ラット膝関節軟骨細胞の一次単離、培養、表現型検証

サマリー

このプロトコルは、逐次酵素消化を用いた初代ラット膝関節軟骨細胞の単離および培養を記述する。この方法により、検証された表現型特性を備えた軟骨細胞が得られ、研究者に軟骨研究用途への信頼できるアプローチを提供します。

要約

外傷、老化、炎症状態に起因する軟骨損傷は、組織の本質的に再生能力が限られているため、依然として重大な臨床的課題です。軟骨細胞は軟骨の唯一の細胞成分であり、細胞外マトリックスの構造と機能の維持に関与しており、軟骨の生理学、病理、再生を理解するために不可欠です。現在の研究は、膝関節からの原発性ラット関節軟骨細胞の単離、培養、および表現型検証のための包括的で標準化されたプロトコルを提示しています。この手順では、若い乳ラットを利用して細胞生存率を最大限に高め、効率的な細胞抽出のためにトリプシンとコラゲナーゼ II 型による逐次酵素消化を採用します。軟骨細胞の表現型は、II 型コラーゲン免疫蛍光法、フローサイトメトリー分析、およびインターロイキン (IL)-1β 刺激アッセイによって検証され、細胞の同一性と炎症反応性が確認されます。この最適化された再現性のあるワークフローにより、薬物スクリーニング、機構調査、組織工学用途に適した高純度軟骨細胞培養物の生成が可能になり、軟骨生物学研究が進歩します。

概要

軟骨は特殊なタイプの結合組織であり、サポート、クッション性、衝撃吸収などの複数の重要な機能を実行します¹。これは、構造の安定性を維持し、骨格系内の可動性を確保する上で重要な役割を果たします ^2,3。機械的損傷、変性変化、炎症、または代謝異常は、軟骨に損傷を与える可能性があります ^4,5,6。軟骨には血管や神経が固有の欠如と軟骨細胞の増殖能力が限られているため、軟骨の修復には重大な課題が生じます。変形性関節症 (変性変化や機械的損傷によって引き起こされる) や関節リウマチ (自己免疫性炎症反応によって引き起こされる) などの疾患は、不可逆的な軟骨損傷を引き起こし、患者の生活の質を大幅に低下させる可能性があります ^7,8,9。軟骨組織内の排他的な細胞型として、軟骨細胞は、細胞外マトリックスの分泌と維持、骨格の発達のサポート、関節のクッションと修復への関与、軟骨の成長と代謝の中枢調節などの重要な機能を担っています10,11,12。

軟骨細胞は無血管マトリックスラクナ内に閉じ込められているため、それ自体の増殖と組織修復の能力が著しく制限されます^13,14。軟骨細胞の機能状態は、軟骨組織の健康状態を直接決定します¹⁵。老化、炎症、外傷、または遺伝的要因によって引き起こされる軟骨細胞機能不全は、マトリックス合成の減少と分解の増加をもたらします^16,17。この病理学的プロセスは軟骨の変性(変形性関節症など)を引き起こし、軟骨の本質的なサポート、クッション、潤滑機能の障害につながります。軟骨の再生能力が限られていることは、軟骨の修復における重大な課題の主な理由であり、現代の整形外科および再生医療における重要な研究分野を構成しています。軟骨に関する現在の研究は、薬物ベースの介入、組織工学、および遺伝子治療のすべてが、in vitro 研究のために軟骨細胞の単離を必要とする、この分野の主要な焦点となっています 18,19,20,21,22,23,24,25.したがって、軟骨細胞の単離と同定は、多くの実験的アプローチにおいて重要なステップを構成します。SW1353などの不死化軟骨細胞様細胞株は、いくつかの研究で便利な代用物として使用されていますが、重要な表現型マーカー、特に本物の軟骨細胞機能とマトリックス形成に不可欠なII型コラーゲンの発現を欠いています²⁶。したがって、初代軟骨細胞は、生理学的関連性を必要とする研究のゴールドスタンダードであり続けています。複数の酵素の組み合わせや広範な機械的操作を必要とする以前に公開されたプロトコルと比較して、簡素化された酵素消化アプローチは、複数の酵素の組み合わせや広範な機械的操作を必要とする方法と比較して、複雑さと処理時間を削減します。さらに、包括的な検証ステップを組み込むことで、機能的な軟骨細胞の一貫した同定が保証され、実験や実験室全体での再現性が向上します。

