本研究は、同一プレート上で糸口毒性試験と解糖系ストレス試験を同時にリアルタイム代謝解析を行うための最適化されたプロトコルを提示します。これらの手技は、付着型(BMDM)細胞と非付着型(リンパ球)細胞の両方に対応しており、対象細胞のミトコンドリアおよび解糖系機能の正確かつ再現性のある評価を可能にします。
この記事について
サマリー
要約
リアルタイム代謝解析により、ミトコンドリア呼吸および解糖系のラベルなし測定が可能となり、研究者は細胞エネルギー代謝と疾患メカニズム、治療応答を多様な分野で結びつけることができます。異なるマウス、他の動物、人間、または異なる処理下の細胞間でのエネルギー代謝を比較する際は、正確かつ信頼性の高い結果を得るために、単一のランで測定を行うことが重要です。さらに、実験設計では分析対象の細胞タイプ、例えば骨髄由来マクロファージ(BMDM)のような接着性か、リンパ球のように非付着性かも考慮しなければなりません。そのため、異なる薬剤注入や分析プログラムを必要とするアッセイにおいて、同じプレート上で糸口ストレス試験と解糖ストレス試験を同時に実施できるプロトコルが開発されました。高度に付着性の高い細胞(例:BMDM)と非付着性の「浮遊」細胞(例:T細胞やその他のリンパ球)の分析に最適化された別の取り扱いプロトコルが設計されました。ここでは、これらのアッセイを効率的かつ再現性に実施するための詳細なプロトコルを提示します。
概要
シーホースXFアナライザーは、多くの細胞型におけるミトコンドリア呼吸および解糖系のリアルタイム測定を可能にする独自の機器です。酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)を同時に定量化することで、生理的またはストレス条件下での生体エネルギー経路の精密解析を可能にします。その多様性により、がん1、神経科学2、免疫学3、老化3、4、5、創薬6など、代謝再プログラミングが疾患進行や治療反応の特徴である多様な研究分野で不可欠な存在となっています。機能的バイオエネルジェティクスを細胞表現型7,8と結びつけることで、解析はメカニズムの解明、代謝脆弱性の特定、遺伝的または薬理学的介入の効果評価に強力なプラットフォームを提供します。
多くの分野では、薬物、小分子、サイトカイン、または天然化合物が細胞代謝に与える即時的な影響を比較するのが、同じ実験条件下、同じプレート、培養期間、環境パラメータ、時間帯で行うのが最適です。したがって、この方法は異なる処理や遺伝的背景を持つ細胞を同一プレート上でプレートし、複数の代謝パラメータを同時に解析することです。この戦略により、薬物や遺伝に関連する細胞エネルギー代謝の変化を最も正確に比較できます。
多くの細胞タイプは培養で異なる挙動を示します。リンパ球は懸濁したままプレートに付着せず、マクロファージは強く付着するため移植が困難であり、がん細胞は系統によって急速に増殖しますが、速度は異なります。これらの違いはリアルタイムの代謝解析に課題をもたらします。したがって、実験内の各細胞タイプには合わせたプロトコルが必要です。
本記事では、リアルタイム代謝解析を用いてこれらのアッセイを行うためのステップバイステップのプロトコルを提供し、効率性と再現性を確保します。これらのプロトコルは、市場に出ているすべての分析装置のバージョンに適用可能です。
プロトコル
マウスは、メハリー医科大学の国立衛生研究所および施設動物ケア・利用委員会(IACUC)のプロトコルに従ってケアされました。この機関は、国際実験動物ケア評価認定協会(Association for Assessment and Accreditation of Labatory Animal Care International)によって認定されており、病原体のない条件下での実験動物の治療と利用に関する公衆衛生局の方針に準拠しています。試薬および使用機器の詳細は 材料表に記載されています。
1. セル密度の最適化
注:各細胞タイプは独自の代謝特性と大きさの大きな変動を示します。これらの要素は、最適な結果を得るために1井戸あたりの適切なセル数を決定する上で極めて重要です。初期の実験アッセイを行う前に、目的の細胞を異なる密度でプレートしたテストプレートを準備し、実行します。
- 接着細胞(例:がん細胞)については、1ウェルあたり20,000〜100,000細胞のシーディング密度をテストします。代謝率の高い細胞や大型細胞(例:ヒトがん細胞や線維芽細胞)では、密度最適化は1ウェルあたり10,000個以下の細胞から始まります。
- 非接着細胞(例:リンパ球)については、1ウェルあたり10万〜50万細胞の範囲内でシーディング密度を最適化します。すべての細胞タイプにおいて、最適な結果を得るために均一な単一細胞単分子層を目指してください(サンプルのプレートレイアウトなど図 1 を参照)。
- 以下のようにミトストレスアッセイを実行してください。 この予備アッセイのデータは、主実験に最適な細胞密度を決定するために利用できます。アッセイ条件間で最も大きな差を示す密度を選択します。
注意:このプロトコルは3Dサンプル(例:細胞球体、オルガノイド)の解析には適用されません。ただし、試料の厚さや不均一な表面を考慮して修正することは可能です。
