新生マウス卵巣培養と全マウント卵胞定量化:原始卵胞調節を研究するための効率的な in vitro アプローチ

サマリー

本研究は、膜挿入を用いた出生後マウス卵巣の培養および卵巣全体の全マウント濾胞定量のためのプロトコルを提示します。結果は、卵巣培養における技術的取り扱いが原始卵胞数に大きな影響を与えることを示し、非生物学的変異を最小限に抑えるために一貫性を維持する重要性を強調しました。

要約

雌の哺乳類では、胎児卵巣の発育中に原始卵胞が形成され、成体の卵巣機能を維持する唯一の供給源となっています。原始卵胞がどのように組み立てられ、休眠状態を維持し、卵胞の発生を活性化し、細胞死を遂げるかのメカニズムは、卵巣の生理学や病理学的状態を理解する上で重要です。本研究は、出生後のマウス卵巣を膜挿入で培養するプロトコルを提示しており、これは卵巣の発生段階に応じて最大10日間、未開の卵巣を培養し薬剤治療を行う方法です。培養条件の変化は、培養卵巣を含む挿入物をプレート上のウェル間で移動させることで実現でき、培養中の組織への物理的干渉を避けることができます。P5卵巣は単離され、24ウェルプレートの12mmインサートで培養されました。各卵巣はDMEM/F12培地の液滴内に分離され、10% FBS、3 mg/mL BSA、10 mIU/mL FSH、抗生物質・抗菌剤を補足し、膜挿入部で優しく安定化しました。培地は2日ごとに交換され、培養は合計5日間維持されました。培養後、卵巣は4%パラホルムアルデヒドに2時間固定され、卵母細胞マーカーDDX4の全マウント抗体染色のために処理されました。卵胞は卵母細胞の大きさと体細胞の核形態に基づいて段階的に分類・定量化されました。結果は、各卵巣の原始卵胞の数が膜挿入部への組織の適切な配置によって有意に影響を受けることを示しました。さらに、各挿入物の卵巣数の違いは生物学的でない変異をもたらす可能性があるため避けるべきです。

概要

卵形成は高度に制御された複雑なプロセスであり、成熟した卵母細胞の産生をもたらします。哺乳類では、卵形成は胎児卵巣で始まり、原始生殖細胞(PGCs)が一次卵母細胞へと分化します。各一次卵母細胞は扁平状の前顆粒状細胞の層に包まれており、原初卵胞を形成しています。これらの原始性卵胞の多くは形成後に休眠状態となり、卵巣予備役として機能^します。成人卵巣では、卵胞発生のための初期卵胞の周期的な活性化(卵胞形成)が成熟卵母細胞と卵巣ステロイドホルモンの産生維持に^{不可欠です。}活性化信号がない場合、人間の原始卵胞は最大50年間静止状態を保つことができます。長期休眠は卵母細胞の質の低下や、加齢卵巣における原初卵胞の減少率の増加に寄与する可能性があります⁶。特定の濾胞プールが活性化される一方で、他の濾胞は静止状態を保ち周期的に細胞死を経験するメカニズムは未解決のままです。

卵形成の過程は哺乳類で非常に保存されており、マウスは哺乳類卵形成を研究する理想的なモデル^{となっています。}マウスでは、原始卵胞形成は出生後4日目(P4)までに完了します。原始卵胞のごく一部は形成直後に卵胞の発生を経験します。卵胞の発生中、卵母細胞は器官形成の強化とmRNAおよびタンパク質合成によりサイズが大きく^{なります。}扁平上顆粒細胞は立方体顆粒細胞に移行し、増殖性を持つようになります^。これらの発達中の卵胞は約21日目に発達し、メスのマウスは思春期に入ります。この出生後卵巣の卵胞発生段階は、一般に「第一波卵胞形成」と呼ばれます。第一波卵胞形成は卵胞の発生過程に密接に似ているため、出生後のマウス卵巣は原始卵胞の調節や卵巣の卵胞形成を研究する理想的なモデル^{を提供します。}

