光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

Cecilia Zaza; Miruna Tanase; Olivia P. L. Dalby; Sabrina Simoncelli

doi:10.3791/69531

方法論記事

光学光子再割り当てを用いた回転円板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

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DOI:

10.3791/69531

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2026年1月6日

Cecilia Zaza¹ , Miruna Tanase¹^,² , Olivia P. L. Dalby¹^,² , Sabrina Simoncelli¹^,²

¹London Centre for Nanotechnology, University College London, ²Department of Chemistry, University College London

この記事について

サマリー

このプロトコルは、光学光子再割り当てを備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いて深部全細胞単分子局在顕微鏡(SMLM)を行う手順を示しており、カスタム光学や複雑な照明を必要とせずにDNA-PAINTイメージングを可能にします。

要約

単一分子局在顕微鏡(SMLM)は細胞構造のナノスケールイメージングを可能にしますが、全反射蛍光(TIRF)や高傾斜光学シート(HILO)照明の制限により、通常はカバースリップ付近でのイメージングに限定されます。ここでは、光学光子再割り当て(SDC-OPR)を備えた回転円盤共焦点顕微鏡を活用し、全細胞でSMLMを行うプロトコルを提示します。この方法は、DNA点の蓄積を用いてナノスケールトポグラフィー(DNA-PAINT)での画像化を可能にし、カスタム光学や複雑な照明方式を必要とせずに、細胞全体全体で高精度な単一分子イメージングを可能にします。このプロトコルは、市販のスピニングディスク顕微鏡(例:CSU-W1 SoRA)をSMLMイメージング用に設定するためのステップワイズガイドを提供し、深部イメージングに最適化された取得パラメータも含みます。DNA共役プローブを用いた細胞内標的の標識によるDNA-PAINTイメージングの試料準備手順、複数の標的の多色イメージング戦略も概説されています。画像取得の後、標準的なソフトウェアパッケージを用いた単一分子の局在化と再構成が行われます。背景の最小化、横分解能の最適化、セル深度全体にわたる画像品質の確保に関する重要な考慮点も議論されます。このアクセス可能なプロトコルにより、研究者は標準的な共焦点装置を用いて深部全細胞SMLMを実施でき、単一分子イメージングで解決可能な生物学的課題の範囲を膜近辺領域を超えて拡大します。

概要

単分子局在顕微鏡(SMLM)¹は、個々の蛍光色素の発光を時間的に分離し高精度で局在化することでナノスケールの分解能を達成する超分解能技術の一群です。成功するSMLMは単一分子事象を検出するために高い信号対雑音比(SNR)を必要とし、従来は強烈で局所的な励起を提供する光学装置に限定されてきました。最も一般的な構成は、全反射蛍光(TIRF)²顕微鏡と高傾斜ラミネート光学シート(HILO)照明^3です。TIRFは、カバースリップから数ナノメートル以内の蛍光分子を選択的に励起させるエバネッセント場を作り出し、ピントの合わない照明を抑制することで背景蛍光を低減します。しかし、この制限により、TIRFは細胞外ドメインに拡張する小器官など、より深い生物学的構造のイメージングには適していません。HILO顕微鏡はより深い浸透深度を提供し、ガラス基板の上数百ナノメートルの画像撮影を可能にします。これは視野角(FOV⁾⁴の縮小と、より高い平面での照明の不均一を伴い、より大きな細胞構造への適用性を制限します。近年では、格子ライトシート^5,6,7や単一対物レンズ単一平面照明顕微鏡(soSPIM)⁸などのライトシート顕微鏡(LSM)技術が、SMLMを体積および組織スケールイメージングへと拡張しています。励起ビームを薄く構造化された光シートに成形することで、LSMは背景および光毒性を低減した光学セクション化を実現します。SoSPIMは検出軸に直交する焦点面を単一露光で捉え、ほぼ等方性分解能で高速な体積イメージングを可能にします。soSPIMの応用は、全細胞および小器官(深さ>20μm)で3D SMLMを実証し、40 nmの等方性分解能で、ピントのずれ背景が最小限に抑えられ^{ています。}これらの手法はその強みにもかかわらず、通常は透明な試料、特殊な光学系、複雑な整列を必要とし、厚い試料では光学収差や散乱に敏感です。

共焦点顕微鏡は、検出器の前方にピンホールを設置し、ビーム走査鏡¹⁰を組み合わせることでピントの合わない光を排除する代替手段を提供します。この光学的セクション機能により、高いSNRによる深いボリューメトリックイメージングが可能になります。特に、スピニングディスク共焦点顕微鏡(SDC)顕微鏡は、従来のイメージングの速度と広視野検出と、ポイントスキャンシステムの断面能力を組み合わせています。これは従来のSDCでは、平行なピンホールパターンの回転ディスクを組み込み、しばしば整列したマイクロレンズアレイと組み合わせることで実現されます。マイクロレンズは放出された蛍光の大部分を収集し、ピンホールを通して集束させることで背景信号を低減します。この構成は、特殊な光学機器や追加のサンプルマウント準備を必要とせず、迅速な光学セクションングを実現し、深層体積SMLM画像取得¹¹に容易に実装・最適化できる堅牢な選択肢となっています。

本研究では、光光子再割り当て(SDC-OPR)を備えたCSU-W1回転円盤共焦点スキャナーユニットが使用されています。標準的なSDCとは異なり、SDC-OPRは放出された光子を補完的なピンホールパターン¹²に投影する第2のマイクロレンズアレイを導入し、散乱を軽減し、そうでなければ廃棄される光子を回収します。この光子再割り当てにより、点拡散関数(PSF)が効果的に鋭くなり、従来のSDCを超える横方向解像度が向上しつつ、ピントの合^{わない光を}排除します。具体的には、SDC-OPRマイクロレンズアレイはオフアクシスの光子を最も近い原点にリダイレクトし、標準SDCと比較して検出される蛍光の輝度を効果的に向上させます。さらに、SDC-OPRの解像度向上の利点は画像の逆畳み込み によって さらに拡大できます。反復的デ畳み込みアルゴリズムは、光学構成を変更することなくPSFを計算的に精緻化し、背景を削減し、信号対背景比を改善します。この複合アプローチは、単一分子局在実験において標準SDCに比べて局所精度の面で大きな利点をもたらします¹⁴。

ここでは、光学光子再割り当て(SDC-OPR)を備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いた単一分子局在顕微鏡の堅牢かつ再現性のあるプロトコルを提示します。このアプローチは、DNA-PAINTのナノスケールの精度と、回転ディスクイメージングの速度、視野角、深度貫通を組み合わせています。DNA-PAINTは、ナノスケール地形撮影(PAINT)¹⁵のための点蓄積の適応であり、蛍光標識された「イメージャー」鎖と、分子標的に固定された補完的な「ドッキング」鎖の一時的なハイブリダイゼーションに依存しています。これらの可逆結合イベントは確率的蛍光シグナルを生成し、正確に局所化できるため、細胞超微体の高解像度再構築を可能にします。DNA-PAINTは高光安定性の蛍光素の利用を可能にし、イメージング条件の精密制御のための可調整結合動力学を提供し、蛍光イメージャーの鎖の連続的な補充によって光漂白を軽減します^。