2. アッセイの準備
- アッセイを実行する前日に、センサーカートリッジをユーティリティプレートから優しく取り出し、ユーティリティプレートの各ウェルに200μLのRNAase/DNAaseフリー水を加え、センサーカートリッジをユーティリティプレートに下げてセンサーが完全に水に浸かるまで続けます。
注意:センサーカートリッジの蛍光素は適切に水分補給されていないと機能しないため、センサーが一晩中完全に水没するように水位が十分に高くなければなりません。XFハイドロブースターでカートリッジの水和を行う場合、カートリッジを直接キャリブラント溶液に入れ、水の水和工程を除外できます。 - 水和したセンサーカートリッジ/ユーティリティプレートを、37°CのCO2レスインキュベーターに一晩入れます。プレートからの蒸発を防ぐために、インキュベーターに二重蒸留水を入れた容器も入れてください。
- アッセイ当日、CO2なしインキュベーターからセンサーカートリッジ/ユーティリティプレートを取り出し、センサーカートリッジを優しくユーティリティプレートから取り出し、カートリッジセンサー側を上にしてベンチに置きます。
- ユーティリティプレートの水を捨て、緩んだ水滴を振って乾かし、各井戸に200μLのXFキャリブラント溶液を加えます。
- センサーカートリッジをユーティリティプレートに優しく戻し、センサーがキャリブラント溶液に完全に浸るようにし、37°CのCO2レスインキュベーターに戻します。
3. アッセイ媒体の準備
- ミトストレス培地の調製:
- 50 mLのチューブ内に、45 mLのXF RPMI培地に加えます:100xナトリウムピルビン酸500 μL(最終濃度:1 mM)、500 μL 100x L-グルタミン(最終濃度:2 mM)、および550 μLの45%グルコース溶液(最終濃度:25 mM)
- pHを7.4に調整してください。XF RPMI培地を50mLまで補充します。使用前に、準備済み培地を37°Cの水浴または乾浴で保温してください。
- 解糖系アッセイ培地の調製:
- 50mLのチューブ内に、100xLグルタミン250μLをXF RPMI培地45mLに加えます。
- pHを7.4に調整し、XF RPMI培地を50mLまで補充します。使用前に、準備済み培地を37°Cの水またはドライバスで保温してください。
注:ミトストレスおよび解糖系の培地のpHは、pHを変化させるサプリメントを加えた後は7.4に再調整する必要があります。わずかな偏差でもアッセイ結果に大きな影響を与えるためです。
4. 分析前の細胞洗浄と培地交換
注:XFe96/XF Pro Cell Culture Microplatesの洗浄工程は、接着型または非接着型のどちらを使うかによって異なります。使用する細胞タイプに最適な洗浄方法を決定するには、ステップ9「付着型(がん細胞、原発性BMDM細胞)」および非付着型(T細胞およびその他のリンパ球)を参照してください。
- 各ウェルからマルチピペッターを使って160〜180μLの成長培地を抽出し、細胞の乾燥を防ぐために1行ずつカラムを処理します。井戸の底に触れないようにしてください。
- シングルチップピペットマンを使い、ウェルの底の細胞層に触れないように残りの20〜30μLを抽出します。
- 各ウェルに180μLの解糖またはミトストレスアッセイ培地(ステップ3参照)を加え、 図1のレイアウトに従います。セル層を乱さないため、各ウェルの側面壁に沿って培地を優しく撒き、すべてのウェルが満たされるまで続けます。両方のアッセイは同じプレートに含まれています。
注意:細胞を含まないウェルや対照ウェルもアッセイ培地で満たされなければなりません。 - アッセイ開始前にマイクロプレートを37°CのCO2レスインキュベーターに40〜45分間置き、薬剤の準備を開始します。
5. 薬剤の調製とカートリッジの装填
注意:一部の薬剤(FCCP、アンチマイシンA/ロテノン、オリゴマイシン)は危険性があり、慎重に取り扱う必要があります。人員を保護するための適切な措置が必要であり、これには、手袋やその他の個人用防護具(PPE)の使用、そして機関承認の化学廃棄物ビンや容器での廃棄物の廃棄が含まれます。
注:最適なFCCP/オリゴマイシン濃度は細胞種に依存し、特に感受性の高い細胞を対象にして試験前に経験的に調整されます。最終濃度は細胞の種類によって異なる場合があります。薬剤を準備し、使用当日に新鮮な培地を分析してください。冷凍や再利用は避けてください。最適な結果を得るために、この45分以内にアッセイ薬剤の準備を行うことができます。
- ステップ3の予温化されたミトストレス解糖アッセイ培地を用いて、 表1 および /または表2 に従って各細胞型に適した濃度に希釈します。各化合物は別々の15 mLチューブで準備します(6種類すべてを使用する場合は6本のチューブが必要です)。
- センサーカートリッジ/ユーティリティプレートを37°CのCO2レスインキュベーターから取り外し、蓋を外します。キットに付属していたXFローディングガイド(インジェクターポート対応のXFローディングガイド、ポートAのガイドA)をセンサーカートリッジの上部にしっかりと配置してください( 図2参照)。
