レプトスピラバイオフィルムの定量的、構造的、機能的分析のためのモジュール式ワークフロー

Summary

このプロトコルは、結晶バイオレットバイオマスアッセイ、タイムラプス位相コントラスト動態、共焦点3D/マトリックスマッピング、SEM超微細構造、 生体内 ハムスター感染モジュールを組み合わせたモジュール型BSL-2ワークフローを提供し、 レプトスピラ バイオフィルムの機能的役割を培養、定量、特徴付け、調査し、変異体および抗バイオフィルム介入の標準化評価を可能にします。

Abstract

ここでは、 レプトスピラ 属バイオフィルムの培養、定量的モニタリング、構造的および機能的特徴付けのための統合的なプロトコル群を提示します。このワークフローは、結晶バイオレットマイクロタイターアッセイによるバイオフィルムバイオマスの複数時点測定、結合(バイオフィルム)および非結合(液体相)細菌集団を区別する時間分解分画手法、非破壊動態観察のためのタイムラプス位相差イメージング、マトリックスプローブ読み取りによる完全な3D再構築を生成する共焦点レーザー走査顕微鏡、そして超微細解析のための膜支持走査型走査型電子顕微鏡を組み合わせています。 並行して、完全なバイオフィルム集合体を収穫し、感受性のあるゴールデンシリアンハムスターモデルへの腹腔内注射準備のための標準化手順を詳述し、これにより、生物フィルム関連病原性を生 体内 で直接評価し、適合したプランクトニンコントロールを用いることができます。

病原性株 Leptospira interrogans Manilae L495に最適化されており、各モジュールは他の レプトスピラ 種や変異ライブラリに容易に移行し、バイオフィルム形成能力を比較できます。これらの連携モジュールは、抗バイオフィルム戦略のスクリーニング、遺伝的決定因子の探究、バイオフィルムのレ プトスピラ 持続性と病因への貢献の明確化のための強固な基盤を提供します。

Introduction

バイオフィルムは、細胞が自己分泌される細胞外高分子物質(EPS)マトリックスに埋め込まれた構造化された微生物群集であり、多糖類、タンパク質、核酸、脂質から成ります^。このマトリックスは機械的安定性を提供し、表面への接着を媒介し、乾燥、酸化ストレス、抗菌剤などの環境ストレスに対する耐性を与えることで微生物の生存率を高めます ^2,3。病原性細菌において、バイオフィルムは持続性、免疫回避、慢性感染を促進します ^4,5.

自由漂浮し代謝的に均質なプランクトン細胞と比較すると、バイオフィルム関連細胞は遺伝子発現、成長速度、代謝活性が変化しています⁶。これらの違いにより、環境的課題、抗生物質、宿主防御に対する耐性が向上し、クオーラムセンシング、栄養保持、^{空間組織などの}協調的な行動が可能になります^7,8。

バイオフィルム形成は、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Vibrio choleraeなどのモデル生物で広く解析されており、これらがバイオフィルムライフスタイルの遺伝的、構造的、生理学的基盤の理解を形作っています。緑膿菌に関する研究では、外多糖とクォラムセンシングが協力して複雑な三次元バイオフィルム構造を形成していることが明らかになりました ^9,10。ブドウ球菌の研究では、表面タンパク質や細胞外DNAがバイオフィルムの結合性や抗生物質耐性を高める役割が強調されています(^11,12)。ビブリオ種の調査は、バイオフィルム形態の驚くべき多様性と、水生環境における生態学的意義¹³をさらに浮き彫りにしました。これらのシステムは合わせて、標準化されたプロトコル¹⁴および既存技術の批判的評価^15,16によって強化された堅牢な概念的かつ方法論的枠組みを提供し、レプトスピラなどのあまり研究されていない細菌におけるバイオフィルム形成の調和的なアプローチの必要性を強調しています。

レプトスピラ症の原因菌であるスピロヘッテ属レプトスピラのメンバーは、長らく主にプランクトニック性と考えられていました。最近の研究では、複数の種で堅牢なバイオフィルム形成が実験的に示されています¹⁷。一部の研究では環境¹⁸および宿主関連¹⁹文脈でのバイオフィルム形成が示唆されていますが、他の研究ではラトゥス・ノルベギクス²⁰の腎小管にレプトススパイラルがバイオフィルムを形成し、馬²¹の硝子体内でバイオフィルムを形成し、環境バイオフィルム^22,23内でレプトスピラ種を検出できることが実験的に示されています。したがって、レプトスピラバイオフィルムを支配する条件とメカニズムを解明することは、環境伝播、貯留層の持続性、病原の発生性を理解する上で極めて重要です^24,25。

既存のレプトスピラバイオフィルムアッセイは断片的であり、定性的顕微鏡観察^17,26から終末の比色または結晶バイオレット染色^27,28まで幅広く分布しています。これらの研究はバイオフィルム形成に関する貴重な洞察を提供しましたが、バイオフィルムの成熟と拡散をリアルタイムで監視するために必要な運動分解能や、共焦点顕微鏡や電子顕微鏡による超微構造的文脈を欠くことが多いです。バイオフィルム形成と拡散の動的な性質を捉えるためには、継続的なモニタリングと3D構造解析が不可欠と考えられています^14,15。これらの制限は研究間の比較性を妨げ、バイオフィルム形成や分散に影響を与える要因や介入の体系的評価を妨げているため、レプトスピルやバイオフィルムの構造的および機能的動態を再現可能かつ包括的に捉える標準化されたマルチリードアウトワークフローの必要性が浮き彫りになっています。

これらのギャップを埋めるために、同じ文化シリーズから抽出された6つの補完的なデータ結果を統合した統合されたモジュール式ワークフローを開発しました。まず、高スループットCVマイクロタイターアッセイは複数の時点で付着したバイオマスを定量します。次に、96ウェルプレートでの時間分解分画アッセイにより、全相、液相(非付着または部分的に剥離された)、および付着(バイオフィルム)集団をOD₄₀₅で分割し、形成および分散中の進化を追跡します。ここで「液体相」という用語は、プランクトニック様細胞と分離細胞の両方を包含し、自由生活と表面関連表現型の動的連続体を認めています^29,30。第三に、タイムラプス位相差イメージングは、接着、集合運動性、凝集の非破壊的な動力学を提供します。第四に、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、ライブ/デッドおよびマトリックスプローブの読み取りを含む完全な3D再構築を実現し、深さ依存の生存可能性とマトリックスマッピングを可能にします。第五に、膜またはカバースリップ支持型走査型電子顕微鏡(SEM)は、細胞外構造と基底-頂端極性を高解像度で解明します。さらに、レプトスピラ症^31,32,33の感度が高く確立されたモデルである感受性のゴールデンシリアンハムスターモデルに、バイオフィルム集合体を腹膜内注射して病原性を評価するためのin vivoモジュールも組み込まれました。このアプローチはバイオフィルム表現型と病原性の可能性を結びつけ、in vitro解析を補完する機能的文脈を提供します。