卵巣卵胞の分類は主に卵胞体細胞の核形態と卵母細胞の大きさに基づいています。マウスの卵巣では、休眠中の原初卵胞は直径約20μmの一次卵母細胞を包む扁平状の前顆粒状細胞の単層によって識別されます。発育中の卵胞は、一次、二次、三次、そしてアントラルの卵胞に分類されます。一次卵胞には直径通常25μmを超える卵母細胞が含まれ、その周囲は一層の立方状顆粒状細胞に囲まれています(補足図1)。二次卵胞は2層の顆粒状細胞を持ち、三次卵胞は3層以上の顆粒状細胞から成ります。門胞は三次卵胞よりも大きく、複数の肉芽丸細胞層を含み、小胞と呼ばれる液体で満たされた空洞を持っています。卵胞が発達するにつれて卵母細胞は大きくなり、排卵時には約80μmに達します。さらに、発育中の卵胞は薄いテカ細胞の複数の層に囲まれており、これらは顆粒細胞の外側に位置しています。10,11,12。

出生後マウスの卵巣の比較的小さいサイズは、全卵巣培養を研究に実用的なアプローチとしています。この方法は、物理的および生理的な微小環境を保存しつつ、周囲組織からの干渉を最小限に抑えることで、卵巣および卵胞の発生を効果的に研究することを可能にします¹²。このアプローチにより、in vivoモデルでは実施が難しい実験が可能になります。例としては、卵巣発生のライブ画像診断、時間制御型多剤治療、培養培地のタンパク質プロファイリングによる卵巣分泌活動の分析などがあります^13,14。さらに、このアプローチは、細胞間直接的な相互作用を伴わない分泌因子の効果を共培養実験を通じて調査するために応用可能です。これらの実験では、異なる種類の組織を共有培地内の別々の膜挿入部に配置^{することができます。}さらに、条件付き遺伝子ノックアウトマウス卵巣をin vitroで用いることで、原初卵胞の活性化と成長に関わる重要なメカニズムの解明に役立つ可能性があります。

本記事では、膜挿入を用いた出生後マウス卵巣の培養方法と、卵巣全体の全マウント濾胞定量方法(図1)を紹介します。ここで述べる技術には、1) 新生マウス卵巣の解離、2) 新生マウス卵巣の培養、3) 培養中の培地変化、4) 組織固定および全マウント抗体染色、5) 組織画像診断および卵胞定量が含まれます。さらに、本研究ではドキソルビシンを用いて原始性卵胞の喪失を実験的に誘導し、卵巣予備の減少メカニズムを調査するモデルを提供しました。結果は、挿入物あたりの卵巣数と培養中の挿入物内の位置が原始卵胞数に影響を与えることを示しました。これは、実験結果に非生物学的な変動を防ぐために一貫した培養環境を維持する重要性を強調しています。

プロトコル

CD-1のオスとメスのマウスは、1:1の比率で繁殖ペアとして一緒に飼育されました。新しい子の誕生日は出生後0日目と指定されました。すべての動物実験はミズーリ大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル番号:36647)。

1. 試薬と培養メディア

1. 本研究で使用されるすべての試薬は 材料表に記載されています。卵巣培養前にすべての材料と培地を準備してください。
2. 培養培地:DMEM/F-12培地~5mLに3 mg/mLの牛血清アルブミン(BSA)、10%の胎児用牛血清(FBS)、10 mIU/mLの卵胞刺激ホルモン(FSH)を補足します。
   注意:培地はDMEM/F-12培地にBSA(30 mg/mL)、FBS、FSHストック(10 IU/mL)を加えて新たに調製する必要があります。培地をペトリ皿で37°Cの5%_CO2 インキュベーターで約30分間平衡させます。 ストックは-20°Cで保存し、使用直前に解凍してください。在庫を適切な量でアリコート処理し、繰り返し凍結と解凍を避けましょう。