軟骨細胞は、II型コラーゲンの分泌を特徴とし、炎症因子による刺激下で、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を広範囲に合成して放出します²⁷。したがって、軟骨細胞の単離に続いて、II型コラーゲン免疫蛍光法 によって 細胞を同定し、フローサイトメトリーを使用して軟骨細胞の純度を評価しました。また、インターロイキン (IL)-1β で刺激して、マトリックス メタロプロテイナーゼの特徴的な合成と分泌を確認しました。本研究では、新生マウスからの軟骨細胞抽出と特性評価のプロセスを説明し、その後の軟骨細胞関連実験の基礎を確立します。

プロトコル

本研究における動物被験者の使用は、日中友好病院の実験動物ケア・福祉倫理委員会(No.zryhyy21-21-05-16)によって承認されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 実験動物と準備作業

注:人工膝関節全置換術後のラット、ウサギ、およびヒトの関節からの軟骨は、軟骨細胞の分離に使用できます。しかし、生存率が高いため、この研究では乳ラットが軟骨細胞抽出に利用されました。

1. 実験動物生産施設から実験室まで、専用の移送容器を使用して子ラットを輸送します。
2. 乳ラットをCO₂ 窒息(施設で承認されたプロトコルに従って)によって安楽死させ、体表面を滅菌溶液ですすぎます。
3. 安楽死させた子ラットを75%エタノールに10分間浸し、表面の汚染物質を消毒します。
4. 消毒した子ラットをバイオセーフティキャビネットに移し、滅菌ペトリ皿に入れます。
   注:乳ラットの徹底的な表面洗浄とエタノール浸漬は、その後の実験に悪影響を与える可能性のある細菌または真菌の汚染を防ぐための重要なステップです。

2. 関節軟骨組織の分離

注:新生児軟骨は、骨骨端を覆う半透明の青みがかった白い層として現れます。このステップでは、その後の実験を損なう可能性のある汚染を避けるために、厳格な無菌技術に従う必要があります。

1. メスと眼科用ハサミを使用して乳ネズミの膝関節を分離し、その上にある皮膚組織を取り除きます。
2. 解剖した膝関節を新しい滅菌ペトリ皿に移し、メスと眼科用ハサミを交換します。
3. メスを使用して膝関節から関節軟骨を採取し、眼科用ハサミで周囲の結合組織を完全に切り取ります。

3.軟骨組織の消化

注:トリプシンを使用して軟骨の周囲の結合組織を消化し、続いて軟骨マトリックスの消化に0.2%コラゲナーゼIIを使用します。

1. 採取した軟骨を3容量の0.25%トリプシンに加え、37°Cのサーモスタットシェーカーで30分間攪拌しながらインキュベートします。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSを加えて消化を終了します。眼科用ハサミを使用して軟骨から付着組織を取り除きます。遠心分離(4°C、500 × g、5分)し、上清を廃棄します。
3. 軟骨組織をPBSに再懸濁し、遠心分離(4°C、500× g、5分)、上清を廃棄します。この洗浄手順を3回繰り返します。
4. 処理された軟骨組織に0.2%コラゲナーゼIIを加え、37°Cのサーモスタットシェーカーで4時間攪拌しながら消化します。

4.軟骨細胞の単離と培養

注:すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実行する必要があります。実験汚染を防ぐために、細胞ストレーナーのシリンジプランジャーを使用して軟骨組織を機械的に解離する際には、滅菌手袋を着用する必要があります。標準的な培養条件下では、初代軟骨細胞は通常、最初の継代で80%〜90%のコンフルエンスに達するまでに約2〜3日かかります。