単一モーダリティ手法と比較して、このプラットフォームはいくつかの利点を提供します:(i) 同期された定量的(CVおよび分画OD)および構造(CLSM/SEM)読み取り;(ii) 早期接着、成長、成熟、分散の非破壊的動力学モニタリング;(iii) ターゲットプローブを用いた3次元実用性とマトリックス特性評価;(iv) 細胞外マトリックス構造の超微細構造的可視化;および(v)感受性ハムスターモデルにおけるバイオフィルム関連病原性とプランクトニック病原性の直接的な機能評価(いずれも標準BSL-2インフラで達成可能)。マルチウェルフォーマットと取り外し可能なガラスまたはポリカーボネート基板を活用することで、環境変数、抗菌化合物、または変異体ライブラリの再現スクリーニングをサポートしつつ、無菌性、スループット、モジュール間の交差検証を維持します。

生態学、持続性、宿主-病原体相互作用、または抗バイオフィルム発見に焦点を当てた研究室は、個別モジュールまたは全パイプラインを採用可能です。必要な資源はプレートリーダー、タイムラプス用の環境制御付き倒立顕微鏡、共焦点顕微鏡およびSEM施設へのアクセス、ハムスターモデル用の標準動物施設に限られており、広範な採用と研究間の再現性比較を可能にします。

Protocol

倫理声明:
この研究はニューカレドニア・パスツール研究所動物ケア・利用委員会の承認を受け、パリ・パスツール研究所動物ケア・利用委員会および欧州勧告2007/526/ECのガイドラインに従って実施されました。動物研究実験登録番号:IPNC-2018-ARE-001

注:生体 レプトスピラ 培養を含むすべての手順は、機関のバイオセーフティガイドラインに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の検査室で実施されなければなりません。すべての培養操作は、オペレーターの安全を確保し環境汚染を防ぐために生物安全キャビネットの下で行われなければなりません。

本研究で使用された Leptospira interrogans serovar Manilae株L495は、もともとパスツール研究所(パリ、フランス)コレクションから入手し、現在ニューカレドニアパスツール研究所で保管されています。病原性を保つために、感染したハムスターから定期的に株を再分離しています。すべての in vitro 実験において、動物宿主からの回収後は6回のサブカルチャーを超えて培養を維持しませんでした。

すべての動物処置は、機関のガイドラインに従って実施され、適切な動物ケア・利用委員会の承認を得なければなりません。実験は欧州の動物福祉規制(EU指令2010/63)および公衆衛生局の勧告を遵守し、動物の使用が正当かつ倫理的に規制されていることを保証すべきです。

1. 細菌接種剤の調製

1. Leptospira spp.細胞をEMJH培地^34の30°Cで好気性条件下で、平底のスクリューキャップガラス管で振動せずに培養し、培養がログフェーズの中間段階に達するまで培養します。このような条件下では、ハムスターを通じて定期的に維持される低通過系統であるL. interrogans serovar Manilae株L495は通常、3〜5日以内に適切な細胞密度に達します。培養液を405nm(2〜5×10、⁸細胞/mL)で0.2〜0.4のO.D.に到達させ、その後新しいEMJH培地で希釈し、20倍倍の暗野顕微鏡で運動性や凝集の有無を確認します。
   注:EMJHは内在吸収力を持っています。分光光度計を無菌EMJHで空白し、この値をすべての測定値から差し引いてください。接種物質は、光学密度の測定またはペトロフ・ハウサーチャンバーを用いた直接細胞計数によって標準化できます。検証済みの中間ログ培養を1:100で希釈すると、通常OD₄₀₅ = 0.02(1 x 10⁶ cells/mL≈)となります。逆行で優しくミックスします。渦巻くな。
2. 暗野顕微鏡で20倍の拡大で10μLのアリコートを調べます。細胞の90%≥高い運動性があり、目に見える塊が存在しないことを確認してください。検証済みのミッドログ培養を1:100で新鮮なEMJHに希釈し、OD₄₀₅ = 0.02(≈ 1×10⁶ cells/mL)を得ます。逆行で優しくミックスします。渦巻くな。
   注:1つの動作する接種装置は、このプロトコル(図1)に記載されたすべての下流アッセイをサポートします。24ウェルプレート(1 mL/ウェル)にシードするために36 mL、または96ウェルプレート(200 μL/ウェル)にシードするために20 mLを準備します。必要なプレートの数に合わせて体積を調整してください。

図1。 レプトスピラ バイオフィルム解析のグローバルワークフロー。指数関数的に成長する レプトスピラ 培養はまず成長の有無を評価し、光学密度によって標準化されます。その後、培養物はガラスまたは膜を含むプレート、顕微鏡マイクロディッシュ、または96ウェルプレートに配布されます。ワークフローは7つのモジュールで構成されています:(1) 接種物質製製;(2) バイオマス定量のための結晶バイオレット染色;(3) SEMによる超微構造イメージング;(4) タイムラプス位相差顕微鏡による動的バイオフィルムモニタリング;(5) CLSMによるライブ/デッド染色による3D可視化;(6) バイオフィルム形成中の結合型および非付着型の時間分解による光学密度 定量 ;(7) シリアハムスターにおける感染時のバイオフィルム機能的役割の調査。この統合的アプローチにより、バイオフィルムの発生、構造、病原性を多様式で分析することが可能です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. クリスタルバイオレット - カバーリップや膜上のバイオフィルムの定量化