- 各薬剤ごとに多チャネルピペットと試薬リザーバーを使用し、対応するポートに必要な体積をゆっくりと加算していきました(体積については 表1 および 表2 を参照してください)。薬剤を装填する際はピペッターを完全に直立させてください( 図2参照)。
- 各ポート(ポートA、B、C、D)ごとにローディングガイドを十分にすすいで乾燥させた後、交換または再利用し、各ロード後はピペットチップを廃棄してください。
注意:ピペットの先端はガイドポートにしっかり収まるようにしていますが、きつすぎないようにしてください。ピペットの先端がガイドに挟まってしまう可能性があります!サンプルの誤りを防ぐため、化合物を充填する前にガイドに使うピペットチップやピペットをテストすることをお勧めします。 - すべての化合物をそれぞれのポートに装填した後、ガイドを外し、すべてのポートが満たされているか目視で確認し、カートリッジを蓋で固定します。薬剤は同じプレートの各部分でアッセイに対応するべきです(図1)。
注:ミトストレスに対する最終推奨ウェル濃度は、オリゴマイシン1μM、FCCP1μM、ロテノン/アンチマイシン0.5μMです。解糖作用では、10 mMグルコース、1 μMオリゴマイシン、50 mM 2-DGを投与しました。
6. シーホースXFe96アナライザーの設置
- アナライザーを起動し、WAVEソフトウェアを開きます(図3参照)。
- XF ミトストレステストを選択してください。
注:適切なアッセイ培地と化合物が使用されていれば、分析装置はXFミトストレス試験を用いて同じプレート上でミトコンドリア検査と解糖解析の両方を同時に実施できます。 - プレートの配置に基づいて「グループ」の数を選び、それぞれのグループにラベルを付けます。次のタブに進んでプレートマップの井戸を割り当ててください( 図3参照)。両方のアッセイは同じプレートで行われます。
- プレートの荷重方法に基づいて各グループの井戸をハイライトします。
- 細胞の種類や実験目的に応じてプログラムを調整してください。例えば、分析前に事前活性化グループを含んだり、ラン中にアクチベーターを追加したりする場合は、各サイクルで孵育時間を延長して活性化が起こるようにしましょう。
- 次のタブ「Run Assay」を選択し、必要に応じて情報を入力してデータファイルを保存してください。
- 初期化の指示があれば、あらかじめ水和された薬剤(ステップ5以降)を機械に積み込みます。初期化ステップはセンサーが適切に水分補給され、正常に機能しているかどうかを示します。
- アッセイを開始し、プログラム中の指示に従ってプレートをロード・アンロードします。
注意:カートリッジやマイクロプレートをアナライザーに積み込む際は、必ずすべての蓋を外してください!一部の分析装置には蓋を感知できる安全機能がありますが、初期モデルにはありません。プレートラン中に蓋が無傷であれば、機械が損傷する可能性があります。
7. 正規化方法:(SRB)および核数(DAPI染色およびイメージング)
注意:SRBアッセイキット内の一部の試薬は腐食性があり、皮膚に触れると焼けます。DAPIはアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。手袋やその他のPPEの使用、また物質の廃棄は機関承認の化学廃棄物箱または容器での処分が推奨されます。
注意:解析対象細胞の特性と前処理に基づいて正規化方法を選択してください。どちらの方法も、異なる増殖率を持つ細胞を比較する際に適しており、両方法ともそのような変動を考慮しています。しかし、薬物治療が老化を誘発し、増殖を止めて細胞サイズを増加させる場合は、DAPI染色が好まれる正規化アプローチとなります。DAPIは、核染色が目視しにくい細胞タイプ(例:脂肪細胞、赤血球)や多核細胞(例:実質肝細胞、筋球)の細胞タイプには適さない場合があります。
- リアルタイム代謝解析後にSRBアッセイ(スルホダミンB細胞毒性アッセイキット)を用いて細胞を正規化するには、プレートを機械から取り出し、各ウェルに固定液の1/4(例:200 μLの培地で50 μL)の固定液を加えます。
- 室温で1時間、または4°Cで一晩培養します。
- 溶液を取り出し、細胞層を乱さないように注意しながら、200μLのRNase/DNaseフリー水でウェルを3回優しく洗浄します。短期保存(必要に応じて)には、最終洗浄液をPBSに置き換え、4°Cで保存してください。
- SRBアッセイを用いた即時正規化のために、洗浄液を取り出し、プレートを完全に室温で自然乾燥させます。
- 各ウェルに25μLのSRB溶液を加え、室温の暗闇で15分間染色するか、培養期間中にアルミホイルで包みます。
注意:SRB溶液は光に敏感であり、この実験部分は暗い場所で行う必要があります。 - 染色液を取り除き、1x洗浄液100μLを加えて、各井戸を2〜3回洗います。
- 漂白を防ぐためにできるだけ早く洗い、真空吸引で洗浄液をできるだけ取り除くようにしましょう。
- 各ウェルに100μLの溶解液1を加え、プレートをシェーカーに10分間室温で置きます。
