズ除去法を用い^{てください。}
   注意:非局所的とは、ノイズ除去フィルターの平滑化値をできるだけ低く保つべきであり、インターフェースの重要な詳細を妨げないようにするためです。

3. 光学顕微鏡のための試料準備

1. 実験目的に応じて試料の区切方向を選択します。脛骨は骨の長軸に沿って横断または縦方向に切断することができます。横断を用いて欠陥体積全体を覆う連続断面を作成します。縦断片は、長軸方向の骨再生を評価するのに適しています。しかし、この方法は欠陥の一つの断面のみを提供します。
   1. 低速ダイヤモンドソーディスクを使って、実験戦略に従いサンプルを1mmのスライスに分割します。
      注意:厚さ0.006インチから0.012インチのダイヤモンドディスクの使用が推奨されます。薄い刃は、刃の厚さによる材料損失を最小限に抑え、非常に正確な切断を可能にします。
   2. 液体のリザーバーに液体のレベルが刃の下端を覆うまで満たします。
      注意:蒸留水は骨サンプルに適しています。ただし、金属インプラントを含むサンプルなど、過剰な加熱が予想される場合は、機器メーカーが提供するオイルを使ってリザーバーを満たしてください。
   3. サンプルを検体ホルダーに固定し、計器アームに取り付けます。試料が円盤の表面に対して安定かつ水平であることを確認しましょう。位置調整ノブを使って、試料の切断領域をディスクに合わせて調整します。
   4. 試料を高回転(210〜250 RPM)で切断し、試料にへこみができるまで低圧をかけます。その後、速度を93〜124回転に落とし、セクションをスムーズに仕上げ、過度な振動を防ぎます。
   5. 切断が終わったらすぐにノコギリを止めてください。サンプルが元のブロックから外れた瞬間に切断が止まるよう、システムを適切に調整してください。
2. 立体顕微鏡でサンプルを調べてください。最初は低倍率(例:5倍〜10倍)で試料全体を調べ、次に倍率(例:20倍〜40倍)を上げて、科学的な質問に応じて関心のある領域を選択します。正確な倍率範囲は使用する機器によって異なります。本研究では、新たに形成された骨と生体材料の間に界面密度が高い領域を選定し、さらなる解析を行いました。
3. 薄めのための試料取り付け
   1. 研磨時に適切な取り扱いをしやすくするために、サンプルを支持体に取り付けてください。試料が光学顕微鏡分析のみを目的とする場合は、事前に研磨された面に瞬間接着剤で直接プラスチックのカバースリップを貼り付けます。
      注意:接着力が良いプラスチック製スライドの使用が推奨されます。ガラススライドも使用可能です(中性石鹸でしっかり洗った後)。しかし、ガラススライドは研磨中のサンプル剥離リスクを高めます。
   2. 相関分析法でさらに分析される試料は、2部構成のアルミニウムチューブアセンブリに取り付けます。このプロトコルでは、直径2.5cmの内側の固体円筒と、研磨時に機械的支えを提供する外側の中空円筒からなる自作のアルミニウム管アセンブリが開発されました。試料は内側の固体シリンダーに取り付けられます。
   3. 内側のアルミニウムシリンダーをホットプレートに置き、ワックスを溶かすのに適した温度(通常は使用されるワックスの種類によりますが約60〜70°C)まで加熱します。
      注意:蜂蝋も適しています。ワックスの取り付け作業は、排気フード内で作業し、適切なPPEを着用してください。使用後は、明確にラベル表示された化学的に適合する廃棄物容器に残渣を収集し、適切に装着されたキャップを装着してください。有害化学廃棄物の安全な保管と処分のための機関の標準作業手順(SOP)を遵守してください。
   4. シリンダーの表面に少量のワックスを塗り、完全に溶かします。
   5. 溶けたら、目的の表面のサンプルをワックスコーティングされた表面に置き、優しく押し当てて完全に接触させます。