再現性と特異性を確保するために、このアプローチはドッキング鎖を二次抗体に結びつけるカスタムのDNA抗体接合体に依存しています。抗体-DNA接合を含む詳細なサンプル準備手順が示されており、堅牢な実験結果を支えています。このプロトコルは、核孔複合体(NPC^)や固定サンプル中の微小管など、よく特徴付けられた細胞構造で検証され、再構築精度の推定における基準点となります。定位精度 を指標として 定量化した解像度の変動は、視野角(FOV)や画像深さの関数としてさらに評価されます。

さらに、この多重イメージングワークフローの効率性は、同じ染料と単一のレーザーソースを用いたDNA-PAINTに基づく複数のターゲットを逐次的に可視化できるExchange-PAINT¹⁸を用いて実証されています。Exchange-PAINTのワークフローは、同じサンプル内のミトコンドリア、微小管、NPCの多色超分解能イメージングに適用されます。

このプロトコルは、抗体DNA接合、サンプル準備、イメージング条件、データ解析に関する包括的な指針と重要な適応性のノートを提供し、研究者がSDC-OPR上で再現可能なDNA-PAINTイメージングを行うことを可能にします。高解像度イメージングをTIRFベースの深さやFOVの制限を超えて拡張することで、SMLMの適用範囲を幅広い生物学的文脈に広げます。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. バッファーの準備

細胞骨格バッファー(CB)調製:
1. 10 mM MES(pH 6.1)を1×ろ過リン酸バッファー溶液(PBS_)に 150 mM NaCl、5 mM EGTA、5 mM D-グルコース、5 mM MgCl2を準備します。
2. 4°Cで保存し、使用前にフィルターを通してください。
40倍プロトカテク酸(PCA)ストック調製:
1. 154 mgのPCAを10 mLの蒸留・ろ過水に溶かします。
2. NaOHでpHを9.0に調整します。
3. 分割して最大6ヶ月間-20°Cで保存します。
  注意:もし茶色に見えるものがあれば、酸化を示すため廃棄してください。
100倍プロトカテチュアート-3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)ストック調製:
1. 50%グリセロール溶液に50 mM KCl、1 mM EDTA、100 mM Trisバッファーを組み合わせて準備します。
2. 2.2 mgのPCDを3.4 mLのグリセロール溶液に溶かします。
3. アリコートをして最大6ヶ月間-20°Cで保存します。
100倍トロロックスストックの準備:
1. 50mgトロロックス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)を215μLのメタノールに溶かし、適切な個人用防護具(PPE)を用いて化学煙幕内で溶液が緑色になるまで加熱します。
2. 蒸留水1.6mLをろ過水を加えます。溶液が白くなり、固まり始めるのを待ちます。
3. 175μLの1Mナオナオハウ(NaOH)1Mを加えます。溶液が再び液体に変わるのを待ちます。
4. 10μLの容量で、溶液が完全に浄化されるまで1MのNaOHを加え続けます(約40μL)。
5. アリコートをして最大6ヶ月間-20°Cで保存します。最終的な溶液は黄色っぽく見えます。
  注:最終的な100x溶液のpHは11ですが、1xに希釈するとpHは7〜8になります。
バッファ C+
1. 1 mM EDTA、500 mM NaCl、0.02% Tween-20溶液を1x PBSで準備します。
2. 必要に応じてHClやNaOHでpHを7.4に調整してください。
3. オプションのトロロックスサプリメント:必要な量のPCA(40x)、PCD(100x)、トロロックス(100x)のストックを加え、1倍の希釈にし、使用前に室温(23°C)で溶液を1時間平衡させてから使用します。
  注意:毎週新鮮な調理をしてください。Troloxを使う場合は、混音から4時間以内に使いましょう。
免疫染色バッファー(パラホルムアルデヒドPFA、グリシン、トリトン):
1. 10 mL 16% PFAアンプルから4% PFA製剤の場合:
  1. 化学煙幕の中で、アンプルを慎重に開けます。
  2. 16%PFAを10mLを50mLの円錐形遠心管にデカントします。
  3. 1xPBSで1:4の希釈を行い4%のPFAを得ます。デカントした16%PFAに1xろ過PBSを~30mL慎重に加え、最終体積は~40mLとなります。
  4. 1 mLのマイクロ遠心分離機チューブに分割し、必要になるまで-20°Cで保存します。
2. PBS製剤中の60 mMグリシンについて:
  1. グリシン225mgを50mLの円錐形遠心管に重量します。
  2. 1xろ過PBSを50mL加えます。
  3. 完全に混ざるまでボルテージし、フィルターを通します。
  4. 必要になるまで4°Cで保存してください。
3. 0.1%のTriton X-100製剤の場合:
  1. まず、10%トリトンX-100の作業用ストックを100%トリトンX-100を1xろ過PBSを9mLに希釈し(最終体積=10mL)、ピペットで混ぜて泡立ちを防ぎます。必要になるまで4°Cで保存してください。
  2. 10%の作動ストックから、10%トリトンX-100を0.1mL、ろ過したPBSを9.9mLに加え、0.1%の最終ストックとして徐々に混めます。必要になるまで4°Cで保存してください。