2. 卵巣栽培

1. P5メスのマウスは首を切断して安楽死させてください。卵巣と付着した滑液包組織を外科用ハサミと鉗子で切除します。卵巣を60mmのペトリ皿に入れ、抗生物質・抗菌剤を含む事前に冷却したドゥルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を浸します(図2A,B)。
2. インスリン注射器2本(1 mL)を用いて、立体鏡で卵巣から滑液包を剥離・摘出します(図2C,D)。卵巣を1 mLピペットで30 mmのペトリ皿に移し、培養培地3 mLを含み、その皿を_CO2インキュベーターに入れます。
   注意:卵巣をつついたり絞ったりしないでください。インスリン注射器を使って卵巣滑液包に清潔で均一な切開を行い、卵巣を解放します。ピペットチップに約50μLの培地を充填し、卵巣の隣に置いてから先端に吸引して移送します。
3. 層流フードの下で、各ウェルに400μLの媒体とインサートを置いてプレートを準備します(図2E,E')。メディアはインサートの外側にあり、インサートの膜はメディアに浸されると不透明になります。
4. 24時間ドックス処理の培養では、ドックスストック(10 mg/mL)を希釈して新たに0.1 mg/mL濃度のドックスを含む培地を準備します。
   注:ドックスを含むメディアは、バイオセーフティおよび環境衛生安全に関する機関委員会のガイドラインに従って適切に処分されるべきです。
5. ステレオスコープ下で、1mLピペットを使って最大3つの卵巣を挿入挿入体に移します(図2F,G)。インサートに移動するメディアの量を最小限に抑え、余分なメディアはすぐに取り除きましょう。卵巣を優しく挿入セットに入れたら、200μLピペットを使ってウェルから約200μLの培地をインサートに移し、膜が培地で完全に覆われていることを確認します。培地をウェルに戻し、卵巣を膜の中心に置きます。ピペットの先端に培養培地を入れて、中心に置くときに卵巣が先端に吸い込まれるのを防ぎます。卵巣間には十分なスペースを残し、卵巣が培地内に懸浮したままではなく、膜挿入部(図2H)上で安定化されているようにしてください(図2I)。卵巣や卵膜を突かないように注意してください。
6. 5日間の培養では、2日ごとに培地を交換し、ウェルから200μL(総量の半分)を除去し、200μLの新鮮培地を再びウェルに加えます(図2J)。
7. 24時間薬物処理の培養では、最初の24時間後に卵巣入りの挿入物を新しいウェルに400μLの新鮮培地を移し、以下の手順を用います。
   1. 卵巣を含む挿入物を鉗子でウェルから取り出します。
   2. インサートの底を60mmの皿に新鮮な培養液で浸して軽くすすぎます。
   3. インサートの底を空の60mm皿に軽く叩き、余分なメディアを取り除きます。インサートを新鮮な培養培地と一緒にウェルに入れます。
      注意:インサートから余分な培地を取り除き、卵巣が膜上で安定しているか確認してください。培地交換や移植直後です。

3. 固定および全額免疫染色

1. 培養卵巣を固定するには、鉗子を使ってインサートをプレートから取り出し、5mLのDPBSを入れた60mmペトリ皿に入れます。卵巣の隣に約100μLのDPBSを移し、1mLピペットで再懸濁させます。
2. 1 mLピペットを使い、挿入液から1.5 mLのエッペンドルフ管に卵巣を移します。チューブからDPBSを取り出し、4%パラホルマルデヒド500μLを加えます。卵巣を4°Cに2時間固定します。
   注意:卵巣が大きすぎて通れない場合は、ピペット先端を組織を損傷しないように幅を広げる必要がある場合があります。
3. 固定された卵巣をPBST₂ (PBS、0.1%トゥイーン[v/v]、0.5%トライトン[v/v])で少なくとも3回、各1時間、回転式シェイカーで洗います。抗体浸透を促進するために、PBST₂ の組織を4°Cで12〜16時間放置することが推奨されます。
   注意:これは途中の一時点となり得ます;組織は一次抗体培養の最大3日前までPBST₂ に保存されることがあります。
4. 卵巣を抗デッドボックスヘリカーゼ4(DDX4)を抗体希釈バッファー100μL(1% BSA [w/v]、10% Donkey serum [v/v]、0.1 M グリシン、0.1% Tween、0.5% Triton in PBS)で、1/400(2.3 μg/mL)希釈液、4°Cで12〜16時間培養します。
5. 翌日、一次抗体を除去し、チューブにPBST₂ を1mL追加します。ティッシュは少なくとも3回、1時間ずつ回転式シェイカーで洗います。
   注意:これは途中の一時点となり得ます;組織は一次抗体培養後最大3日間PBST₂ に留まることがあります。
6. 二次抗体であるロバ抗ウサギAF488をPBST₂中に1/500希釈(1.5 μg/mL)で希釈します。薄めた二次抗体100μL以上を4°Cで12〜16時間培養します。
7. 翌日は、回転式シェーカーでPBST₂ で少なくとも3回、1時間ずつ徹底的に洗います_。 背景を減らすために、組織を最大8時間洗うことが推奨されます。この段階で光からチューブを守るために、必ずホイルで覆ってください。
8. PBST₂ を除去し、PBS中1/1000(1 μg/mL)希釈したDAPIを100 μLを加えます。組織を室温でDAPIで30分間培養します。
9. 卵巣をPBST₂ で30分間一度洗い、顕微鏡スライドにイメージングスペーサーを付けて取り付けます。1mLピペットを使って卵巣をスペーサーの中心に移し、余分なPBST₂を除去します。約5μLのアンチフェードマウント培地を加え、スペーサーの上に顕微鏡スライドを置きます。スペーサーの縁は透明なネイルポリッシュで密閉し、長期保管用にしましょう。
   注意:スライドを撮影する前に、ネイルポリッシュが完全に乾いていること、カバースリップの外側に取り付け媒体がないことを確認してください。これらの試薬は顕微鏡の対物レンズを損傷する可能性があります。また、画像診断中は卵巣を固定しておく必要があるため、過剰なマウントメディアの使用は避けてください。
10. 共焦点顕微鏡で10倍倍、Zステップサイズ10μmで卵巣を画像化します。設定を調整し、Z補正(励起ゲイン)を使って卵巣全体を撮影します。これは以下の手順で行えます:
    1. ヒストグラムを使って信号飽和度をモニターし、刺激出力と検出器利得を調整してください。組織によって異なる場合があります。最初は低出力から始め、必要に応じて徐々に増やしていきます。
    2. より深い領域を撮像する場合は、信号強度が深さとともに低下する可能性があるため、ゲイン検出器のZ補正を有効にしてください。フレーム平均を少なくとも10にし、600Hzの速度で双方向Xスキャンを有効にします。
       注意:これらの設定では、画像撮影時間は卵巣あたり10分(~200μm)を超えてはいけません。卵巣の全マウント免疫蛍光染色は抗DDX4を用い、通常は頑丈で光漂白は稀です。