      注意:対象の表面はシリンダー面に向かっているべきで、薄化は反対側で行われます。過剰なワックスの使用は避けてください。これは取り付けの不均一な原因となり、研磨品質に影響を与える可能性があります。
   6. シリンダーをホットプレートから外し、室温でワックスを固めるまで待ちます。
4. 研磨中の試料厚さの監視
   1. 研磨過程中の試料厚さを監視するには、低倍率から中倍率(例:10倍〜20倍)の反射顕微鏡を用いてください。顕微鏡の校正と試料厚さ測定を示す図は 図2に示されています。
   2. 標準的なカバースリップ(通常厚さ約150μm)で顕微鏡Z軸を校正します。カバースリップの片側に赤い永久マーカーで印をつけ、反対側の隣接する部分に青いマーカーで印をつけます。カバースリップをガラススライドに取り付けます。
   3. ファインフォーカスノブとマイクロメートルスケールを使い、まずカバースリップの底面にピントを合わせ、次に上面に焦点を合わせます。
   4. Z変位の値を記録してください。この値はカバースリップ厚さ(約150μm)に対応し、基準となります。
   5. 試料を研磨する際は、アルミニウムシリンダーから試料を取り出さずに試料の厚さを推定するために、定期的にこのZ軸キャリブレーションを用いてください。
      注:この技術により、研磨中の厚さの迅速かつ非破壊的な推定が可能です。または、サンプルをマウントから取り外し、デジタルノギスやマイクロメーターで測定することもできます。
5. 薄めると研磨
   1. 粗研磨と中間研磨を始め、1200、2500、4100の研磨を用います。この工程の目的は、試料の厚さを約0.15mmに減らしつつ、顕著な表面不規則性を除去することです。
   2. まずは1200番のサンドペーパーから始め、次に2500番に進めていきます。この過程では軽い圧力をかけてください。研磨中は反射顕微鏡で定期的に試料の厚さを監視してください。
   3. 希望の厚さが得られたら、4100番のサンドペーパーで試料の両面を研磨します。研磨は手動または低回転に設定した半自動研磨機で行うことができます。研磨の各工程では、試料を蒸留水で継続的に徹底的に洗浄してください。
      注意:研磨中はサンプルやサンドペーパーを湿らせておくことで熱を抑え、粗いサンドペーパーによる表面汚染を防ぐことができます。
   4. 最終研磨には、研磨ディスクに取り付けられたフェルト研磨クロスに少量のダイヤモンドペースト(例:6μmまたは3μm)を塗布します。試料の表面粗さに応じてダイヤモンドペーストの粒子サイズを選択します。
      注:6μmペーストは予備的な微細研磨に適しており、最終ミラー研磨には3μmペーストが推奨されます。可能な限り、両方のペーストを順番に使うと最良の結果が得られます。それでも、6μmペーストだけで満足のいく研磨が可能です。
   5. 最小限の圧力でサンプルの両面を優しく研磨します。顕微鏡検査前に、圧縮空気または綿を使って試料の研磨面を乾燥させます。
   6. 試料をシリンダーから外すには、熱板でワックスを温め、無水アセトンでサンプルの残留ワックスを除去します。
      注意:ワックスや無水アセトンの取り付け作業は、フムフード内で作業し、適切なPPEを着用してください。使用後は、明確にラベル表示された化学的に適合する廃棄物容器に残渣を収集し、適切に装着されたキャップを装着してください。有害化学廃棄物の安全な保管と処分のための機関の標準作業手順(SOP)を遵守してください。
   7. サンプルを浸漬油を装着媒体としてガラススライドとカバースリップの間に取り付け、偏光顕微鏡でコラーゲン繊維の配向を評価します。試料を調査するためには低倍率(例:5倍〜10倍)から始め、中倍率(例:20倍〜40倍)に増やして、電子顕微鏡を用いたさらなる探査可能な領域を特定します。
      注意:相関作業と走査型電子顕微鏡による試料の分析を進めるには、試料を密封しないことが推奨されます。