2. 抗体-DNA接合

抗体を100 kDaの超外ろ過遠心フィルターユニットで濃縮します:
1. 100 kDaの超ろ過遠心フィルターユニットを100 μLのろ過PBS1枚を14,000 g 4°Cの環境で30分間洗浄します。
2. 100 μLの抗体と200 μLの1xろ過済みPBSを、洗浄した100 kDaの超遠心フィルターユニットに加え、14,000 g 4°Cで30分間回転させます。濃度を経て抗体濃度が1.5 mg/mLを超えていることを確認します。この方法では、超ろ過遠心フィルターが抗体を~3倍濃縮します。
3. 100 kDaの超ろ過遠心フィルターユニットをきれいなチューブに逆さまにし、1000 x g、4°Cで6分間回転させます。これはPBSに含まれる濃縮抗体です。
4. 濃縮抗体の体積(1〜2μL)を測定して新しい濃度を計算し、マイクロボリュームUV-Vis分光光度計でUV-Vis吸収スペクトルを測定します。背景を1倍PBSに設定し、スペクトルを保存します。
チオール化DNAドッキング鎖を減少させる:
1. 7.7 mgのあらかじめ計量済みDTTを100 μLのろ過水に溶かし、新しいチューブに移します。
2. 元のDTT管に100μLの3 mM EDTAを1x PBSで加え、ステップ2.2.1と同じ管に移すと、1.5 mM EDTAに200 μL DTTを1xのPBSで200 μL加えます。
3. チオール化されたDNAドッキング鎖を1xろ過PBSに溶かし、最終濃度1 mMにします。DNAドッキング鎖溶液のUV-Visスペクトル(1x PBSで10μMに希釈)を記録し、マイクロボリュームUV-Vis分光光度計で保存します。
4. チオリングDNA13μL(1 mM)とDTT 30 μL(250 mM)を混合し、室温(23°C)で2時間揺らします。
  注意:未使用のDNAドッキング鎖は、将来の反応のために13μLのアリコートで-20°Cで保存してください。
架橋剤に対する抗体の結合:
1. マレイイミド-PEG2-スクシニミジルエステル架橋剤をDMSOに溶けて10 mg/mL(23.5 mM)に変換します。必要な時まで10μLのアリコートを-20°Cで保存してください。
2. ステップ2.1の濃縮抗体と20倍モル余剰の架橋剤を混ぜます。4°Cで90分間、振って孵卵します。
7.0 KDaスピン脱塩カラムで抗体架橋剤ろ過を精製し、サイズ排除樹脂(分子量7 kDaカットオフ)を含む:
1. 7.0 kDaスピン脱塩カラムの底部の閉鎖を外し、キャップを緩めます。タンパク質結合の低いマイクロ遠心分離機チューブに入れます。1500 x g、4°Cで1分間遠心分離機にします。
  注意:最初のスピン後に樹脂の傾きをマークしてください。その後のカラム使用では、スラントを遠心分離機の外側に直接向けて設置してください。サンプルやウォッシュを中心に塗り、樹脂ベッドとの接触を避けてください。
2. 7.0 kDaスピン脱塩カラムフィルターに1xろ過PBS300 μLを加え、キャップを緩めて1500 x g、4°Cで1分間遠心分離します。さらに2回繰り返します。
  注意:抗体架橋剤反応が準備できるまで、7.0 KDaスピン脱塩カラムに1倍PBSを300 μL残しておきましょう。カラムが乾燥しないようにしてください。
3. 最後の300μLのPBSウォッシュを、1500 x g、4°Cで1分間遠心分離して再度除去します。
4. 抗体架橋剤溶液を樹脂床の中心に滴下して塗布します。7.0 kDaの脱塩カラムを清潔なマイクロ遠心分離機のチューブに入れ、1500 x g、4 °Cで2分間遠心分離機に入れます。抗体架橋剤生成物は現在、マイクロ遠心分離機チューブ内に入っています。4°Cに保つか氷で保管してください。
DNA-DTT混合物を、セファデックスG-25(DNA精製用サイズ除外樹脂)でスピンカラムの脱塩を用いて精製します:
1. 脱塩スピンカラム(DNA精製)をボルテックスして樹脂を均等に分布させます。底の閉じ具を外し、キャップを緩めてから、きれいなマイクロ遠心分離機のチューブに入れます。
2. 離心分離機でスピンカラムの脱塩(DNA精製)を735 x g で1分間除去し、貯蔵バッファーを除去します。
3. 脱塩スピンカラム(DNA精製)を新しいマイクロ遠心分離機のチューブに入れ、DNAとDTTの混合物を樹脂の中心にゆっくり加えます。遠心分離機で735 x g で2分間加熱します。精製・還元されたDNAはマイクロ遠心分離機のチューブに収まっています。
DNAと抗体架橋剤製品を組み合わせる:
1. 還元されたDNAを抗体の10倍のモル過剰で抗体架橋剤生成物に加えます。精製後、精製されたDNAを抗体架橋剤生成物とすぐに混ぜます。これによりDNAの再結合が防げます。
2. 4°Cで一晩、震えながら孵化させます。
  注意:DNAと抗体は午後遅くに混ぜ、翌朝すぐに精製してください。DNAと抗体の長期培養は、高いDNAと抗体の比率をもたらすことがあります。
翌朝、100 kDaの超ろ過遠心フィルターユニットで余分なDNAを除去します:
1. 100 kDaの超ろ過遠心フィルターユニットを、1×ろ過PBS300 μLで14,000 g 4°Cの温度で30分間洗浄します。
2. 100 kDaの超ろ過遠心フィルターユニットに300μLの1xろ過PBSを含むDNA-抗体混合物を加え、14,000 x g、4°Cで30分間回転させます。
3. 超ろ過遠心フィルターユニットを逆さまにしてきれいなチューブに入れ、1000 x g、4°Cで6分間回転させます。これがPBSの濃縮生成物です。
4. 製品を1xろ過PBSで100μLに希釈します。
5. マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を使い、背景を1xPBSで1μLのUV-Visスペクトル(1μLまたは2μL)を記録し、スペクトルを保存します。
6. スペクトルから最終濃度とDNAと抗体比を測定します。DNAからの余分な吸収により、抗体の吸収ピークが280nmから260nmにシフトするのを観察します。ステップ2.8を使って濃度とDNAと抗体の比率を測定します。
7. 製品は使用された抗体の元の保管条件で保存してください。冷凍する場合は、凍結・解凍のサイクルを避けてください。
UV-VisスペクトルからDNA:抗体比を計算します:
1. 純粋なDNAスペクトル(1x PBSで10μM)から、260nm()および280nm()の吸収度を測定します。これらをDNA濃度(10μM)で割ると、DNAのモル吸収係数( と )を求めます。
2. 抗体がとを見つけるために繰り返し、スペクトルに使われる抗体の濃度で割ることを忘れずに。
3. 生成スペクトルから、260 nmおよび280 nmでの吸収は、DNAと抗体からの吸収の両方に依存します。
  
  ここでcDNAとcAbは、それぞれ最終生成物内のDNAと抗体の濃度を表します。これらの方程式を同時に解き、生成物内のDNAと抗体のモル濃度を求めます。これらの濃度を使ってDNAと抗体の比率を計算します。
  注:最初のスペクトルにおける抗体の濃度は、超ろ過遠心ろ過ユニット100 kDaろ過でろ過後に残る抗体の体積を測定し、既知の濃度で使用された元の抗体体積と比較することで算出できます。