1. BSL2バイオセーフティフード内では、滅菌ピンセットを使って、12mmの無菌ガラスカバースリップまたは0.1μmの無菌親水性ポリカーボネート膜を、無菌24ウェルプレート(蓋付き)の底に平らに置きます。膜/ガラスカバースリップを30°Cで2時間、1mLの滅菌EMJHで浸けます。
   注:必須ではありませんが、EMJHに基質を事前に浸すことで湿潤性が改善され、細菌の付着がわずかに強化されます。
2. 浸漬液を取り出し、各ウェルに希釈した細菌懸濁液(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL)を1.5 mL加えます。カバースリップやメンブレンが底にしっかり固定されていることを確認してください。
3. 培地を30°Cの静的条件下、湿った大気で培養し、培養培地の蒸発を防ぐためにインキュベーター内に水を充填したトレイを置いて維持します。成長が遅い株には、成熟した粘着性のあるバイオフィルムの形成を促すために3週間の潜伏が推奨されます。
4. 所定のタイミングで、バイオフィルムを乱さないように各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に除去してください。各ウェルを1mLの滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で優しくすすいで、残留した非接着細胞を除去します。カバースリップはウェル底部にぴったりと保ち、脆弱なバイオフィルム細胞の剥離を防ぎます。このような条件下では、バイオフィルムの成長は主にカバースリップの上表面で起こり、裏面では最小限の成長が見られるため、浮かせずに洗浄するだけで、表面付着細胞の濃縮は下流解析に十分です。
   注意:この段階でバイオフィルムは非常に脆弱で、誤って誤嚥しやすいです。ピペットはバイオフィルムを破壊しないように、井戸の壁に沿ってゆっくりと正確に行うべきです。
5. バイオフィルムサンプルを定着するには、4%パラホルムアルデヒド(PFA)1mLをPBSに37°Cで30分間添加します。固定液を除去し、1mLのPBSで慎重に2回すすいでください。
   注:固定には、4%ホルムアルデヒド溶液(16%メタノール無添加ストックをPBSで1:4で希釈)を新たに準備し、使用後に廃棄しました。これは、パラホルムアルデヒドへの重合によって架橋活性が低下するためです。
6. 各ウェルに0.1%(w/v)クリスタルバイオレット(CV)溶液1mlを加え、室温で15分間培養します。膜またはカバースリップが完全に覆われるようにします。
7. 染料は捨てて、1mLのPBSで2回洗い流します。
   注意:クリスタルバイオレットとパラホルマルデヒド(PFA)は有毒で、皮膚や目を刺激することがあります。常に手袋を着用し、両方の化学薬品を慎重に扱い、できれば排気フード内で取り扱ってください。廃棄物は、機関の安全ガイドラインに従って指定された有害染料または化学廃棄物容器に廃棄してください。
8. プレートを傾けて残留液を排出します。井戸を室温で自然乾燥させ、基質が完全に乾いたように見えるまで(≥4時間、できれば一晩過ごす)。
   注:この段階では、カバースリップや膜表面に点状または網状構造が見られることがあります(図2A)。
9. 各井戸に500μLの洗脱バッファー(50%エタノール、50%氷河酢酸(vol/vol))を加えます。プレートを15分間孵化させます。ピペットを上下に動かして、バイオフィルムに結合したクリスタルバイオレットを完全に溶かします。
10. 各サンプルのうち200μLを光学的に透明な96ウェルマイクロプレートに移し、570nmで吸収を測定します。未接種のカバースリップや膜を固定、CV染色、洗浄、洗脱処理で処理し、内在結合や背景を除去して基質のみのブランクを差し引います。少なくとも3回の技術的再現±平均標準偏差を記録してください。吸収度が分光光度計の線形範囲を超える場合は、試料を希釈バッファーで希釈します。

3. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いたバイオフィルム可視化

1. BSL2バイオセーフティフード内では、滅菌ピンセットを使って、12mmの無菌ガラスカバースリップまたは0.1μmの無菌親水性ポリカーボネート膜を、無菌24ウェルプレート(蓋付き)の底に平らに置きます。膜/ガラスカバースリップを30°Cで2時間、1mLの滅菌EMJHで浸けます。
2. 浸漬液を取り出し、各ウェルに希釈した細菌懸濁液(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL)を1.5 mL加えます。カバースリップやメンブレンが底にしっかり固定されていることを確認してください。
3. 培養培地の蒸発を防ぐため、湿度管理インキュベーター内で静的条件下で30°Cで培養皿を培養します。成長が遅い株には、成熟した粘着性のあるバイオフィルムの形成を促すために3週間の潜伏が推奨されます
4. 所定のタイミングで、バイオフィルムを乱さないように各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に除去してください。
5. その後、各ウェルに1mLの滅菌PBSを優しくすすいで残留する非接着細胞を除去し、カバースリップをウェル底部に平らに保ち、脆弱なバイオフィルム細胞の剥離を防ぎます。このような条件下では、バイオフィルムの成長は主にカバースリップの上表面で起こり、裏面では最小限の成長が見られるため、浮かせずに洗浄するだけで、表面付着細胞の濃縮は下流解析に十分です。
   注意:この段階でバイオフィルムは非常に脆弱で、誤って誤嚥しやすいです。ピペットはバイオフィルムを破壊しないように、井戸の壁に沿ってゆっくりと正確に行うべきです。
6. 4%パラホルマルデヒド(PFA)と1%グルターアルデヒドをナトリウムカコジレート緩衝液(0.2 M、pH 7.4)に直接ウェルに加え、バイオフィルムを固定します。
7. 37°Cで30分間培養した後、固定液を除去し、カバースリップまたは膜をPBSで2回洗い流します。この方法は表面付着バイオフィルムを保持しつつ剥離を最小限に抑えます。なぜなら、私たちの条件下ではほとんどのバイオフィルムの成長がカバースリップの上表面で起こるからです。
   注:固定には、4%ホルムアルデヒドおよび1%グルターアルデヒド溶液を新たに準備し(16%メタノールフリーストックをナトリウムカコジレートバッファーで1:4で希釈)、使用後に廃棄しました。これは、パラホルマルデヒドへの重合が架橋活性を低下させるためです。
8. 基板をPBSで希釈した1%の四酸化オスミウム(OsO₄)に1時間浸けてSEMコントラストを高めます。PBSで2回洗い流してください。
9. 試料を濃度が徐々に増加する段階のエタノール系列(25%、50%、70%、90%、100%(v/v)に順次浸けて脱水します。それぞれ10分間。
10. ヘキサメチルジシラザン500 μLを加えて5分間培養し、その後新鮮なHMDSに交換し、さらに5分間培養します。余分なHMDSを取り除き、サンプルをフュームフードの下で完全に自然乾燥させます。
    注意:グルターアルデヒド、PFA、カコジル酸ナトリウム、四酸化オスミウム、ヘキサメチルジシラザンは有毒であり、適切な個人用防護具とともに化学煙幕の下で取り扱う必要があります。
11. 乾燥したサンプルを両面導電性カーボンテープでSEMスタブに取り付けます。試料に薄い層(~10 nm)の金またはプラチナをスパッターコーティングし、SEMイメージングに必要な十分な電子コントラストを提供します。これにより、追加の染料や染色を必要とせずに、細胞間接触、細胞外マトリックスの形態、密度、異質性を含むバイオフィルム構造の高解像度可視化が可能になります。
12. 適切なサンプルホルダーを使ってスタブをSEMに積み込みます。可能であれば、画像品質を向上させるためにチャンバーを一晩ほど空にし、その後5〜15 kVの二次電子画像と適切な倍率でバイオフィルム超微細構造を明らかにします(図2)。