1. 200 μmの細胞ストレーナーを滅菌培養皿の上に置き、消化された軟骨懸濁液をメッシュを通してろ過します。
2. 滅菌シリンジプランジャーを使用してストレーナー上の残留軟骨片を粉砕し、完全なDMEM培地でストレーナーをすすぎます。
3. すべての濾液を回収し、遠心分離(4°C、500 × g、5分)、上清を廃棄します。
4. ペレットをPBSに再懸濁し、遠心分離(4°C、500 × g、5分)、上清を廃棄します。
5. 細胞を完全なDMEM培地に再懸濁し、T25培養フラスコに移します。
6. フラスコを加湿インキュベーター(37°C、5%CO₂)でインキュベートします。
7. トリプシン-EDTAと継代培養を1:2の比率で継代培養したこの合流点での継代細胞。

5. 軟骨細胞同定のためのII型コラーゲン免疫蛍光染色

注:接着した軟骨細胞は、紡錘形および多角形の形態によって特徴付けられます。この研究で提示されたすべてのバイオマーカー分析は、継代 2 の細胞を使用して実行されました。継代3の軟骨細胞は、紡錘形の線維芽細胞様形態へのシフトと増殖速度の減速を特徴とする、より顕著な脱分化を示し始めます。この表現型の変化は、継代4以降により明らかになります。継代6までに、細胞の大部分は細長い線維芽細胞のような形状になります。抗体希釈液は、メーカーの推奨に基づいて決定され、最適な特異性とシグナル強度を確保するために予備実験によって検証されました。

1. 軟骨細胞を24ウェルプレートに播種し、細胞接着を可能にするために24時間培養します。
2. 培地を廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄します(各ウェルにPBSを加え、5分間インキュベートしてから吸引します)。
3. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで3回洗浄します。
4. 細胞を0.3%Triton X-100(PBSで調製)で10分間透過処理します。
5. 細胞をPBSで3回洗浄し、次に動物性を含まないブロッキング溶液(150 μL /ウェル、PBSで5×希釈)で室温で1時間ブロックします。
6. ブロッキング溶液を取り出し、一次抗体(抗コールII、1:200希釈)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
7. 一次抗体を回収し、PBSで細胞を3回洗浄します。
8. Alexa Fluor 488結合抗ウサギIgG二次抗体(1:50希釈)を加え、暗所で37°Cで1.5時間インキュベートします。
9. 二次抗体を除去し、PBSで細胞を3回洗浄します。
10. DAPI含有退色防止培地でマウントし、暗所で10分間乾燥させます。
11. 倒立蛍光顕微鏡を使用して画像を観察およびキャプチャします。

6. 軟骨細胞純度のフローサイトメトリー解析

注:軟骨細胞は、同定の決定的なマーカーとして機能するII型コラーゲンを合成および分泌する能力によって特徴付けられます。軟骨肉腫細胞株SW1353は、軟骨細胞の特徴を示すものの、II型コラーゲン分泌能力を欠いているため、この実験ではネガティブコントロールとして機能します。

1. EDTAフリートリプシンを使用して、軟骨細胞とSW1353細胞の両方を消化します。
2. 完全なDMEM培地で消化を中和し、細胞をPBSに再懸濁します。
3. 細胞を固定/透過処理溶液で15分間インキュベートし、1 mLの洗浄バッファーを加えます。
4. 遠心分離(500 × g、5分)、上清を廃棄し、100 μL抗II型コラーゲン抗体(1:100希釈)と光から保護して15分間インキュベートし、続いて1 mLの洗浄バッファーを加えます。
5. 遠心分離(500 × g、5分)、上清を廃棄し、Alexa Fluor 488結合抗ウサギIgG二次抗体と光から保護して30分間インキュベートし、1 mLの洗浄バッファーを加えます。
6. 遠心分離(500 × g、5分)、上清を廃棄し、各サンプルを200 μLの洗浄バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。