3. 細胞培養

HeLa Kyoto mEGFP-NUP107細胞。
1. 細胞培養培地であるダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)を10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を補足して準備し、4°Cで保存します。使用30分前に37°Cの水浴で培地を予温めてください。作業環境に応じて、汚染を防ぐために必要な量を分割しろ過することが推奨されます。
2. 種子細胞を2×10⁵ cells/mLで、T25フラスコ内の予温済み補充DMEM培地7 mLに置きました。細胞フラスコを適切なインキュベーターに入れ、37°C、_CO25 %の環境に入れます。
3. 過密を防ぐために48〜72時間ごとに通過を確実にしてください。
  1. 合流培養液と吸引培地を含むT25フラスコを取り出します。
  2. ピペットで1mLのトリプシンEDTA(TE)を使い、フラスコを優しく傾けて完全にカバーします。フラスコから細胞が剥離されるまで、37°Cで7分間培養します。
  3. 補充されたDMEM培地2mLを加え、トリチュレートします。
  4. 細胞懸濁液を15 mLの円錐形遠心管に移し、さらに7 mLのDMEM培地を補足します。
  5. 遠心分離機で400 x g で5分間加熱します。チューブの底にペレットが形成されていないか注意深く確認し、それを乱さないようにしてください。
  6. 培地を吸引し、補足されたDMEM培地に細胞ペレットを再懸浮させます。
  7. 新しいT25フラスコに2×10個の⁵ 細胞/mLを種付けし、7mLの予温された培地を含みます。37°Cで5%の_CO2で培養します。
    注意:細胞密度が不明な場合は、ヘモサイトメーターを使って細胞数を測定することができます。カウント前に1mLのペレットリスペンションから始めることが推奨されます。
U2OS CRISPR mEGFP-NUP96細胞
1. ステップ3.1.1に従い、10%のFBSと1%のP/S補完剤を準備します。
2. 2×10⁵ cells/mLの種子細胞を、T25フラスコの中で7 mLの補給マッコイズ5A培地に浸しています。37°Cで5%の_CO2で培養します。
3. 文化成長を80%未満の合流点以下に抑えるために48時間ごとに通過:
  1. フラスコから培地を吸引し、接着菌を2mLの濾過済み予温(37°C)1倍PBSで優しく洗浄します。
  2. PBSを吸引し、アキュターゼ2mLを加え、フラスコをゆっくり傾けて完全にカバーし、37°Cで7分間培養します。
  3. 補給されたマッコイズ5A培地2mLを加え、トリチュレートします。
  4. 細胞懸浮液に7 mLの培地を加え、遠心分離のために15 mLまたは50 mLの円錐形遠心管に移します。400 x g で5分間遠心分離機にかけ、チューブの底にペレットが形成されていないか確認します。
  5. 細胞ペレットを補給したマッコイの5A培地に再懸濁させました。
  6. 新しいT25フラスコで2×10⁵ 細胞/mLで、7mLの予温培地を添えて種子を置きます。37°Cで5%の_CO2で培養します。
    注意:細胞に加えられたすべての溶液は水またはビーズ浴で37°Cまで温めてください。アキュターゼの場合は、分解を防ぐために2 mLのアリコートを5分以上温めないでください。

4. Nup96、ミトコンドリアおよび微小管の免疫染色

U2OS mEGFP-Nup96細胞の調製
1. ステップ3.2の手順に従い、T25フラスコから培地を吸引し、接着した細胞を1xろ過PBS2mLで優しく洗浄します。
2. PBSを吸引し、アキュターゼ2mLを加え、フラスコをゆっくり上下に傾けて37°Cで7分間培養して細胞剥離を促進します。
3. 補給されたマッコイズ5A培地2mLを加え、トリチュレートします。
4. 7mLの補足されたマッコイズ5A培地でトップ細胞懸濁液を使い、15mLまたは50mLの円錐形遠心チューブに移し、400 x g で5分間遠心分離します。再度、チューブの底にペレットが形成されていないか確認してください。
5. 細胞ペレットを補給したマッコイの5A培地に再懸濁させました。
6. 種子細胞を1×10⁵ cells/mLで8ウェルのマイクロスライドに置き、細胞インキュベーター(37°C、5%_CO2)で一晩インキュベートします。
  注意:固定および免疫染色の24時間前に種子細胞を採取し、粘着性を確保します。
Nup96画像診断のためのU2OS mEGFP-Nup96細胞の免疫染色
1. 一晩のインキュベーション後、8ウェルのマイクロスライド内のマッコイズ5A培地を1倍のろ過PBSに交換します。PBSを素早く吸引し、事前に温めた(37°C)4%PFA固定液を化学煙幕に入れます。
2. セルを室温(23°C)で30分間固定し、できれば化学煙フード内で固定した後、PFAを洗浄し廃棄物を廃棄します。特に記載がない限り、すべての工程は室温で行うことができます。
3. 4%のPFA固定液を取り除き、スライドを3回3分、PBS1回で洗います。
  注意:適切なPPEを着用しながら化学換気フード内でPFAを使用してください。
4. 固定後、細胞膜を1xPBS溶液に0.1%トリトンX-100を加えて透過性を増します。5分間置き、その後3×3分に60 mMのグリシンを1xPBSで洗い、残留PFAの自己蛍光を消し去ります。
  注意:トリトン透過化溶液は非常に時間に敏感であり、長時間放置すると細胞構造の完全性が変化する可能性があります。