4. 成長中のバイオフィルムのタイムラプス位相コントラストイメージング

1. 作業中の接種物500 μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ cells/mL;セクション 1参照)を、半月板の歪みを除去するために平面平行の蓋を備えた滅菌35mmガラス底Hi-Q4皿にピペットを移します。気泡を避け、すぐに皿を閉じてください。
   注:35mmガラス底のHi-Q4ディッシュには、4つの異なる培養領域を同時に撮影できます。1区画を無菌EMJH培地にネガティブコントロールとして割り当て、残りの3区画を技術的複製や異なる株・変異体用に割り当てます。
2. 逆立顕微鏡の環境ステージにアンテナを設置し、位相差光学機器、モーターフォーカスドライブ(Biostation IMQ)、30°C、95%相対湿度に設定された加湿ケーケースを備えます。これらの条件は、最大8日間の長時間撮影中の蒸発を最小限に抑えるのに役立ちます。
3. BioStation IMQアプリケーションを起動し、メインインターフェースで 新しいタイムラプス設定 ウィンドウを開くと設定パネルにアクセスできます。実験開始前に、ステータスディスプレイの環境パラメータを確認し、チャンバーと水温の両方の表示が安定しているかを確認し、取得時のフレームドリフトを防ぎます。
4. 新しいタイムラプス設定画面で「 ライブ 」タブを選択し、 観察条件 パネルで「 位相コントラスト(Ph) 」をフィルターにし、 倍率 を 20倍に設定してイメージングパラメータを設定します。
5. マニュアルモードでは、光の強度と露光時間を調整し、飽和を防ぎつつコントラストを最適化します。これを彩度チェックボタンで確認してください。4つの区画の中心に対応する4つの取得点を定義します。
6. ジョグダイヤルを使うか、 ライブオブザベーションイメージ ディスプレイ内を直接クリックして、各区画に順次配置してください。
7. フォーカスボタンでフォーカスを絞り、 タイムラプスの実験ポイント登録 ボタンをクリックして各位置を記録します。登録されたポイントは観測ポイント検証ディスプレイで青い数字フレームとして表示され、ポイントタブで確認されます。
8. 取得スケジュールをプログラムするには 、タイム タブを開き「 新設 」をクリックしてタイム ラプスダイアログ ボックスにアクセスします。ここでは 取得サイクル が 30分 、 合計時間 が 7日に設定されています。
9. 「適用」をクリックすると、ソフトウェアが自動的に取得ラウンド数を計算します。タイトルバーを右クリックし、設定を選択し、AFモードを有効にすると、各ステージ位置でリフォーカスが確実に行われます。すべてのポイントで露出設定、ゲイン、光強度の一貫性を確認し、保存ボタンで全体の構成を保存します。
10. 取得を始めるには 、タイムラプス開始をクリックしてください。ソフトウェアは自動的にタイムラプス画像に切り替わり、7日間の実験を通じて取得進捗とチャンバーの安定性を継続的に監視できます。すべての画像は、ソフトウェアが作成するexperimentフォルダ内にTIFF形式で自動的に保存されます。
11. 画像スタックをFIJIにインポートして画像系列を処理・定量化します(図3A, B, C)。
12. 各位置に対応する画像スタックをファイル >インポート>画像シーケンスで開き、フレームが時系列順に読み込まれるようにしてください。
13. アラインされたスタックをImage > Type > 8ビット で8ビットグレースケールに変換し、ピクセル強度を標準化します。
14. 画像> しきい値を調整して細菌バイオフィルム領域を分離>閾値化します。すべてのフレームで一貫した閾値設定を適用し、「適用」を選択し、結果を「Process > Binary > Make Binary」でバイナリマスクとして保存します。
15. Analyze Particles>Analyze Particlesで定量化を行い、面積、面積、平均強度などのパラメータを記録します。
16. 各フレームの結果を結果 ウィンドウ (ファイル>「保存」> .csv)を通じて自動的にスプレッドシートにエクスポートし、運動解析を行います。すべての測定値は、バイオフィルムが覆うフィールド面積(表面被覆)の割合で表します。

5. 共焦点走査レーザー顕微鏡(CLSM)を用いたバイオフィルム可視化

1. 作動接種物1.5mL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1×10⁶ cells/mL ;セクション1参照)を無菌35mmのガラス底皿に接種します。湿度を上げた箱で、水の貯蔵庫を含むインキュベーター内で静的に30°Cで培養し、望ましい発育段階(最大21日)に達するまで待つ。
2. 指定されたタイミングで、バイオフィルムを乱さずに皿の壁に沿ってゆっくりと培地を吸引します。2mLの滅菌PBSで一度だけすがいでプランクトニック細胞を取り除き、バイオフィルムを剥がしたり破損させたりしないよう十分注意してください。
3. 未定住(生の)バイオフィルムで培養が必要な染色液を準備します(固定前に実施)。
   1. 生死染色の場合、3μL SYTO9緑色蛍光核酸染色(1.67 mM)と3 μLヨウ化プロピジウム(18.3 mM)を10 mL PBSに加え、染色溶液を作ります。染色液200μLをバイオフィルム形成の細菌に直接加え、暗室室温で30分間培養し、PBSで一度すすぎます。
   2. また、固定前に細胞を染色するためにも生細胞トレーサーを使用できます。10μMのCFDA/SEトレーサーで30分間培養します。または、5 μg/mLの濃度で膜にFM4-64を標識する方法も使用可能です。PBSで一度だけすすぎてください。
4. 4%パラホルマルデヒド溶液2mLをPBSに加え、37°Cで30分間培養してバイオフィルムを固定します。 固定液を除去し、PBSで2回洗い流します。
5. バイオフィルムを覆うためにアンチフェードマウントメディウムを一滴加え、気泡を防ぎます。
6. 調整可能な白色光レーザー(WLL)とHC PL APO CS2 63×/1.4 NA油浸対物レンズを搭載した倒立共焦点顕微鏡でZスタックを取得します。CFDA/SEでは、励起を488 nmに設定し、1エアリー単位(AU)のピンホールを使って500〜550 nmの放射を収集します。FM4-64では励起を561 nmに設定し、630〜700 nmの発光を検出し、こちらも1AUのピンホールを使います。
7. バイオフィルム厚全体にわたって0.5〜1.0μm間隔でZスタックを取得します。レーザー出力と検出器の利得を調整し、飽和(<1%の飽和ピクセル)を避けつつダイナミックレンジを最大化してください。
8. 線平均法(2〜4×)を用いて信号対雑音比を改善し、すべてのイメージングパラメータ(レーザー出力、検出器帯域幅、ピンホールサイズ、スキャン速度)を試料間で一定に保ちます。
9. 画像スタックを12ビットファイルとして保存し、FIJI(ImageJ)で定量分析のために.lif形式でエクスポートしてください。
   注意:イメージング前に、顕微鏡の設定(例:レーザー出力、検出器利得、ピンホールサイズ)が同じ染料で染色された対照試料で標準化されていることを確認してください。この校正ステップは、取得間の変動を最小限に抑え、実験間での信頼性の高い比較を可能にするために不可欠です。
10. COMSTATプラグイン(または同等の3D解析ソフトウェア)を搭載したFIJIを用いて、共焦点画像スタックを処理・定量化します¹⁰.バイオボリューム、平均および最大厚さ、表面被覆率、生死比(または他のあらかじめ定められた指標)を測定してください。図示目的のための代表的な直交視点と最大強度投影(図3D, E)。