- プレートリーダーで565 nmの光密度(O.D.)を測定し、色の彩度に基づいてウェル密度を決定します(視覚的な参考は 図3 参照)。
- O.D.の値をExcelファイルとしてエクスポートしてください。このスプレッドシートは正規化のためにWAVEソフトウェアに貼り付けられます(ステップ8)。
注:セル過負荷により強い色(> O.D. 3.5)が観測された場合、最適でない波長(例:490–530 nm)を用いて測定値を機器の線形範囲に戻すことがあります。すべてのサンプルの読み取り値から培養培地(背景制御井戸)のみを含む対照のO.D.を差し引くことで、背景を正しく行います。
- DAPI染色の場合は、DAPIストック溶液を300 nMに薄めて1xPBSに浸します。
- 細胞プレートの各ウェルを200μL 1x PBSで優しく3回洗います。
注意:接着していないセルがある場合は、各洗浄工程後に各ウェルの底にセルが吊り下げられるように、200 x g の圧力で3分間遠心分離してください。 - 細胞を2%〜4%のPFAに1xPBSで希釈し、室温で10〜15分間固定します。
- 細胞プレートの各ウェルを200μL 1x PBSで優しく3回洗います。
- 各ウェルに約150μLの希釈DAPI染色液を加え、セルが完全に被覆されていることを確認します。
- 室温の暗い場所(またはアルミホイルのカバープレート)で1〜5分間キュベートします。
- 各井戸からDAPI染色液を除去してください。
- 細胞プレートの各ウェルを200μL 1x PBSで優しく3回洗います。
- 残っているPBSはすべて削除してください。
- 358〜461 nmの励起/放出、または顕微鏡の任意のDAPIフィルター設定下で細胞を画像化します。
- 排出ガスの値をExcelファイルとしてエクスポートしてください。このスプレッドシートは正規化のためにWAVEソフトウェアに貼り付けられます(ステップ8)。
- 細胞プレートの各ウェルを200μL 1x PBSで優しく3回洗います。
8. データの解析と正規化
注:データの解析には「Wave」やその他のソフトウェアを使用できます。提供されているプロトコルはWaveソフトウェアにも適用可能です。
- 解析結果をWaveで開いてください( 図3参照)。正規化は、SRB染色(ステップ7)後にマイクロプレートリーダーで生成されたExcelファイルから得られる値を用いて行われます。
- 「ノーマライズ」をクリックしてください。
- 開いたウィンドウで「すべて選択」を選択し、その後「貼り付け」を選んで、正規化ステップで生成されたExcelのスプレッドシートからコピーしたデータを貼り付けます。「応募」をクリックしてください。この手順により、すべての実験データが自動的に正規化されました。
- レポートを生成するには、右側のパネルで「エクスポート先」をクリックし、「XF Cell Mito Stress Test Report Generator」を選択してください。生成ファイルを保存してください。分析中は、ミトストレステストに割り当てられた井戸のみを選択してください( 図3参照)。
- レポートを生成するには、右側のパネルで「エクスポート先」をクリックし、「XF細胞解糖ストレステスト」レポートジェネレーターを選択してください。生成ファイルを保存してください。解析中は解糖ストレス試験に割り当てられたウェルのみを選択してください( 図3参照)。
9. 接着細胞と非接着細胞の比較
注:付着型細胞と非付着型細胞は、成長挙動、表面付着、取り扱い要件において異なります。接着細胞(例:がん細胞、BMDM)は培養表面に付着するため、プレートや洗浄には特別な注意が不要です。非接着細胞(例:T細胞、他のリンパ球)は懸浮状態のままであり、異なる遠心分離、再懸濁、プレート剥製方法を必要とします。これらの違いを理解することは、正確な細胞シーディング、薬剤処理、アッセイの一貫性に不可欠です。
- 実験に使用されるすべての細胞は、アッセイ実行直前に選んだ培地と培養容器で培養され、その後マイクロプレートに移してアッセイを実施することを確認しましょう。
注意:本プロトコルで記述されている細胞タイプにはXF RPMI培地が推奨されますが、他の細胞タイプについては適切な培地を使用するかどうかメーカーに確認してください。 - 付着細胞(がん細胞、BMDM細胞)については、アッセイの4〜5時間前に最適化された細胞密度(ステップ1参照)でXFe96/XFプロ細胞培養マイクロプレートにシードし、培地容量200 μLに置き、37°CのCO2 インキュベーターに入れます。
注:BMDM細胞は増殖せず、同じ細胞密度を維持するため、アッセイの最大24時間前までプレートを施すことができます。がん細胞株のような急速に増殖する付着細胞については、追加の処理が不要であればアッセイ当日にプレートを施し、細胞が付着した直後に分析して追加の細胞増殖を防ぐことが推奨されます。この設計が不可能であれば、タンパク質量/ウェルまたは核数/ウェルへの正規化が必要なステップです。 - マイクロプレートの4つの角ごとにコーナーウェルは細胞がなく、培地で満たされていることを確認してください。これはブランクコントロールウェルとして測定されます。