5. 1xPBSに5%BSAを1時間暗闇で加え、免疫染色前に細胞をブロックします。
6. 非特異的結合ブロッキングを防ぐために、DNA結合した抗GFPナノボディ20 nMをブロッキング溶液(5% BSA in 1x PBS)を準備します。スライドをナノボディ混合物と共に室温(23°C)で1時間培養し、その後、未結合DNA鎖を1xフィルターされたPBSで3×3分洗浄します。
  注意:一時停止点:固定、ブロッキング、抗体添加後、サンプルは4°Cで一晩保存できます。この一時停止点は、プロトコルの厳密な必須ではなく、試料準備にかかる時間のため主に含まれています。希望すれば、これらの手順の直後に画像検査を進めることもできます。
ミトコンドリアおよび微小管イメージングのためのU2OS mEGFP-Nup96細胞の免疫染色
1. 一晩の培養後、8ウェルマイクロスライドのDMEM培地を同時に、細胞骨格バッファー(CB)中に0.3%グルターアルデヒドと0.25%トリトンX-100を200 μL入れ替え、2分間プレフィックスします。
2. プリフィックス溶液を細胞骨格バッファー(CB)に置き換え、2%グルターアルデヒドを補足します。細胞を固定するために10分間置き、その後ステップ4.2.4の手順通り、60 mMグリシンをPBSで3×3分洗浄します。
  注意:適切なPPEを着用しながら化学換気フード内にグルターアルデヒドを使用してください。
3. 3%のBSAにかけて、1xPBSを暗闇で1時間加え、免疫染色前に細胞をブロックします。
4. 微小管イメージング用に5μg/mLのDNA結合抗チューブリン(上記のように結合型)を追加し、ミトコンドリア画像用に1:200 TOM20抗体を室温(23°C)で2時間追加します。PBSを1回、3分×3分洗います。
5. DNA結合したsdAb抗ウサギIgGを25 nM加え、室温(23°C)で1時間インキュベークします。PBSを1回、3分×3分洗います。
  注意:一時停止点:固定、ブロッキング、抗体添加後、サンプルは4°Cで一晩保存できます。この一時停止点は、プロトコルの厳密な必須ではなく、試料準備にかかる時間のため主に含まれています。希望すれば、これらの手順の直後に画像検査を進めることもできます。
HeLa Kyoto mEGFP-NUP107細胞の調製
1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107細胞のT25フラスコから培地を吸引し、1xろ過PBSを2mLで優しく洗浄します。
2. PBSを吸引し、トリプシンEDTA(TE)2mLを加え、フラスコをゆっくり上下に傾けて37°Cで7分間インキュベートします。
3. 補充されたDMEM培地2mLを加え、トリチュレートします。
4. 細胞溶液を15 mLの円錐形遠心チューブに加え、追加7 mLのDMEM培地を加え、400 x g で遠心分離機で5分間行います。チューブの底にペレットができていないか確認してください。
5. 細胞ペレットを補充されたDMEM培地に再懸濁させます。
6. 8ウェルマイクロスライドで1×10、⁵ 細胞/mLの種子細胞。
  注意:種子細胞は画像検査の24時間前に採取してください。
微小管に対するHeLa Kyoto mEGFP-Nup107の免疫染色
1. 一晩の培養後、8ウェルマイクロスライドのDMEM培地を同時に、細胞骨格バッファー(CB)中に0.3%グルターアルデヒドと0.25%トリトンX-100を200 μL入れ替え、2分間プレフィックスします。
2. プレフィックス溶液をCB中の2%グルターアルデヒドに置き換え、細胞固定のために10分間放置します。60 mMグリシンを1xPBSで3回3分洗います。
  注意:適切なPPEを着用しながら化学換気フード内でグルターアルデヒドを使用してください。
3. 1xPBSに5%BSAを1時間暗闇で加え、免疫染色前に細胞をブロックします。
4. 5μg/mLのDNA結合抗チューブリン(上記のように結合)を加え、5% BSAで1x PBSに1xPBSを室温(23°C)で2時間かけて微小管イメージングを行います。PBSを1回、3分×3分洗います。
  注意:一時停止点:固定、ブロッキング、抗体添加後、サンプルは4°Cで一晩保存できます。この一時停止点は、プロトコルの厳密な必須ではなく、試料準備にかかる時間のため主に含まれています。希望すれば、これらの手順の直後に画像検査を進めることもできます。
5. 注意:代替抗体や細胞株を扱う際は、製造元の推奨に従ってDNA結合抗体やナノボディの希釈因子を調整してください。
画像作成
注:この手順はすべての免疫染色プロトコルに共通しています。
1. 各井戸に、脱イオン水で1:2希釈した90nmの金ナノ粒子を、井戸全体の体積を使って直接加えます。画像撮影時に将来のドリフト補正を可能にするために5分間潜伏してください。PBSを1回使ってウェルを3回洗います。
2. Nup96イメージングの場合、C+バッファーに1 nMの望ましいイメージャーストランドを加え、1xトロロックス、1xPCA、1xPCDを加えます。
3. ミトコンドリアおよび/または微小管の交換PAINTでは、最初の目的のイメージャーストランドをC+バッファーに1 nMの位置で添加します。最初の撮影後は、サンプルを動かさずに残留するすべての画像束を除去するために、徹底的かつ慎重に洗浄してください。通常は5回洗い、30秒の待ち時間があれば十分です。次に、2回目のイメージング用にC+バッファに1 nMの2本目のイメージャーストランドを追加します。