6. 96ウェルマイクロタイターアッセイにおけるバイオフィルム形成中の付着型および非付着型画の時間分解定量

1. 作動接種物200μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1×10⁶ セル/mL;セクション1参照)を96ウェルプレートのウェルに接種します。30°Cで静的に培養し、希望の時刻(3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、17日目、または21日目)まで待機します。
   注意:96ウェルプレートを使用する場合、特にインキュベーターに湿度制御ができない場合、境界効果や蒸発が一般的です。これらの影響を最小限に抑えるために、すべての周辺井戸に200μLの無菌蒸留水を加えます。さらに、プレートは加湿ボックス内に収められ、水の貯蔵池はインキュベーター内に設置され、蒸発をさらに減らし、井戸全体の湿度を均一に保ちました。
2. 各時点で3種類のサンプルを準備します。
   1. 全懸濁 - バイオフィルムを含む1つの井戸の全成分を、気泡形成を避けながら優しく上下に均質化します。この割合は、非付着型レプトスピールと半接着型バイオフィルム内の細菌を含む細菌全体の個体群を表します。この均質化ステップは、後続の吸収度測定に干渉する可能性のある細胞集合体を分散させるのに役立ちます。
   2. 液相 - 2つ目の井戸から、バイオフィルム層を乱さずに180μLの上清液を慎重に除去します。空の井戸に移し、新鮮なEMJH培地20μLを加えます。細胞凝集体を分散させるために、優しく上下にピペットを数回動かします。この割合は液相に存在する非結合細胞を表し、自由懸浮レプトスピルや剥離されたバイオフィルム集合体の両方を含む場合があります。
   3. バイオフィルム - ステップ2.2と同じ井戸で、180μLの新鮮EMJH培地を加え、ピペットで数回優しく上下にかけて残りのバイオフィルムを再懸濁します。この割合はバイオフィルム内のレプトスピールに対応します。
3. 各井戸が十分に均質化されていることを確認した後、分光光度計を用いて各懸濁液の吸収を測定し、その値をプロットして代表的なグラフを作成します(図4A)。

7. 宿主感染時のバイオフィルムの機能的役割の調査

1. 作動接種物200μL(OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1×10⁶ セル/mL;セクション1参照)を96ウェルプレートのウェルに接種します。30°Cで静的に培養し、望ましい発育段階(最大21日)に達するまで続けます。
2. 接種物濃度を決定するために、動物注射には使わず、成長モニタリングのみに使用される特定の「バイオフィルムコントロール」井戸を設けてください。バイオフィルムがマクロ視的に見えるようになったら、1つのコントロールウェルから180μLの上清液をバイオフィルムを乱さずに優しく除去します。180μLの新鮮EMJH培地に置き換え、バイオフィルム集合体を気泡を発生させないように慎重に再懸濁し、OD₄₀₅ を測定して細菌濃度を推定します。
   注:原則として、定量前に井戸を洗浄することで、非接着細胞の除去に役立つ可能性があります。しかし、 レプトスピラ のバイオフィルムは96ウェルプレートで接着が弱いため、洗浄するとバイオフィルム物質の制御不能な損失が生じます。このため、ウェル間の再現性と一定の細菌濃度を確保するために、事前洗浄なしで再懸濁処理が行われました。
   バイオフィルムコントロール井戸には通常、約2×10⁸ レプトスピアが含まれており、これはハムスター感染実験の標準接種源として選ばれました。この濃度はまた、制御として用いられるプランクトン系レプトスピールの目標数も定義します。プランクトニン制御は、30°Cの振動条件下でEMJH培地でレ プトスピラ を新たにサブカルチャーし、最大5日間、類似の細胞密度を得る中後期指数関数成長段階に対応します。
3. 動物予防接種には、別々のバイオフィルムウェル(対照ウェルではなく)を使いましょう。ほとんどの液相レプトスピアを除去するために、ウェルから180μLの上清液を慎重に除去します。
4. 構造を破壊しないように、200μLのピペットチップで残りの20μLを含むバイオフィルム集合体を採取します。
   注:バイオフィルムは脆弱です。集約の前後に骨材が見えるようにしましょう。繰り返しが必要な場合に備えて、余分な井戸を用意してください。
5. 骨材を300μLの新鮮EMJH培地でプリ充填したシリンジに移します。骨材が重力で沈殿するのを待ちます。
6. 21Gの針を装着し、余分なEMJHを優しく排出し、最終体積200μLに達するまで続けます。気泡が残らないようにし、バイオフィルムの集合体が目に見えるようにしてください。
   注:総計が落ち着くのを待つことで、取引量調整時の損失を最小限に抑えます。 in vivo 使用前に、21Gの針を通過した後も凝集体が無傷であることを確認しましょう(図4C, D)。
7. 200μL EMJH培地に2×10⁸レプトスピルを腹腔内注射します。
   注意:7〜8週間齢のゴールデンシリアンハムスター(オス両方)を使用し、標準的な飼育環境で飼育してください。陰性対照の場合は、200μLのEMJH培地のみを注入します(1回の複製につき1匹の動物)。
8. 動物は1日2回、最大21日間、レプトスピラ症の臨床症状(毛の乱れ、伏せ、刺激反応の低下)を観察します。苦しみが見られた場合は直ちに二酸化炭素吸入 で 安楽死し、安楽死の時間を死亡時刻として記録してください。
9. 21日目に、生存したすべての動物を安楽死させてください。
   注意:異なる日付に培養を準備した3回の独立した生物学的複製を実施してください。各レプリケートには、各疾患につき2匹の動物と、1匹のネガティブコントロール動物が含まれます。