7. 軟骨細胞のIL-1β刺激

注:IL-1β刺激に応答したマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の産生は、軟骨細胞の特徴です。したがって、この研究では、IL-1β 刺激を使用して、単離された軟骨細胞におけるこの表現型特性を検証します。

1. 培養フラスコから軟骨細胞を消化し、完全なDMEM培地に再懸濁します。
2. 細胞をカウントし、完全なDMEMを使用して濃度を5×10⁵ 細胞/mLに調整します。
3. 細胞を6ウェルプレート(合計24ウェル)にシードし、12ウェルをブランク対照群として指定し、12ウェルをIL-1β刺激群として指定します。
4. プレートを細胞培養インキュベーターで12時間インキュベートします。
5. 細胞接着が完了した後、刺激群に10 ng/mLのIL-1βを加える。
6. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析のために24時間後に細胞培養上清を収集します。
7. 細胞をPBSで2回洗浄します。
8. 6つのコントロールウェルと6つのIL-1β刺激ウェルをRIPAバッファーで溶解し、その後のウェスタンブロット分析を行います。
9. qPCR分析のためにTRIzolを使用して、6つのコントロールウェルと6つのIL-1β刺激ウェルからRNAを抽出します。

8. 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)分析

注:すべてのRNA関連実験は、DEPC処理された消耗品を使用して実施されました。簡単に言うと、チューブとチップを0.1%DEPCに12時間浸し、オートクレーブ滅菌(121°C、20分)してRNaseと残留DEPCの両方を不活性化し、使用前にオーブン乾燥させました。

1. 細胞ペレットに1 mLのトリゾールを加え、ホモジナイザーを使用してホモジナイザーをホモジナイズします。室温で5分間インキュベートします。
2. 0.2 mLクロロホルムを加え、30秒間激しくボルテックスします。室温で3分間インキュベートします。
3. 4°C、12,000 × g で15分間遠心分離します。無色の水相を新しい微量遠心チューブに移し、同量のイソプロパノールを加えます。
4. よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。4°C、12,000 × g で10分間遠心分離します。上清を廃棄し、RNAペレットを保持します。
5. 1 mLの予備冷却された75%エタノールをRNAペレットに加えます。完全にボルテックスし、4°C、12,000 × g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、RNAペレットを保持します。
6. RNAペレットをバイオセーフティキャビネットで自然乾燥させます。RNAを20 μLのRNaseフリー水に溶解します。
7. Nanodrop分光光度計を使用してRNA濃度と品質を測定します。
8. 逆転写キットを使用して、トータルRNAをcDNAに逆転写します。
9. 1 μgの総RNA、4 μLの塩化マグネシウム溶液、2 μLのdNTP混合物、0.5 μLのRNase阻害剤、0.6 μLのAMV逆転写酵素、1 μLのランダムプライマー、およびRNaseフリーの水を含む反応混合物を調製し、最終容量を20 μLに調整します。
10. 反応を42°Cで15分間インキュベートし、続いて95°Cで5分間インキュベートします。4°Cで5分間冷却し、cDNAをRNaseフリーの水で希釈します。
11. 2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(表1)をそれぞれ0.2 μmol/Lの最終濃度で、およびRNaseフリーの水を含むPCR反応混合物を最終容量20 μLまで調製します。
12. PCR条件を次のように設定します:95°Cで1分間予備変性し、続いて95°Cで15秒間、60°Cで15秒間、72°Cで45秒間の40サイクルが続きます。72°C伸長ステップ中に蛍光データを収集します。
13. 反応後、各サンプルのCT値と内部基準を記録します。^2-ΔΔCT法を用いて標的遺伝子の相対発現量を算出します。