5. イメージングセットアップおよびパラメータ:単一分子局在顕微鏡

注:このプロトコルで示された画像は、英国ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンのLMCB超高解像度顕微鏡施設で、市販のスピニングディスク共焦点顕微鏡(sCMOSカメラ搭載)を用いて取得され、NIS-Elements ソフトウェアを介して 操作されました。

多焦点励起付きの回転円盤共焦点システムとsCMOSカメラを使いましょう。
画像撮影の30分前にシステムを起動し、顕微鏡、カメラ、レーザーを起動し、その後コンピューターを起動します。NIS-Elementsソフトウェアが完全に読み込まれるのを待ちます。
NIS-Elementsで適切なイメージングモードを選択してください:標準のスピンディスク共焦点またはSDC-OPRの超高解像度で、取得パラメータを設定する前に。
SDCまたはSDC-OPRイメージングには60× Apo NA 1.49オイル浸漬物レンズを選択し、単一分子イベントの検出を最大化し、後処理の改善を図ります。
対物レンズ、カメラ設定、研究対象の試料に基づいて適切な倍率(1×、2.8×、または4×を選択します。カメラのビニングを適切に調整します:1×ビンで1×倍率、2×ビンで2.8×、4×ビンで4×。この構成では、1×(ビニングなし)で実効ピクセルサイズが108 nm、4×ビニングで4×、2.8×(2×ビニング)で78 nmとなります。ビニングは、SMLMに適したピクセルサイズを得るために必要であり、PSF標準偏差(通常100〜150 nm)にほぼ一致します^19,20。
注:高倍率(2.8×または4×倍率)はレーザーの出力密度を高め、照明の均一性を向上させます。これにより視野角が小さくなるため、ピクセルサイズを維持するためにビニングは比例調整(例えば2×倍率で2.8×倍率、4×倍率で4ビン化×ピクセルサイズを維持する必要があります。
DNA-PAINT取得の露光時間を設定し、回転ディスクの回転速度(CSU-W1パッドから調整可能)と同期させます。回転速度が露光時間の倍数であることを確認し、またはシンクボタンを押して最も近い互換性のある回転数に自動的に合わせてください。画面でストライプアーティファクトがないか確認してください。これは同期していない設定を示しています。ここで示した実験では、300ミリ秒の露光時間が使用されました。
注:SDCユニットの回転速度と同期マイクロレンズ強化されたSoRaディスクは、ビーム励起プロファイルに影響を与え、照射面積全体の平均パワー密度分布に影響を与えます。このため、TIRFセットアップよりも長い露光時間が必要になる場合があります。
レーザーの波長、出力、フィルターホイールを設定してください(NIS-Elementsが適切なフィルターを提案します)。レーザーの波長はイメージャー染料のスペクトルによって決まります。
注:本研究では、561nmレーザーで最適励起されるCy3Bが使用されました。Cy3BはDNA-PAINTにおいて最良の信号対背景比を提供し、この用途において好ましい選択肢となっています。
レーザーパッドでレーザー出力を調整してください(0%〜100%)。DNA-PAINTイメージングでは、レーザーを最大出力(100%)に設定します。このシステムの場合、対物レンズ後に測定した4×倍率の1.75 mW(≈ 65 W/cm²)、2×倍率で3 mW(≈ 50 W/cm²)、1×で5 mW(≈ 15 W/cm²)に相当します。
1. 対物レンズ後の出力を記録するには、校正済みのレーザーパワーメーターを使用し、センサーを試料面に近い顕微鏡ステージに設置します。対物レンズとの接触を避けるように注意してください。使用した各構成の電力を記録してください。
60× Apo NA 1.49 オイル対物レンズに浸漬油を一滴塗ります。
準備済みサンプル(ステップ4.2-4.5の段階)をステージアダプターで固定します。これは画像取得時のドリフトを最小限に抑え、特に多色実験においてバッファ交換時の動きを防ぐために重要です。
選択したイメージング手法内で明視野モードに切り替え、ナノ粒子を基準にガラス面にフォーカスします。パーフェクトフォーカスシステム(PFS)を起動してください。PFSや類似のシステムは、視野方向のドリフトを後処理で修正できないため、取得時間全体にわたってピントを維持するために非常に重要です。
注:ニコンPFSは、オフセットレンズとラインCCD検出器を用いて、固定された基準面と試料の焦点面間の距離を継続的に監視・調整することで、試料を鮮明な焦点を維持します。画像取得とは独立して動作することで、システムはリアルタイム(~ミリ秒)でフォーカスドリフトを補正します。
PFSが有効な状態で、目的のイメージング面を選択します。U2OS mEGFP-Nup96細胞またはHeLa Kyoto mEGFP-Nup107細胞では、GFP標識NPCからの488 GFP信号を用いて最も平坦な細胞を特定し最適な焦点面を決定します。この段階では、光漂白を防ぐために最大レーザー出力の約10%の低出力レーザーを使用してください。
実験の名前と保存経路を定義してください。 タイム ボックスにチェックを入れて、間隔、所要時間、ループ数を設定します。連続取得の場合は、間隔を No Delay に設定し、ループ数のみを入力してください。これはフレーム数に相当します。
注意:下部のPFSボックスが選択されているか確認してから、実行ボタンを押してください。ソフトウェアは自動的に実験の推定期間を提供し、完了時にデータを保存します。実験が完了する前に停止するには、Finishキーを押して現在の進行状況を保存するか、Abortキーを押して保存せずに実験を終了します。
最初のタンパク質では、300msの積分時間で17,000〜20,000フレームを取得します。
注:この段階でイメージャーのストランド濃度を最適化し、単一分子信号が重なりつつ再構成に十分な局在を提供できるようにする必要があります。このプロセスは、重なりを最小限に抑えつつ再構成に必要な十分なイベント数を確保するためにイメージャーの集中度を調整する典型的なSMLM取得に似ています。最適な濃度は画像化される構造によって異なります。例えば、微小管のような高度に標識された構造は、通常より低いイメージャー濃度(1 nM未満)を必要とします。
次のタンパク質用のイメージングバッファーをピペットで優しく取り出し、サンプルを乱さないように注意してください。顕微鏡カメラで試料を監視しながら、イメージャーなしでC+バッファー200μLを慎重に追加し、最初の染料を洗浄します。
この工程を繰り返し、最初のDNAイメージャー溶液からの蛍光信号が検出されなくなるまで(通常は5回の洗浄)します。
2つ目のイメージャー溶液を追加し、単一分子イベントが検出されているか再度確認します。
2つ目のタンパク質は300msの積分時間で17,000〜20,000フレームを取得します。
追加で画像化するタンパク質ごとにステップ5.14-5.18を繰り返します。
3Dイメージングでは、セル高さ全体に0.5〜1μm間隔の zスタックを取得します。これは、取得ソフトウェア(NIS要素)向けに設計された特定のJOBプロトコル²¹ で行われ、特定の z 位置であらかじめ定められたフレーム数の映像を撮影し、取得期間中ずっとPSFを維持します。
注意:ソフトウェアパッケージおよび詳細なユーザー説明書は、JOBプロトコル²¹内で提供されています。職務内容の詳細な説明も含まれています。「MultiZ_DNAPaint.bin」と名付けられたこのソフトウェアは、出版物の資料タブからダウンロードできます。JOBを実行するには、このファイルをダウンロードし、NIS-Elements JOBSエクスプローラーに手順に従ってインポートしてください。

6. 画像処理と解析

注:画像はまず互換性のあるソフトウェアを用いたデコンボリューション処理を行い、その後ユングマン研究室¹⁶が開発したPicassoソフトウェアを用いて単一分子局在解析を行いました。