Results

接種点が正しく準備されると、培養は3〜5日以内に中間ログフェーズに入り、OD₄₀₅ 値は~0.2〜0.4、暗野顕微鏡下では明るく高い運動性の場≥(細胞の90%の可動性)が見られ、塊は目に見えません。最適でない調製は、細菌の動きが鈍く、フィールド全体で運動性が不均一であることが挙げられます。このような培養はしばしば弱いバイオフィルムを得られ、廃棄されるべきです。実際には、シード直前に運動性とODを並べて確認することで、失敗したランを最小限に抑えます。接種段階でこれらの品質管理ゲートを確立することが、下流アプリケーション全体の成功を予測する最良の指標です。この方法論はL . interrogans serovar Manilae L495に最適化されましたが、同じ手順は Leptospira biflexa Patoc株にも適用され、種を超えた適用性を実証しました。 L. biflexa は一般的に L. interrogansに比べて結合性が低く薄いバイオフィルムを形成しますが、適切なパラメータ調整により特徴的な発生過程や構造的特徴は検出可能です。したがって、両種を含めることは、病原性および腐生性 レプトスピラ の両方に適応できるワークフローであることを強調しています。

加湿チャンバーで30°Cで21日間静的培養(またはレ プトスピラ 属に適した期間)後、ガラスカバースリップと親水性ポリカーボネート膜の両方にバイオフィルムが肉眼で確認されます。成功した成長は、2〜3週間後に点状、分岐状、または網状のフットプリントが表面に付着する特徴的なCVパターンを生み出します(図2A)。

典型的な調査では、野生型 L. interrogans のManilae L495は3週目までに~50%の表面被覆率に達し、低バイオフィルム変異体は約~20%、高バイオフィルム表現型は~70-80%に近づき、スクリーニングのための実用的なダイナミックレンジが確立されます。バイオフィルム形成の範囲は、 レプトスピラ 属の種や株によっても異なる場合があります。例えば、 L. biflexa Patoc株は目に見えるバイオフィルムをより速く形成し、以前の研究では接種後120時間以内の構造が成熟バイオフィルム³⁵とみなされています。

クリスタルバイオレット染色は、バイオフィルムバイオマスを定量化する信頼性が高く再現性の高い方法を提供します。よく発達したバイオフィルムでは、染色によりカバースリップや膜部分に局所的な深い紫色が現れ、高いレベルのバイオマスが付与されていることを示します(図2A)。染色および溶解の過程での視覚的な手がかりも、プロトコルの成功を示す有用な指標となります。例えば、CVの分布の不均一や淡い染色は、種の落とし、蒸発、または早期バイオフィルムを剥がす激しい洗浄によるものである可能性があります。

570nmでの吸収度は、残留染色の量を反映し、それに伴いバイオフィルムの相対密度を示します(図2B)。代表的な実験では、最適な条件下で培養されたL. interrogans培養が複製体間で一貫して再現可能なOD₅₇₀の読み取りを示し、安定したバイオフィルム形成を反映しています。一方、培地交換時に過剰なピペッティングを行うと、重複品間で大きな変動が見られることがよくあり、接着不良や部分的なバイオフィルム剥離を示しています。このような変動は技術的な問題の兆候とみなされ、影響を受けたサンプルは除外するか、プロトコルを慎重に見直すべきです。特に、L. biflexa Patocは同様の条件下でガラスカバースリップやポリカーボネート膜により広範なバイオフィルムを形成し、これがより高いCV吸収率に反映され、このプロトコルがレプトスピラ種全体で適応可能かつ効果的であることを示しています。

成功したSEM製製により、細胞外マトリックスの堆積物が3日目から明らかになり、成熟したバイオフィルムでは著しく偏光した構造が現れます。すなわち、多孔質の内部構造を固定する粗いチャネル状の基底面(しばしば> μmチャネル付き)と、スピロヘートが密なマトリックスに絡み合うより滑らかな頂端面(図2C、 D、E、F)。高倍率フィールドはしばしば分岐した細胞外フィラメントや時折現れるキノコのような突起を捉えます。タイムラプスで見られる結合力学に対応する特徴(補足動画1)。最適でない調製では、マトリックスの崩壊、充電、セルの輪郭が不明瞭になることがあり、通常は後固定の不十分、導電性コーティングの不十分、乾燥不良を反映しています。基底-頂端極性および広域チャネルが明らかな場合、SEMの読み取り値は厚さと多孔度の共焦点推定値と密接に一致し、調製および画像の成功を裏付けます。

効果的なタイムラプスシリーズでは、孤立した点が24〜72時間以内に現れ、徐々により大きな集合体へと凝集し、空間の制約で動きが遅くなるまで表面を横断します(図3A, B, C)。定量的セグメンテーションでは総被覆面積が単調的に増加し、合計カウントは衝突や合併が支配的になると増加しピーク、そして減少します。これらの運動学(面積が上がり、集合体が減少する)は、単なる堆積ではなく活発な付着を示しています。失敗または境界線上のランでは、序盤のパンクタが見られず、面積の曲線が平坦で、不安定な温度・湿度に関連した焦点のずれが見られます。湿度95%で30°Cの安定した環境を維持し、各タイミングでオートフォーカスを使うことで、変異体や治療法の比較に適した明確な軌道が回復します。

成熟バイオフィルムからの代表的なZスタックは、通常50μmを超えるフォーム状の多層構造を示し、ほとんどの細胞は生きた染色(SYTO 9陽性)で、成長中の集団再配置を示す中央空洞が時折見られます(図3D)。マトリックスプローブはマトリックス組成の調査に用いられます。WGAは多糖エピトープを強調し、BOBO-3は豊富な細胞外DNAを標識し、タンパク質選択性染色は細胞外からのシグナルをほとんど寄与しません(図3E)。最適でない結果には、プロピジウムヨウ化物が支配的な薄いまたは不連続なスタック、強い光漂白、または不均一なゲイン設定があり、これらは定量的な比較性を損なう。厚さ、生体積、ライブ/デッド比を合わせて解釈し(レーザー出力、検出器利得、ピンホールを条件を問わず一定に保つ) 成熟状態を確認し、SEM超微細構造やCVバイオマスとの直接比較を支持します。

レプトスピラのバイオフィルム形成過程は通常、異なる段階を経ますが、正確なタイミングや値は種や株によって異なります。L. interrogans株のManilae L495を参考にすると、21日間の予想進行には、細菌が主にプランクトン性でバイオフィルムが最小限の状態にある初期段階(0日目から3日目)が含まれます(図4A)。その後、指数関数的な成長段階(3日目から7日目)が続き、プランクトン性およびバイオフィルム関連細菌が増加し、約9 x 10⁸細胞/mLに達し、バイオフィルム集合体の形成と拡大が伴います。7日目から12日目の間にプランクトン細菌は大幅に減少し、バイオフィルム関連細胞はピークに達し、人口の約80%を占めます。最後に、成熟期(12日目から21日目)には、プランクトニック細胞の増加が見られないままバイオフィルム細菌の数は減少しますが、バイオフィルムの大きさと複雑さは増加し続けます。この変化の連続を観察することは、プロトコルがレプトスピラバイオフィルムの動的な発生と成熟を効果的に捉えていることを示しています。