- 3〜5時間の培養後、各ウェルの底部で細胞が均一なレベルでプレートに付着しているかを観察します。
- 細胞がまだ付着していない場合は、プレートを37°CのCO2 インキュベーターに置き、細胞が完全に付着するまでさらに時間をかけることができます。
- 次に、ステップ4で述べたように付着細胞を含んだマイクロプレートを洗浄し、アッセイを進めます。
- 非接着性細胞(T細胞やその他のリンパ球)については、細胞を追加する前にポリDリジンをマイクロプレートにコーティングしてください。
注:このプロトコルではポリDリジンコーティングが推奨されますが、細胞の種類によっては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチンなどの別のプレートコーティングの方が適している場合があります。代替コーティングを使用する場合は、製造元の指示に従って使用してください。 - マイクロプレートをコーティングするには、20 μg/mLのポリ-D-リジン溶液2.5 mL(1 mg/1 mLの水溶液を50倍希釈)を0.1 Mの炭酸水素ナトリウム、pH 8.0(接着剤吸着に最適なpHを提供する重炭酸塩)に準備します。この工程はアッセイの前または当日に行うことができます。
- 各ウェルに25μLの溶液を塗布し、室温のベンチまたはプレートロッカーで20〜30分間キュベーションします。
- 残った溶液を吸引またはピペットで除去し、各ウェルを200μLのRNAase/DNAaseフリー水で2回洗浄します。
- ウェルが乾燥するまで(1〜2時間)待ってから細胞をマイクロプレートにシードします。
- 次に、200 x g の圧力で3分間遠心分離し、各ウェルの底部にセルが吊り下げられるようにして、非接着性セルを含んだマイクロプレートを洗浄工程に準備します。
- ステップ4に進み、ステップ5〜7で述べた通りアッセイの残りを続けます。
結果
この統合プロトコルは、両方のアッセイを同じプレート上で実施できるように開発されました。例えば、この方法は活性化10期中のCD8+ T細胞の代謝能力に関するmGluR1−TCRのクロストークシグナル伝達を明らかにするために用いられました。これは、mGluR1阻害が解糖系への移行やミトコンドリア呼吸の変化に与える影響を評価するものであり、これらの過程はT細胞の最適な機能に不可欠なものであり、各実験で使用されるT細胞の数を最小限に抑えることを目的としています。同じ単一プレート技術は、付着する骨髄由来マクロファージ(BMDM)など他の細胞タイプにも効果的に適用されました。図4および図5)、およびヒト末梢血単核細胞(PMBC;図3)。活性化されたCD8+ T細胞におけるmGluR1シグナル伝達阻害は、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアのエネルギー産生に影響を与えることが示されました。対照的に、未熟細胞は代謝エネルギープロファイルに有意な変化を示さなかった(図6A,B)。活性化されたCD8+ T細胞のミトストレス試験では、基礎呼吸および最大呼吸、呼吸予備能力が高いことが示されました(図6C)。グルタミン酸がmGluR1に結合した際に下流シグナル伝達を阻害する非競合拮抗薬CPCCOEtで処理されたT細胞は、ナイーブ細胞と同様に酸素消費率(OCR)が低下し、ATP産生が減少しました(図6C)。解糖法では、未処理の活性化CD8+T細胞のみが解糖作用でATPを産生し、CPCCOE処理はナイーブ状態と同等の代謝活性を示したことも示しました(図6D)。これらの結果は、mGluR1シグナル伝達が活性化後のCD8⁺T細胞の適切な機能に不可欠であることを確認しています。
図1:この図は、同じプレート内にミトストレスおよび解糖アッセイを含むマイクロプレートのプレートセットアップの概要を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:薬莢の装填。(A) カートリッジの前後のセンサーとポートの詳細な地図で、どの薬をどのポートに装填すべきかをラベル付けすること。(B)対応するポートを装填するためのカートリッジ上部のガイドの推奨向きと、ガイド上にマルチチャンネルピペッターを使用する際の推奨位置。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:WAVEプログラムを使ってアッセイを実行し解析する様子。(A) プログラムの設定過程には、アッセイの種類の選択、グループ割り当て、プレートマップの作成、薬物ポートのプログラミングが含まれます。(B)対応するポートに注入される薬剤の順序は、サンプルがミトストレスか解糖系かによって異なります。(C) 正規化の最終段階でのSRB染色のクローズアップ。(D) 正規化後、プレートデータは同じプレートに対して解糖作用試験およびミトストレス試験として別々にエクスポートできます。(E) ミトストレスのデータは、現在の選択をミトストレスサンプルのみで編集することで選択できます。(F) 解糖のデータは、現在の選択を編集して解糖試料のみを選択することができます。