NIS-Elements ARソフトウェアで ND2画像スタック を開きます。
2D画像の場合は、 2Dデコンボリューションを選択します。3D画像については、各zスタックごとにこの手順を繰り返します。
ブラインドデコンボリューション(有効ピンホール0.01)を選び、ノイズレベルをノイズレベルに設定します。次に、レーザー励起率と放出率を入力します。ここではそれぞれ560 nmと571 nmです。その他のパラメータはND2メタデータから自動的に取得され、ソース画像点拡散関数(PSF)の大まかな推定値を提供します。
反復回数(こちらは12回)を指定し、「新しいドキュメントを作成」を選択し、「デコンボルブ」を押してください。処理後に得られたファイルを保存します。
注:このアルゴリズムは、PSFを収束または指定された反復回数に達するまで畳み込み処理を行うことで画像品質を反復的に向上させます。デコンボリューション画像の視覚的検査が推奨されます。計算上の制約や画像品質に応じて反復回数の調整が必要です。
デコンボリュート画像スタックをPicasso Localizeモジュールに読み込みます。
メニューバーから 「パラメータ解析」を選択し、メーカーの仕様に従ってカメラ固有のパラメータを入力し→本研究で使用されたsCMOSカメラ(浜松ORCA-Fusion BT)では、電磁利得:1、基準値:100、感度:0.23(変換係数、電子数/数)、量子効率:0.95(使用された励起波長に依存)。
注意:Quantum EfficiencyはPicassoバージョン0.6.0以降は使用されず、後方互換性のためのみ保持されています。
箱の側面の長さを7に設定してください。ボックス長は[6 × σ_PSF + 1]の式で決定され、_PSFの標準偏差σこの最適化により、定位精度が向上し、再構成画像の解像度が向上します。
セクションステップ5.5に従い、イメージング構成に適したピクセルサイズを選択します。
次に、適切な最小ネット勾配(例:サンプルによって~1000)を選び、検出したローカライゼーションを可視化するためにプレビューを有効にします。結果を検査し、必要に応じて勾配閾値を調整してバックグラウンド検出を最小限に抑え、正確な位置定位を確保してください。
メニューバーから 「分析→ローカライズ(特定・フィット)」を選択して、すべての映画フレームでスポットの特定とフィットを始めます。コンペティション後、このプロセスで自動的に.hdf5と.yamlファイルが保存されます。
注:.hdf5ファイルは各ガウスフィットのローカライゼーション位置とその他のパラメータを保存します。.yamlファイルは動画や解析手順の情報を保存し、テキストエディタで確認できます。
ピカソ・レンダーモジュールで.hdf5ファイルを読み込み、再構築されたローカライゼーションマップを可視化し、ドリフト補正を行います。
Picasso Renderで「 Postprocess → Undrift by RCC」を選択してください。1000から始めるセグメンテーション値を入力します。完了すると、計算されたxyドリフトプロットが表示されます。このプロセスを、より低いセグメンテーション値(例:500、次に250)で順次繰り返し、時間的ドリフトの徐々の改善が観察されます。
注意:ドリフト補正はナノ粒子を基準マーカーとして用いても可能です。しかし、高台面を撮影するとナノ粒子信号が見えないこともあります。この場合、冗長な交相関(RCC)ドリフト補正のみが適用されます。
ドリフト修正ファイルを保存し、Picasso Renderウィンドウを閉じる前に「 Save Localizations」→「ファイル 」を選択してください。
ステップ6.13のドリフト補正ファイルをピカソフィルターモジュールに読み込み、単一分子局在の品質指標に閾値を課すことで、(i) 局在精度(lpx, lpy);(ii) PSF幅(sx, sy);(iii) 光子数;および(iv)ノイズ、外れ値、または未解決のスポットを除去するための追加の基準。
注:lpxおよびlpy(xおよびyの局在精度)は、x軸およびy軸に沿った局所スポット位置の不確実性を推定し、Cramér-Rao下限(CRLB)に基づいて計算されます。
1つのプロパティをフィルタリングするには、テーブルのヘッダーで該当する列を選択し、メニューから「 ヒストグラム→プロット 」を選択します。
注:2列を選択すると2次元ヒストグラムが描かれます。
特定の性質範囲でフィルタリングするには、1次元または2次元のヒストグラム内で目的の領域をクリックしてドラッグします。選択した地域は緑色で影付けされ、この範囲外のローカライゼーションイベントは即座にローカライズリストから除外されます。
光子、sx、sy、lpx、lpyでフィルタリングし、各パラメータの分布の中心部分範囲のみを保持することで、最も信頼性の高い局在化を保持します。
注:PSF幅分布の中央部分は通常0.4ピクセルから1.2ピクセルの間×です。重なり合う信号や不十分なスポットによって引き起こされる二次分布は除外します。
フィルターされたデータを保存するには、メニューから 「ファイル→保存 」を選択してください。
各イメージャーソリューションで撮影されたすべての動画について、ステップ6.1から6.18までのプロセスを繰り返します。
Picasso Renderモジュールでフィルター済みのファイルを開きます。この超分解画像の強度は局所化の数を表します。コントラストは「 表示設定→表示」 を選択し、最大密度の値を変更することで変更できます。
単一チャンネルの超解像度画像を保存するには、ぼかしセクションから「個別の位置定位精度」を選択してください。スケールバーはスケールバーセクションから追加することも可能です。
すべてのチャンネルの超高解像度画像を保存するには、処理済みの.hdf5ファイルをすべて開いてください。各チャンネルの色は、メニューから 「ファイルを→表示 」を選択することで変更できます。
すべてのチャンネルをアライメントし、ポストプロセッシングを選択してください→アラインチャネル。
画像を保存するには 「ファイル→完全画像をエクスポート 」を選択し、画像の特定のズームを.png保存するには「ファイル →エクスポート・現在のビュー 」を保存してください。
注意:再現性のために一貫したファイル名とドキュメントの方法を用いてください。ピカソのソフトウェアは、保存した各ファイルに自動的に接尾辞を追加します。クレイマー・ラオ下限および最近傍解析(NeNA)²²の指標は、メニューから「表示」→「表示」を選択することで抽出できます。NeNAは、隣接する局在性間のユークリッド距離を評価することで、局所化された蛍光素体の空間分布を定量化します。CRLBは光子統計と背景ノイズに基づく局在精度の理論的下限を提供しますが、NeNAはデータセット自体から直接導き出された局在精度の実験的推定値を提供します。このため、NeNAは理論的な極限だけでなく、ドリフト補正、フィッティング誤差、実験変動などの実用的影響も捉えているため、CRLBの補完的な指標としてSMLMで広く用いられています。NeNA計量はピカソレンダリングモジュールから抽出されます。単一分子適合のCRLBを用いて局所精度値(_{σ SMLM})を決定します。報告される値は、すべての局在_{化について}_xとyのσ σ間の平均値であり、それぞれxとyにおける局在精度の分布のモード値です。

結果

SDC-OPRシステムの超分解能イメージング能力(図1A)を示すため、核孔複合体(NPC)に対するDNA-PAINTイメージング実験(図1B)を用いて面内分解能を評価しました。NPCは生物学的基準構造です¹⁷。 図1C は、U2OS細胞におけるヌクレオポリン96(Nup96)の代表的なDNAペイントSDC-OPR画像を示しており、単量体強化緑色蛍光タンパク質(mEGFPs)で標識され、DNA結合した抗GFPナノボディで標識されています。ズームインパネルではNUPのサブ構造が明らかになり、 図1D は核孔の予想される8対称性に一致するNup96タンパク質(矢印で示される)を示しています。 図1Eでは、Nup96ペア間のユークリッド距離を、合わせて合計画像(n=16ペア)の断面ヒストグラムをプロットすることで測定しました。解析の結果、ピーク間で(13 ± 2)nmの分離が示され、これはEMモデルやHILO、TIRイメージング²³の結果と一致しました。各ピークフィットは標準偏差4nmを示し、SDC-OPRでDNA-PAINTを用いて達成された高い局在精度(σ_SMLM = 3.3 nm、NeNA = 4.4 nm)を裏付けました。特筆すべきは、この精度が53 × 53 μm² FOV全体にわたって維持され、共焦点ベースのシステムとしては例外的である点です。

多色イメージングの能力を示すために、U2OS細胞内のNup96、ミトコンドリア、微小管をDNA標識し、Exchange-PAINT¹⁸を用いて取得しました。この技術は、単一の蛍光色素に直交するDNAイメージャーの鎖を用い、すべてのターゲットを同じレーザー源で励起させることを可能にします(図2A)。信号を同時に取得するのではなく、連続したイメージングラウンドに分けることで、商用SDC-OPRシステムへの統合を容易にします。 図2B は、抗GFPナノボディで標識された青色のNup96、赤色のミトコンドリアに二次抗TOM20抗体、緑色の微小管と一次抗αチューブリン抗体を示しています。特筆すべきは、単色Nup96イメージングで得られた優れた単一分子定位精度が、多ターゲット実験のすべてのターゲットで維持され、NPCで3.9 nm、α-チューブリンで4.0 nm、ミトコンドリアで3.3 nmの局在精度が得られたことです(図2B パネル1、2、3)。