適切に実施された場合、感染プロトコルは200μLのEMJH中に~2×10⁸レプトスピルを含む接種体を使用し、明確に定義されたプランクトニクス(5日間)またはバイオフィルム(21日間)培養から調製されます。これら二つの培養タイプは異なる生理的状態を表しますが、この違いは意図的であり、実験の目的は代謝活動の低下と構造的分化を特徴とするレプトスピラのバイオフィルムが感染を開始する能力を保持しているかどうかを明らかにするためです。この対比は、プランクトニックとバイオフィルムのレプトスピラ^35,36の間で遺伝子発現に大きな変化があることを示すトランスクリプトム研究によって裏付けられています。バイオフィルムアゲットは、21Gの針を通過した後も注入前に確認された構造を保ち、その構造を保つために慎重に収穫されます(図4C, D)。腹腔内注射後、ゴールデンシリアンハムスターは通常、3〜5日以内にレプトスピラ症の臨床症状を示します(例:倦怠感、毛並みの乱れ、うつ伏せなど)。EMJH培地単独で注射した陰性対照群では病変の兆候は見られません。臨床症状の進行や重症度、安楽死までの期間は接種具によって異なります。プランクトン菌はより早期かつ急性の症状を引き起こすことが多いのに対し、バイオフィルム由来の集合体は遅延的かつ持続的な感染を引き起こすことがあります(図4B)。最大21日間、1日2回モニタリングすることで、病気の全経過を把握できます。

図2。レプトスピラバイオフィルムの結晶バイオレット染色、定量化、超微構造イメージング。(A) 異なる基質上で成長したバイオフィルムのクリスタルバイオレット(CV)染色。CV染色は、異なる種や基質のバイオフィルム構造や初期付着パターンの可視化を可能にします。i. ポリカーボネートフィルター上のL. interrogans;ii. ポリカーボネートフィルターのL. biflexa;iii. ガラスカバースリップに描かれたL. interrogans;iv. ガラスカバースリップのL. biflexa。(B) L. interrogansおよびL. biflexaに対するCV吸収(OD570 nm)による時間経過による定量的バイオフィルム形成の例。この動態学的読み取りは、初期の接着およびバイオマス蓄積の動態の両方を捉え、病原性と腐生生物種間のバイオフィルム成長の違いを浮き彫りにしています。この数字は²⁷から修正されています。(C-E) L. interrogansのバイオフィルムの走査型電子顕微鏡(SEM):(c) 3日前のバイオフィルムで、初期のマイクロコロニー形成と初期細胞外マトリックス沈着を示す;(d) 成熟した構造を示し、広範なマトリックスと三次元組織を示す14日前のバイオフィルム;(E-F) 3週間前バイオフィルム。構造の固化とマトリックス成熟を長期培養で示す。CV染色、定量的OD測定、SEMイメージングの組み合わせにより、早期付着から成熟した超微構造組織に至るまでのバイオフィルム発生を包括的に概観し、種や培養期間を越えた直接比較を可能にします。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。 レプトスピラ バイオフィルム形成の可視化。BioStationで取得した位相対照画像では、(A)48時間、(B)96時間、(C)144時間でバイオフィルムの発生が示されています。(D)CLSM再構築によるレ プトスピラ バイオフィルムのCLSM再構築で、直交スライスで3D可視化のための全バイオボリュームを表示します。(E) 成熟バイオフィルムのDAPI(緑)およびWGA(赤)による共焦点染色で、細菌細胞および細胞外マトリックスの成分を強調すること。この数字は³⁷から修正されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4。プランクトンおよびバイオフィルム分画の時間分解定量および レプトスピラ バイオフィルムの機能評価。(A) 405nmの吸収によって測定されるバイオフィルム形成の動力学。各時刻点ごとに、総井戸、バイオフィルム分率、プランクトン性レプトスピルを含む上清液から測定を行い、付着細菌と自由に泳ぐ細菌の区別が可能となりました。(B)バイオフィルム集合体、プランクトニンレプトスピアー、またはEMJH対照群を注入したハムスターの生存曲線の例。バイオフィルム注入された動物は病原性が低下し、21日間生存するものもありますが、プランクトニクスレプトスピルは急速な死亡率を引き起こします。(C-D)バイオフィルムの完全性の予備検証:注入前(C)前に注射器内に集合体が見え、21Gの針(D、白い矢印)を通過した後も無傷で残ることで、取り扱い中もバイオフィルム構造が保持されることを確認しています。この数字は³⁶から修正されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

このプロトコルは、レプトスピラバイオフィルムの研究にモジュール式かつ統合的なワークフローを提供し、定量的バイオマス(クリスタルバイオレット^9,27)、動態学(タイムラプス位相差)、三次元組成(標的プローブを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡)³⁸、超微細構造(走査型電子顕微鏡)、機能評価(ハムスター感染)を統合します。モジュール間で同じ培養系列を使用することで、バッチ効果を最小限に抑え、実験中の交差検証が可能となり、特に成長が遅く脆弱なスピロヘートにとって重要です。各モジュールは互いに補完的です。CVは「どれだけの量」を定量化し、タイムラプスは「どれだけ速いか」を示し、CLSMは「内部のもの」を明らかにし、SEMは「どのように作られているか」を解明し、in vivoテストは「機能証明」を提供します。L. biflexaの導入は種を超えた適応性を示し、バイオフィルム形成の速さと密度の高さを強調し、方法論的柔軟性を強調^します。

各モジュールの成功は接種物の質と生理状態に依存します。中期ログプランクトン培養(3〜5日)は、非常に運動性が高く集合体がないため、再現性のある付着とバイオフィルムの発生を得ます。堅牢なバイオフィルム形成と再現性を確保するために、低通過分離株のみを使用するべきです。

CVアッセイは、その速度、スケーラビリティ、スループット^9,27を通じてワークフローを支えています。変異体、培地、または抗バイオフィルム化合物の迅速なスクリーニングを可能にします。しかし、レプトスピラのバイオフィルムは脆弱で不均一であるため、穏やかな操作と複製の検証が不可欠です。CVはコンパクト構造と多孔質構造を区別できず、マトリックス組成も検出できません。そのため、より深い構造解析のスクリーニングゲートとしての役割を果たしています。

タイムラプスイメージングは、リアルタイムでバイオフィルムの動態を明らかにすることで、そのギャップを埋めます。運動性集合体の出現、凝集、固定を捉え、エンドポイントアッセイでは見逃す一時的な現象を明らかにします。環境の安定性(温度、湿度、オートフォーカス)が非常に重要です。これらの記録は、CVバイオマスが安定しているように見えても、動態が分岐することがあり、これは深層層での構造再配置や生存能力の喪失を示しています。