この図で使用されている例データは、ヒト末梢血単核細胞の分析から得たものです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:同じプレート上でミトストレスを同時に実行した様子。 生後2か月のWTマウスおよびTusc2 KOマウス由来の骨髄由来マクロファージを両タイプの解析対象に適用しました。細胞は未処理(偽)またはLPS(100 ng/mL)で5時間刺激され、プレート(30,000細胞/ウェル)が行われました。正確な比較を可能にするために、ミトストレス試験と解糖ストレス試験を並行して実施しました(図1参照)。 (A) 異なる細胞タイプ(WTおよびKO)および状態(素朴および活性化)に対するミトストレスプロファイルをWaveソフトウェアで生成。正規化はステップ7で説明したSRB染色によって行われました。(B)各テストで解析されたパラメータの比較棒グラフ。∗p ≤ 0.05、∗∗p ≤ 0.005、学生のT検定。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図5:同じプレート上で同時実施された解糖ストレス試験。 生後2か月のWTマウスおよびTusc2 KOマウス由来の骨髄由来マクロファージを両タイプの解析対象に適用しました。細胞は未処理(偽)またはLPS(100 ng/mL)で5時間刺激され、プレート(30,000細胞/ウェル)が行われました。正確な比較を可能にするために、ミトストレス試験と解糖ストレス試験を並行して実施しました(図1参照)。 (A) 異なる細胞タイプ(WTおよびKO)および状態(ナイーブおよび活性化)に対する解糖ストレスプロファイルをWaveソフトウェアで生成。正規化はステップ7で説明したSRB染色によって行われました。(B)各テストで解析されたパラメータの比較棒グラフ。∗p ≤ 0.05、∗∗p ≤ 0.005、学生のT検定。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6:マウスの脾細胞から精製したCD8⁺ T細胞を用いた単一プレート上のミトストレスおよび解糖ストレス検査。(A) 未生、活性化、活性化+mGluR1阻害T細胞群と比較したCD8+ T細胞の酸素消費率(OCR)の薬物依存的変化を比較するミトコンドリアストレス試験の代表的なプロファイル。(b) 素生、活性化、活性化+mGluR1阻害剤群に対して行われたCD8+ T細胞の細胞外酸化速度(ECAR)の薬物依存性変化を比較する解糖系検査の代表的なプロファイル。(C) 素生、活性化、活性化+mGluR1阻害剤群におけるCD8+ T細胞のミトコンドリア呼吸の異なるパラメータの定量的変化を示す棒グラフ。棒はSEMの平均±(n=4)を表します。(D) 素生細胞、活性化細胞、活性化細胞+mGluR1阻害剤CD8+ T細胞における解糖の異なるパラメータの定量的変化を示す棒グラフ。棒はSEMの平均±(n=4)を表します。∗p ≤ 0.05、∗∗p ≤ 0.005、学生のT検定。この図はAquinoら10から引用したものです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
| 最終井戸(μM) | ストック溶液体積(μL) | メディアボリューム(uL) | 10倍ポート(μM) | ポートに追加ボリューム(μL) | |
| ポートAオリゴマイシン | 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 20 |
| 1.5 | 450 | 2550 | 15 | 20 | |
| 2.5 | 630 | 1890 | 25 | 20 | |
| ポートB FCCP | 0.125 | 37.5 | 2962.5 | 1.25 | 22 |
| 0.25 | 75 | 2925 | 2.5 | 22 | |
| 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 22 | |
| 1 | 300 | 2700 | 10 | 22 | |
| 2 | 600 | 2400 | 20 | 22 | |
| ポートCロテノン/アンチマイシン | 0.5 | 300 | 2700 | 5 | 24 |
表1:ミト応力用のXFe96センサーカートリッジ装填のための化合物調製。
| ファイナル・ウェル | ストック溶液体積(μL) | メディアボリューム(μL) | 10倍ポート | ポートに追加ボリューム(μL) | |
| ポートAグルコース | 250 mM | 100 | 2400 | 20 | |
| ポートBオリゴマイシン | 0.5 μM | 150 | 2850 | 5 uM | 22 |
| 1.5 μM | 450 | 2550 | 15 uM | 22 | |
| 2.5 μM | 630 | 1890 | 25 uM | 22 | |
| ポートC 2-DG | 50 mM | 3000 | 0 | 500mM | 24 |
表2:解糖系用XFe96センサーカートリッジ装填のための化合物調製。
ディスカッション