9. ELISAアッセイ

注:使用前に、ビオチン化抗体作業溶液と酵素複合体作業溶液を新鮮に調製してください。

1. 30分前にELISAキットを冷蔵庫から取り出し、室温まで平衡化させます。
2. キットの指示に従って、必要なすべての溶液を準備します。
3. 100 μLのサンプルまたは標準溶液(さまざまな濃度)を指定されたウェルに加えます(ゼロウェルには標準/サンプル希釈バッファーのみが含まれます)。プレートを粘着フィルムで密封し、37°Cで90分間インキュベートします(ブランクコントロールウェルを除く)。
4. 液体を廃棄し、各ウェルを350 μLの洗浄バッファーで洗浄します。30秒間インキュベートし、液体を廃棄し、厚い吸収紙で吸い取り干します。洗浄を4回繰り返します。
5. 各ウェルに100 μLのビオチン化抗体作業溶液を加えます。プレートを密封し、37°Cで60分間インキュベートします(ブランクコントロールウェルを除く)。
6. 液体を廃棄し、ステップ4で説明したように各ウェルを4回洗浄します。
7. 各ウェルに100 μLの酵素抱合体作業溶液を加えます。プレートを密封し、37°Cで30分間インキュベートします(ブランクコントロールウェルを除く)。
8. 液体を廃棄し、ステップ4で説明したように各ウェルを4回洗浄します。
9. 各ウェルに100 μLの基質溶液を加えます。光から保護し、37°Cで15分間インキュベートします。
10. 各ウェルに100 μLの停止溶液を加え、完全に混合し、すぐに450 nmの光学密度(OD)を測定します。
11. CurveExpertソフトウェアを使用して標準曲線を生成し、サンプル濃度を計算します。

10.ウェスタンブロット分析

注:実験の前に、電気泳動バッファー、転写バッファー、TBST、5%スキムミルクを準備し、PVDFメンブレンを事前に適切なサイズに切断します。続いて、化学発光イメージングシステムを使用して化学発光シグナルをキャプチャします。グラデーション露光の自動モードまたは手動モード(通常は10秒から5分の範囲)に設定して、信号がリニアダイナミックレンジ内でキャプチャされるようにし、ピクセルの飽和を回避します。信号キャプチャ後、ターゲットバンドが明確で背景が低い露光画像を選択して、その後の定量分析を行います。

1. RIPA溶解バッファー(1%PMSFおよび1%ホスファターゼ阻害剤を含む)を調製し、6ウェルプレートのウェルあたり250 μLの比率でRIPA溶解バッファーを加えます。
2. 超音波ディスラプターを使用して細胞を溶解し(3サイクル、各7〜10秒)、氷上で30分間インキュベートします。
3. ライセートを4°C、12,000 × g で10分間遠心分離し、タンパク質定量のために上清を収集します。
4. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
5. RIPA溶解バッファーを使用してタンパク質濃度を同じレベルに調整します。
6. 5× Loading Bufferを4:1の比率でサンプルに追加します(サンプル:バッファー)。
7. サンプルを10分間沸騰させた後、4°C、12,000 × g で10分間遠心分離し、電気泳動のために上清を回収します。
8. 電気泳動チャンバーでSDS-PAGEゲルを組み立て、コームが水没するまで電気泳動バッファーを充填します。
9. コームを取り外し、サンプルをウェルにロードし、プロテインラダーを基準レーンに追加します。
10. ブロモフェノールブルー色素がゲルの底に到達するまで電気泳動を実行し、装置を分解してゲルを回収します。
11. 転写「サンドイッチ」を組み立て、定電圧で湿式転写を行います。
12. 室温で1時間TBST中の5%スキムミルクでPVDFメンブレンをブロックします。
13. 希釈した一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
14. 一次抗体を回収し、メンブレンをTBSTで洗浄します(5×5分)。
15. HRP結合二次抗体と室温で90分間インキュベートします。
16. 二次抗体を回収し、メンブレンをTBSTで洗浄します(5×5分)。
17. ECL基質溶液を調製し、光から保護して保管します。
18. ECL基質を膜に塗布し、勾配露光のイメージングシステムを使用して化学発光シグナルを捕捉します。
19. ImageJソフトウェアを使用してバンド強度を解析し、相対的なタンパク質発現レベルを計算してさらに解析します。