CLSMは脱水アーチファクトなしに体積的および化学的洞察を提供します³⁹。生死染色はバイオフィルム内の細胞生存勾配を明らかにし、酸素拡散の制限と代謝層化の報告と一致します^6,40。レクチンと核酸染料は豊富な細胞外DNAや特定の糖団モチーフを露出させ、マトリックス成分の定量と特性評価を可能にします^41,42。CLSMデータはしばしば内部の空洞を明らかにし、タイムラプス³⁸で見られる集合的な再配置を反映しています。それでも制約としては、プローブ特異性、光漂白、回折制限軸方向分解能、したがって、顕微鏡の設定や染料の性能は事前に標準化され、実験間で信頼性が高く比較可能な結果を得るためにテストされるべきです。

SEMは補完的な超微構造分解能⁴³を提供します。初期段階では、新生の集合体を分解します。成熟(≈15〜21日)になると、偏極した構造が明らかになります。すなわち、固定と交換のための粗いチャネル状の基底層と、より滑らかな頂端マトリックス^{豊富な表面です}。慎重な固定、HMDS乾燥、共焦点データとの相関により、脱水や崩壊によるアーティファクトが軽減^{されます。}

これら4つのモジュールを組み合わせることで内部のクロスバリデーションが可能になります。CV、CLSM、SEMが収束すると結論は堅牢になります。分岐する際、その不一致自体が有益であり、例えばバイオマスは増加したものの生存可能性は低下したり、マトリックス組成が変化したにもかかわらずバイオマスは変わらないことが明らかになります。

いくつかの本質的な制約が残っています。 レプトスピラ のバイオフィルムは不均一で繊細なため、取り扱いや脱水に敏感です。CVは総バイオマスを統合しますが、生存可能性は含まれません^。CLSMは光学制限³⁸を超えてはなりません。SEMは製剤アーティファクトのリスクがあります。酸素勾配⁶により深い地層での死亡率は予想されますが、このバイアスは体系的で、条件間で比較可能です。バイオフィルムの成熟は約15〜21日で停滞し、栄養制限の転写シグネチャーと関連^{しています。}後半の段階は依然として不十分に特徴づけられています。

生体内アッセイは機能的な文脈を提供します。腹膜内凝集体を注入することで、バイオフィルム由来の細胞がプランクトン細胞と病原性や持続性の違いを判断します。腹膜内接種は自然な方法ではありませんが、比較モデル³⁶として管理されています。集約異質性は多少の分散をもたらしますが、一貫した取り扱いと接種量の一致によってこれを緩和します。重要なのは、バイオフィルム持続性形質(例:ECM介在ストレス耐性)が必ずしも急性病原性の増加に結びつくわけではなく、バイオフィルム形成の生態学的役割を強調している点である^。

モジュール設計によりスケーラブルな利用が可能になります。迅速なスクリーニングには、履歴書とタイムラプスで十分です。機構的な洞察のために、CLSMとSEMは組成的およびアーキテクチャ的な分解能を加えます。モジュールは酵素的または化学的摂動(DNase、グリコシダーゼ)、糖団や核酸の代替プローブ、またはフロー応答を検証するマイクロ流体システムを統合できます。同じ接種物はトランスクリプトム解析やプロテオーム解析を提供でき、バイオフィルム表現型を調節(例:c-di-GMPシグナル伝達、飢餓応答)に直接結びつけます。この枠組みはまた、変異体スクリーニング、環境摂動試験、抗バイオフィルムまたは抗病原性化合物の評価も含んでいます。

この統合ワークフローは、孤立した観察結果をレ プトスピラ バイオフィルムの一貫した多次元理解へと変換します。スループット(CV)、ダイナミクス(タイムラプス)、化学・深度(CLSM)、超微細構造(SEM)を組み合わせることで、 レプトスピラ 群集の移動性が高く多孔質かつ偏極性のある特性を正確に捉えています。先行の研究^17、35、36を拡張し、協調的かつモジュール化された実験が、単一手法では見えない現象、例えば生存可能性が低下しているにもかかわらずバイオマスが増加したり、種間の動力論の発散を明らかにすることを示しています。最終的に、このアプローチは種、変異体、疾患間での比較的、再現性が高く、機能的に関連性の高い分析を支援し、メカニズム的微生物学、生態学的回復力、抗バイオフィルム戦略設計の基盤を提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & micro;M無菌親水性ポリカーボネート膜	it4ip	1000M25/861N101/13
12mmの滅菌ガラスカバースリップ	SPL	330164
16%パラホルムアルデヒド(PFA)およびnbsp;	サーモ・サイエンティフィック	28908
21G針	BDメディカル	304432
24ウェルマイクロプレート	NUNC	143982
35mmガラス底皿	イビディ	81218-200
35mmガラス底Hi-Q4アンテナ	イビディ	81156
96ウェルマイクロプレート	ネスト	701001
アンチフェードマウント媒体	バイオラッド	29410
カーボンコーター	ライカ・マイクロシステム	エムACE600
CFDA/SEトレーサー	バイオレジェンド	423801
導電性カーボーン接着剤	電子顕微鏡科学	77816
クリスタルバイオレット(CV)	シグマ	C3886
暗野顕微鏡	ライカ・マイクロシステム	11888846	ライカDM4000 B、ダークフィールコンデンサー搭載(cat n° 11505142)
エタノール	VWRケミカルズ	83813.36
FM4-64	インビトロジェン	T3166
氷河性酢酸	スペルコ	1.00063
グルターアルデヒド溶液	シグマ・オルドリッチ	G5882
ヘキサメチルジシラザネ	アクロス・オーガニクス	120581000
インキュベーター	メマート	IN30
倒立共焦点顕微鏡	ライカ・マイクロシステム	ライカ DMI6000 TCS SP8 X	コンフォーカル顕微鏡 SP8
位相差光学装置を搭載した逆立型顕微鏡	ニコン	セル-S2	バイオステーションIM-Q
レプトスピラ中基部 EMJH	ベクトン・ディキンソン	BD 279410	レプトスピラのEMJH培地
四酸化オスミウム(OsO4)およびnbsp;	シグマ	BCCG9181
プロピジウムヨウ化物	バイオティウム	40017
走査型電子顕微鏡	ジョル	JSM-IT300
カコジレートナトリウムバッファー	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	15453149
分光光度計 ヴァリオスカン・ルクス	サーモ・サイエンティフィック	VLBL00GD0
滅菌リン酸塩緩衝生食塩水	バイオソルブ	0016232301BS
注射器(1 mL)	チラナ	CH03002L
SYTO9 緑色蛍光核酸染色	インビトロジェン	S34854