4. 卵胞の定量化

1. 各卵巣の卵胞を定量化するには、ImageJソフトウェアで画像を開きます。開く際は、カラーモードが カラー化 されているか、チャンネル 分割 の欄でチャンネル分割がチェックされているか確認 してください。興味のある画像を選択し、 画像/変換/回転 ツールを使って子房を画像内で対称に配置します。
   注:共焦点で取得した画像は、Imarisソフトウェア(図3A,B)またはImageJソフトウェア¹⁶を使って3Dで閲覧・解析可能です。
2. 解析/ツール/グリッドツールを使って子房をグリッドに分割してください(図3C、C')。
3. プラグイン/解析/セルカウンターツールを使って、卵巣を覆うすべてのグリッドにマークしてください(図3D、D'、グリッド4で示されています)。これらのグリッドのうち、各行の他のすべてのグリッドに卵胞の定量化を印付けします(図3E、E'、グリッドは8で示されています)。卵巣の縁にある卵母細胞が10未満の格子は卵胞定量には含まれません。
   注意: セルカウンター を初期化し、読みやすいと思う カウンタータイプ を選びましょう。
4. 卵母細胞は、DAPI陽性の核を囲むDDX4陽性のリング状構造の存在によって識別できます。原始卵胞は直径約20μmの卵母細胞を持ち、扁平状体細胞に囲まれています。発育中の卵胞は直径25μmを超え、1層以上の立方形顆粒細胞に囲まれています(補足図1)。
5. 各マーキンググリッドの原始毛包を数えます( 図3E、E' とカウンタータイプ8参照)。卵胞をグリッド内の光学断片やスタックで確認し、それぞれ細胞カウンターツールでマーキングしてください。連続した2回の眼科切片やスタックで、原初卵胞を二重にカウントしないように注意してください。カウンター4で示されたすべてのグリッドで発育中の卵胞を数えてください。
   注意: ズーム 機能を使って、卵母細胞を積み重ねて数えるのを視覚化し、数えましょう。
6. 卵巣全体の原始卵胞の数(nf)は、1格あたりの平均原卵胞数(nfgrid)に子房を囲む格子数(nグリッド)を掛けて計算します。 nf = ngrid s × nf グリッド。
   注:統計解析が行われ、グラフはPrism 10.2.0ソフトウェア(GraphPad Software、バージョン10、Inc.、CA)を使用して作成されました。グループ間の差異は一方向分散分析(ANOVA)を用いて評価され、その後Tukeyの多重比較検定を用いました。統計的有意性はp < 0.05で考慮されました。データは標準誤差(SE)±平均として提示されます。