4. 走査型電子顕微鏡のための試料準備

1. スライス・アンド・ビュー断層撮影は、連続番号が付けられた一連の画像を生成します。アライメントを進めるには、系列をMRCファイル(一般にスタックと呼ばれる)に変換します。
2. IMODソフトウェアを使用してMRCファイル生成および画像スタックのアライメントを行います。
   注:AvizoやFIJI/ImageJなど他のソフトウェアもスタックアライメントプラグインを提供しています。詳細なガイダンスについては、各ソフトウェア固有のドキュメントを参照してください。さらに、Peddieらの研究(²³.スタックアライメント時に採用されたアプローチの概要を提供します。
3. MRCファイルを生成するには、ターミナルまたはコマンドプロンプトを開き、画像シーケンスを含むフォルダに移動し、次のコマンドを実行します:tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
   1. TIFFフォーマットでない画像の場合は、代わりにraw2mrcを使ってください。-g(例:tif2mrc -g)を加えると、24ビットのRGB画像を8ビットグレースケールに変換できます。これにより計算時間が大幅に短縮されます。
4. ターミナルからEtomoを起動し、「 Align Serial Sections(シリアルセクションの整合)」オプションを選択してください。スタックを揃える手順に従ってください:(1) 未揃いのスタックを1つのフレームに読み込む。(2) 初期自動アライメントを使ったAlginタブ。(3) Make Aligned Stackを使ってスタックタブを作成し、そのアライン済みスタックを開きます。
   注:このプロセスはスタックサイズやシステムのパフォーマンスによって数分かかる場合があります。
5. 完成したら、結果を見直しましょう。アラインされたスタックファイルはstackname_ali.mrcと名付けられます。
   注意:この手順はスタックアライメントのシステムのデフォルト設定を使用しています。ただし、初期アライメントや最終スタック生成に関するパラメータは、ユーザーの好みに応じて変更可能です。詳細な指針については、IMODのドキュメントを参照してください:https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html。
6. Avizoソフトウェアを使って追加の画像フィルタリングを行います。アラインドスタックを開き、以下のフィルターを順次適用します:Fast Fourier transform(FFT)フィルター(Sandbox Filterプラグインで利用可能)(縦ストライプ向き、許容値:2のオプションを選択)、シェーディング補正ウィザード(画像のシャドウ全域をカバーするマスク選択、正規化係数100を使用)、ヒストグラムイコライゼーション(デフォルト設定)、非局所手段(値を5; 0.1; 10; 3に調整)。
   注:同等のフィルターは他の画像解析ソフトウェアでも利用可能です。FIJI/ImageJでは、以下の手順を推奨します:FFTフィルター、背景除去、局所コントラスト強化(CLAHE)、非局所平均フィルター。
7. ソフトウェアを使った画像のセグメント化と3Dレンダリングに進みます。手動セグメンテーションや閾値ベースのセグメンテーションなど、さまざまなセグメンテーション戦略が利用可能です。ウォーターシェッドアルゴリズムなどの追加ツールは、プロセスを自動化し、セグメンテーションに必要な時間を短縮するのに役立ちます。

6. 透過電子顕微鏡のための試料準備

1. 骨と生体材料の界面を評価するために、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)を用いてラメラを準備します。
   注:本研究のように、埋め込まれた生体材料がセラミックや金属でない場合、透過電子顕微鏡(TEM)に適した超薄片をウルトラミクロトームで準備することができます。しかし、鉱物化した材料の断片処理はダイヤモンドナイフの寿命を大幅に短化させることに注意が必要です。
2. 超薄片を5%酢酸ウラニルの水溶液で20分間染色します。
   注意:ウラニル酢酸を扱う際は、排気フード内で作業し、適切なPPEを着用してください。使用後は、残留溶媒を明確にラベル表示された化学的適合性のある廃棄物容器に、適切に装着されたキャップに回収してください。有害化学廃棄物の安全な保管と処分のための機関の標準作業手順(SOP)を遵守してください。
3. TEMを使って断面を解析します。包括的な解析のためには、画像処理と選択面電子回折(SAED)、エネルギー分散X線分光法(EDS)、電子断層撮影を組み合わせることが推奨されます。