ここで示すプロトコルは、2つの主要なエネルギー生成経路である酸化リン酸化(ミトコンドリアATP産生)と嫌気性解糖法(ミトコンドリア外で酸素を必要としないATP産生)の正確かつ信頼性の高い比較を可能にし、1回のランで2つの異なるストレス試験を可能にします。さらに、実験設計は分析対象の細胞の種類を考慮し、細胞代謝解析のより広い理解を可能にしつつ、使用するサンプルや試薬の量を最小限に抑えています。
Agilent, Inc.が設計・販売するリアルタイム代謝分析機器プロトコル上で実施されるミトストレス検査と解糖ストレス検査の差は大きいです。これら2つのアッセイは、異なるアッセイ媒体、特定の薬剤、異なる器具プログラムを必要とします。ミトストレス試験はグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸を含むアッセイ培地を使用し、解糖ストレス試験はL-グルタミンのみを補完したグルコースフリー培地を使用します。アッセイは異なる化合物で検証されます。ミトストレス試験ではオリゴマイシン→FCCP → アンチマイシンA + ロテノン、解糖ストレス試験ではオリゴマイシン→グルコース→2-DGが使用されます。そのため、これらの検査は通常、リアルタイム代謝分析装置が一度に1枚のプレートのみを扱うため、異なる時間に別々のプレートで実施されます。
これらの制約に対処するため、前述の論文10でミトストレステストのセットアップを用いて、両方のアッセイを同一プレート上で実施できる複合プロトコルが開発されました。免疫細胞、がん細胞、付着細胞、懸濁細胞など、さまざまな細胞タイプの解析に関する推奨事項が提供されています。これらのガイドラインは個別に適用することも組み合わせても可能で、実験者の目的や利用可能な資源に応じて柔軟性を提供します。
SRBアッセイやDAPIによる細胞正規化により、異なる増殖速度やサイズを持つ複数の細胞タイプを使用できる場合には柔軟性が高まります。さらに、この技術は2回のアッセイで1プレートで済むため、さまざまな種類のサンプルと組み合わせて代謝過程を測定することも可能です。
手法の成功に影響を与える要因:(1) 井戸あたりの最適なセル数;(2) 効率的なセル付着;(3) 慎重なカートリッジ装填。なぜなら、2種類の異なる薬物をカートリッジの別々のセクションに装填しなければならないからです。
この方法の科学的および実験的利点は、同じ生物学的文脈内で直接比較できることです。同じ培養条件下で同じ細胞を使用することで、プレートやラン間のばらつきがなくなり、同じサンプル内でミトコンドリア機能と解糖機能のより正確な比較が可能になります。また、細胞代謝の統合的な視点も含まれています。酸化リン酸化(OXPHOS)と解糖系の両方を並行して測定することで、細胞全体のエネルギー代謝と経路間の切り替えの柔軟性を包括的に把握できます。この並行分析法は生物学的変動も低減します。両方のアッセイが同じ細胞集団で行われるため、細胞プレート密度、通過数、環境条件の違いが最小限に抑えられ、再現性が向上します。両方の試験を同時に実施することで、センサーカートリッジの校正、温度変化、試薬調製によるランごとに生じるばらつきを低減します。
この技術の技術的利点には、アッセイを組み合わせることで効率が向上し、時間、試薬、プレート消耗品の節約が可能となり、大規模または高スループットの研究において重要です。これによりサンプルの必要量が低くなります。細胞プレートは1枚だけで済み、リンパ球や脳由来細胞など限られたまたは希少な一次細胞を扱う際に有利です。両検査が同じプレート(例:タンパク質含有量や細胞数)を用いるため、アッセイ間で正規化が改善され、より一貫性があり信頼性が高いです。この一貫性により、データの相関が強化されます。同じサンプルからミトコンドリアと糖分解パラメータを直接組み合わせることで、代謝プロファイル作成や統計解析が容易になります。
この技術の唯一の既知の制限は、1枚のプレート上で2つのプロトコルを組み合わせると、利用可能な井戸複製数が減少することです。1枚のプレートあたりの条件数を制限し、1つの条件ごとに少なくとも8回のウェル複製を確保することが推奨されます。
謝辞
この研究は、米国少数派健康・健康格差研究所(NIMHD)の資金提供を受け、助成金番号5U54MD007586-37、A. イワノヴァへのパイロットプロジェクト;NHGRIゲノム研究多様性センター助成金UG3HG013248、研究プロジェクト2、PI-イワノヴァ、またGenprex Inc.による支援も提供されました。 さらに、この研究はメハリー医科大学コア施設で行われ、NIHの助成金MD007586、CA163069、S10RR025497の支援を受けています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15mL遠心分離機チューブ、スクリューキャップ付き、滅菌、500チューブ/ユニット | ジェネシー・サイエンティフィック | 21-408B | |
| Biologix Pipet Tips-200 & mu;L エクステンデッド(パック、無菌) | バイオロジクスUSA | SKU 21-0200 | |