結果

本記事では、新生児卵巣培養、全額免疫染色、共焦点画像診断、卵胞定量化の方法を紹介し、培養中の挿入部分内の卵巣の数と位置が実験結果、特に卵巣内の卵胞数に影響を与えるかどうかを評価します。卵巣を培養したのは、安定培養の場合は1個、2個、または3個の卵巣、浮遊培養の場合は1つの挿入につき3個の卵巣です。卵巣は2つの条件下で培養されました。1つは対照群、または24時間のDox投与で0.1 μg/mLの薬物治療群です。培養24時間後、対照群とDox処理群の両方の卵巣を新鮮培地に切り替え、さらに4日間の培養を行いました。

対照培養法で安定化培養法を用いて培養した卵巣のうち、平均して1つの卵巣培養群は原初卵胞が多く、3卵巣群は原始卵胞が少なかったことがわかりました。しかし、3つのグループ間で有意な差は認められませんでした。特に、浮遊培養法で培養された3子房群は、4つの培養条件すべての中で原始卵胞の数が最も少なかったことが注目されます。しかし、安定化法と浮遊法で培養した三卵巣では有意な差は観察されませんでした(図4A、B、...

ディスカッション

本研究では、新生マウスの卵巣培養および全マウント卵巣卵胞定量の方法を示しました。培養アプローチは、生前および初期発育中の卵胞を体外で維持することができます。ホールマウント卵胞定量法は最小限の組織処理で済み、時間の節約と組織の完全性を維持し、正確な卵胞定量を保証します。

対照群で観察された原始卵胞の数は、出生後10日目の卵巣で文献で報告された卵胞数(約4,300個)と比べてわずかに減少しているものの、結果は依然として^{比較可能な17}個であることを示唆しています。この減少は、in vitro培養の条件がin vivoの条件と比べて最適でないためと考えられます。原始卵胞に加え、培養卵巣では一次、二次、三次卵胞を含む発育中の卵胞が観察されました。この観察は、出生後10日目のCD1卵巣で報告される卵胞形成と一致しており、培養アプローチが卵胞の発育を効果的に支援できることを示しています^。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェル細胞培養プレート	フィッシャー・サイエンティフィック	09-761-146
アレクサ・フルア・フルー488 ドンキー・アンチ・ラビット	ジャクソン免疫研究所	711-546-152
アンチ・アンチ(100X)	ギブコ	15240-062
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A1470-25G
CD-1 IGSマウス	チャールズリバー研究所	022	ネズミ
細胞培養挿入	ミリポール	PICM01250
コンフォートポイントインスリン注射器(針付き)1cc 28G x 1/2	エクセル	26027
ダピ	サーモ・サイエンティフィック	62248
DDX4ウサギmAb	アブカム	AB13840
DMEM/F12(1:1)(1X)	ギブコ	11320-033
ドキソルビシン塩酸塩および	シグマ・オルドリッチ	PHR1789
DPBS(1回)	ギブコ	14190-144
胎児用牛血清	シグマ・オルドリッチ	F0926-500ML
フィジー-イメージJ	NIH、アメリカ(https://imagej.net/ij/ 年)	ImageJ 1.52p
フィッシャーブランド ナテーティングミキサー - 可変速	フィッシャー・サイエンティフィック	88-861-043	シェイカー
卵胞刺激ホルモン	シグマ・オルドリッチ	F4021-10UG
フォーマ・ステリサイクル i160	サーモ・サイエンティフィック&トレード;	i160	CO2インキュベーター
グリシン	フィッシャー・サイエンティフィック	BP381-500
イマリス	オックスフォード・インスツルメンツ(https://imaris.oxinst.com/)	イマリス 10.2
ライカ TCS SP8	ライカ・マイクロシステムズ	SN 8100001409	共焦点
ノーマル・ドンキー血清	ジャクソン免疫研究所	017-000-121
オリンパス SZ61	オリンパス顕微鏡	SZ61	ステレオスコープ
パラホルムアルデヒド	フィッシャー・サイエンティフィック	15714
SecureSealイメージングスペーサー	グレース・バイオラボ	654002
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	X100-500ML
20時	シグマ・オルドリッチ	P1379-500ML
VECTASHIELD アンチフェードマウントメディア	ベクター研究所	H-1000