結果

樹脂埋め込みサンプルの初期解析はマイクロコンピュータ断層撮影(microCT)を用いて行われます。この非破壊技術により、欠陥領域全体の3D可視化が可能となり、試料の定量的および定性的分析の両方が可能になります。microCTイメージングにおけるコントラストは主に試料中の材料の密度差に由来します。図1は、CHA37バイオマテリアルを埋め込みたラット脛骨の非臨界欠損のmicroCT解析を示しています。サンプルは移植後12週間に採取され、前述の樹脂埋め込みプロトコルに従って準備されました。microCT解析により、サンプルの内部構造を明らかにする3Dモデル(図3A-B)が得られ、骨、生体材料、樹脂、新たに形成された骨の区別が可能になりました(図3C-D)。体積、物質...

ディスカッション

重要なのは、microCTで得られる小梁骨のパラメータ、例えば小梁厚や小梁間角度は、機械的検査結果との相関モデルを確立するための貴重なデータ^である。これまでの研究では、microCT由来の体積情報を有限要素解析と統合し、骨折タコ組織の力学的特性を推定することに成功し、骨折治癒研究における有用性が示されています(27,28,29,30)。さらに、Reznikovらの最近の研究は、小柄間角度の定量化が小柄微構造と正常機関^車機能の関係に重要な洞察をもたらすことを示しました。小梁間角に関するパラメータは、後にナノ構造化されたcHA/アルギン酸微小球の有無における骨再生の評価...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトン	メルク	67-64-1
アルミニウムシリンダー	自家製	該当なし
Avizo バージョン 2022.1	サーモフィッシャー	該当なし	画像フィルタリング、セグメンテーション、3D可視化のためのソフトウェア
カコジル酸、ナトリウムソルト、三水和物	テッド・ペラ	18851	カコジル酸バッファー用の粉末。0.2 Mのストック溶液を準備します
ダイヤモンド研磨コンパウンド3&マイクロ;Mサイズ	テッド・ペラ	895-8
ダイヤモンド研磨コンパウンド6およびマイクロ;Mサイズ	テッド・ペラ	895-9
ダイヤモンドホイール x.006	サウスベイ・テクノロジー	DWH 3063
ダイヤモンドホイール x.012	サウスベイ・テクノロジー	DWH 4122
フェルトの磨き布	テッド・ペラ	816-20
平らな埋め込みカプセル	EMS	70021
ガラスカバースリップ	ニッテル	該当なし
ガラススライド	ニッテル	該当なし
グルターアルデヒド、25%EMグレード	テッド・ペラ	18426/18427
ゴールドスパッター K550X	エミテック	該当なし
イメージJ	国立衛生研究所(NIH)		画像処理、フィルタリング、セグメンテーション、3D可視化のためのソフトウェア
IMODバージョン5.1	コロラド大学		画像分割、セグメント化、3D可視化のためのソフトウェア
研磨機	サウスベイ・テクノロジー	モデル910
低速ダイヤモンドホイールソー;	サウスベイ・テクノロジー	モデル650
低粘度埋め込みキット	EMS	14300	SPURR樹脂用のキット。データシートの仕様に従って準備してください。
マイクロCTスカイスキャン1273	ブルーカー	該当なし
顕微鏡 Jeol 2100F 200kV	ジェル	該当なし
顕微鏡オリンパスBX51	オリンポス	該当なし
顕微鏡テスカンライラ3	テスキャン	該当なし
顕微鏡ツァイス公理図	ツァイス	該当なし	一等ラムダプレートを装備
パラホルムアルデヒド、EMグレード	シグマ	P6148	ホルムアルデヒド溶液用の粉末。16%のストック溶液を準備してください
プラスチックスライド	エクザクト	41500
QuickStick 135 マウントワックス	サウスベイ・テクノロジー	該当なし
サンドペーパー 粒径 1200	該当なし	該当なし
サンドペーパー 粒径 2500	該当なし	該当なし
サンドペーパー 粒径4100	該当なし	該当なし
瞬間接着剤	ロックタイト	該当なし
水溶性クーラント	サウスベイ・テクノロジー	該当なし
ワットマングレード1のろ紙	シグマ	WHA1001150