| BioTek Synergy H1 | バイオスポックス | ||
| BZ-X700蛍光顕微鏡 | キーエンス | ||
| コーニング コスター無菌使い捨て試薬リザーバー | フィッシャー | 4873 | |
| D-(+)-グルコース溶液 H20中の45% | シグマ | G9769 | |
| DAPI、塩酸塩およびnbsp; | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | D1306 | |
| エッペンドルフ遠心分離機 5810 R | エッペンドルフ | ||
| ジェンクローン胎児用牛血清発熱不活性化 | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-514H | |
| L-グルタミン 200 mM(100倍) | ギブコ | 25030-081 | |
| オリンパスプラスチック 22-284、オリンパス1.7mlマイクロチューブ、透明、滅菌ポリプロピレン、ボイルプルーフ、STER、50本/袋、250本/ユニット | ジェネシー・サイエンティフィック | 22-284 | |
| Olympus Plastics 28-108、50ml円錐形遠心分離機チューブ、ポリプロピレンバルク、滅菌、25本入り20袋、500本/ユニット | ジェネシー・サイエンティフィック | 28-108 | |
| パラホルムアルデヒド16%溶液EMグレード | 電子顕微鏡科学 | 15710 | |
| ポリD-リジン臭化水素凍虫化 | シグマ | P6407 | |
| プレシジョン180ウォーターバス | プレシジョン・サイエンティフィック | 51221060 | |
| プレシジョン・サイエンティフィックGCAモデル26インキュベーター | セルコ | 51221091 | |
| QBI 120-095-671 ペニシリン/ストレプトマイシン混合液、ペン/溶連菌混合物100倍、10 x 10 mL/ユニット | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-827 | |
| QBI PBS、1回、カエル酸素、マグログラム、フェノールレッド、0.1um滅菌ろ過なし | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-507B | |
| RPMI 1640、L-グルタミン配合 | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-506 | |
| シーホースXF RPMI培地、pH 7.4、500 mL | アジレント | 103576-100 | |
| シーホース XFe96アナライザー | アジレント | ||
| シーホース XFe96/XF プロフラックスパック | アジレント | 103792-100 | 18本のXFe96/XF Proセンサーカートリッジ、18本のXFe96/XF Pro細胞培養マイクロプレート、Seahorse XFキャリブラント溶液500mL1本、XFローディングガイド3ペアが含まれています |
| 炭酸水素ナトリウム | シグマ | S6014 | |
| ピルビン酸ナトリウム(100mM)100X | ギブコ | 11360-070 | |
| SRBアッセイ(スルフホダミンBアッセイキット) | アブカム | AB235935 | |
| VWRシグネチャー高性能マルチチャネルピペッター | アヴァントール | 89079-956 | |
| XF細胞ミトストレステストキット | アジレント | 103015-100 | |
| XF解糖率アッセイキット | アジレント | 103344-100 |
参考文献
- Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
- Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
- Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
- Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
- Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
- Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
- Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
- Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
- Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
- Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).
再版と許可
タグ
この記事は公開されました
動画は近日公開