結果

II型コラーゲンの免疫蛍光染色は、単離された軟骨細胞が強く陽性であることを示しました(図1A)。フローサイトメトリー分析により、細胞の98%以上がII型コラーゲンに対して陽性であるのに対し(図1B)、陰性対照SW1353細胞は陰性であることがさらに実証されました(図1C)。10 ng / ml IL-1βで24時間刺激した後、ウェスタンブロッティングは、軟骨細胞におけるMMP3およびMMP13タンパク質レベルの著しい上昇を示し(図2A)、RT-PCR分析により、軟骨細胞におけるMMP3およびMMP13 mRNA発現の有意な増加が明らかになり(図2B)、ELISAは細胞培養上清中のMMP3およびMMP13タンパク質含有量の大幅な上昇を検出しました(図2C)。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、初代ラット関節軟骨細胞の単離および培養にいくつかの重要な利点を提供します。若い動物の軟骨には成体の軟骨と比較して増殖性軟骨細胞が多く、石灰化マトリックスが少ないため、子育てラットの使用は最適な細胞収量と生存率を達成するために重要です。この年齢選択により、酵素消化とその後の細胞回収の効率が大幅に向上します。

逐次酵素消化アプローチは、このプロトコルの重要な側面を表しています。最初のトリプシン治療では末梢結合組織が効果的に除去され、軟骨マトリックスが部分的に破壊されますが、その後のコラゲナーゼII消化は、軟骨細胞を取り巻くII型コラーゲンに富む細胞外マトリックスを特異的に標的とします。4時間のコラゲナーゼ消化時間は、細胞の損傷を最小限に抑えながら完全な細胞放出のバランスをとるように最適化されています。消化期間が短いと細胞遊離が不完全になる可能性があり、長時間曝露すると細胞の生存率と表現型が損なわれる可能性があります。

シリンジプランジャ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% パラホルマルデヒド	ソーラービオ	P1110
5×ローディングバッファ	ソーラービオ	P1040
Alexa fluor 488結合抗ウサギIgG	中山景橋バイオテクノロジー	ZF-0511
動物フリーブロッキングソリューション	細胞シグナル伝達技術	15019
抗コラーゲンII抗体	アブカム	AB34712
ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット	ソーラービオ	PC0020
コラーゲンII	イェセン・バイオテクノロジー	40508ES60
DAPI含有蛍光マウント培地	中山景橋バイオテクノロジー	ZLI-9556
ダルベッコ改良イーグル・ミディアム	ソーラービオ	11995
胎児用牛血清(FBS)	ソーラービオ	S9010
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギIgG	中山景橋バイオテクノロジー	ZB-2301
IL-1とベータ;	ペプロテック	400-01B
MMP13 ウサギmAb	アクローナル	A11148
MMP3ウサギmAb	アクローナル	A11418
無脂肪ドライミルク	ソーラービオ	D3840
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	ソーラービオ	P1020
PVDF膜	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	88518
ラットMMP-13 ELISAキット	ヌーヴ	NBP3-06931
Rat MMP-3 ELISAキット	ヌーヴ	NBP3-06894
逆転写キット	プロメガ	A3500
RIPA溶解バッファー	ソーラービオ	R0010
RNaseフリー水	ソーラービオ	R1600
SDS-PAGEゲル	エピジム	PG112
SYBR Green リアルタイムPCRマスターミックス	トヨボ	QPK-201
トライトン X-100	ソーラービオ	T8200
トリゾル	ソーラービオ	15596026
トリプシン	ソーラービオ	T1320
超感度ECL化学発光基板キット	NCMバイオテック	P10300
&β;-アクチンウサギmAb	アクローナル	AC026