大視野画像では、HeLaセル内の微小管をSDC-OPRシステムで利用可能なさまざまな倍率と、78nmから108nmの間のピクセルサイズを維持するための異なるカメラビニング設定を組み合わせてイメージングしました(図3)。図3Aは10個のHeLa細胞の微小管細胞骨格を示しており、色は局所化の精度を示しています。1×倍率では、平均定位精度は高倍率に比べて明らかに劣っており(図3B-D)、変動が顕著に観察されます。これは、広い視野でレーザーの出力密度が低下し、ガウス照明プロファイルが明らかになるため、視野の端に向かうにつれて精度が低下するためです。それでも、広大な211 × 211 μm² FOVにわたる平均定位精度9.5 nmの達成は、共焦点ベースのシステムとしては印象的であり、生物学的異質性の高解像度調査を可能にします。

最後に、固定されたHeLa細胞の共焦点体積~500 nm厚、zステップ1 μmのDNAPAINT画像を取得することで、システム内の最大倍率(4×、53 × 53 μm² FOV)で、全細胞のイメージングが可能であることが示されています。 図4A は各 z平面の単一分子再構成画像と、対応する局在精度およびNeNA値を示しています。さらに、 図4CにはHeLa細胞内の微小管ネットワークの3Dカラーレンダリング可視化が提供されています。深さが増すにつれて、散乱や光学収差により検出される光子の数が減少し、その結果、Cramér-Rao下限(CRLB)(図4A右)から導出される定位精度とNeNA計量で計算される位置特定精度の両方で低下します。それでも、SDC-OPRシステムによる高レベルの光子収集により、SMLM≤10 nm、最大9 μm深さ、狭い分布での_SMLM 可能σとなります。実際、二重壁のフィラメント微小管構造は、カバースリップ-セル界面付近、中間軸位置、細胞上部で明確に解像されており、ピーク間距離は30nmから40nmの間で(図4C)、報告された値²⁴と一致しています。これらの結果は、SDC-OPRが広い視野角およびセル全体の高さにわたって高解像度イメージングを提供できることを強調しています。

図1: 異なる細胞サンプルの平面内単一分子局在顕微鏡および多色超分解能イメージング。 (A) 光子回収を最大化するために設計されたマイクロレンズアレイを備えたスピニングディスク共焦点(SDC-OPR)システムの回路図。(B) DNA-PAINTの概略図:蛍光標識されたDNA鎖( イメージャー ズ鎖)は、対象タンパク質を標的とする抗体/ナノボディに固定された補完的なDNA配列(ドッキング 鎖)と一時的にハイブリダイズします。これらの短命な結合イベントは、確率的な点滅として見える蛍光信号を生成します。(C) SDC-OPRシステム上で、U2OSセルのNPCを4×倍率で代表的なDNA-PAINT画像取得。高解像度の能力は挿入図で示されており、個々のNPCが明確に解決されています。(D) SDC-OPR強化DNA-PAINTは、白い矢印で孔構造内の特徴的なNup96タンパク質ペアを強調する単一のNPCの可視化を可能にします。(E) 単一のNPC対称単位内のNup96ダイマー(n=16ペア)間の距離測定分布。この図はZazaら¹⁴から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:SDC-OPR顕微鏡を用いた多色イメージングのためのExchange-PAINT。 (A) 3つのターゲットを順次画像したExchange-PAINTの回路図。3つのタンパク質標的はDNA官能化抗体、Fab断片、またはナノボディで標識されました。Cy3Bイメージャーのストランドは、画像化ラウンド間でウォッシュステップを経て、ストランドの種類ごとに順次イメージングされました。(B) SDC-OPR顕微鏡(4×倍率)を用いたU2OS細胞の三色交換-PAINT画像化。微小管(赤色;DNA結合抗αチューブリンで標識済み)、ミトコンドリア(緑色;TOM20標的DNAナノボディ)、およびNPC(青色;mEGFPタグ付きNup96と抗GFP DNAナノボディ)。スケールバー:5 μm。ズームイン領域はSDC-OPRシステムで得られた高解像度を強調し、(1)ミトコンドリア、(2)微小管、(3)NUPに焦点を当てています。スケールバー=1μm。この図はZazaら¹⁴から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:SDC-OPR顕微鏡による大視野内でのDNA-PAINTイメージング。マイクロチューブDNA-PAINT画像(アンチαチューブリン標識)は、(A)1×倍率と1ビニング(FOV211 × 211 μm²)、(B)2.8×および2ビニング(FOV76 × 76 μm²)、(C)4×倍率・4ビニング(FOV 53 × 53 μm²)で取得。カラーは1倍倍の倍率の場合0-16 nm、その他の倍率では0-4 nmの定位精度を表します。(D) FOV中心から異なる距離(μm単位)で測定した位置定位精度。1×(赤)、2.8×(黄)、4×(緑)の倍率。この図はZazaら¹⁴から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:全細胞DNA-PAINTイメージング。 (A) 左。 SDC-OPRを用いて4×倍率で取得した HeLa細胞の 体積微小管イメージングを行い、z=0から9μmまでの軸方向断面(1μmステップ)を表示しました。各平面は z 位置、定位精度、NeNA計量を示します。スケールバー:5μm(xy)。 そうだね。すべての飛行機における定位精度と貫通深度の比較。(B)(A)と同じHeLaセル上の微小管ネットワークの3Dレンダリング。色は0から9μmまでの貫通深度を表します。(C) (A)に示された各貫入深度から強調された小さな領域のズーム画像。この図はZazaら¹⁴から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

超分解能蛍光顕微鏡は回折障壁を破り、空間分解能を劇的に向上させました。しかし、生物学的研究におけるその広範な採用は依然として課題に直面しています。特に、視野角、解像度、貫通深度のトレードオフがあるため、これら3つの要素を同時に最適化するのは難しいです。これらの課題は、SMLMと光光子再割り当て(SDC-OPR)によって強化された回転ディスク共焦点顕微鏡の複合機能を活用することで解決されました。マイクロレンズアレイを標準SDC構成に統合することで、商用SDC-OPRシステムによって可能となり、光子の収集が増加し、実効ピンホールサイズが縮小され、解像度が大幅に向上しました。標準SDCと比較して、SDC-OPRシステムは分解能の著しい向上を示し、焦点面で10 nm¹⁴ 分離された特徴を識別することに成功しました。標準SDCは20 nm¹¹を超える距離しか識別できませんでした。この強化された分解能は、分子規模の分離を達成するための光子再割り当ての利点を強調しています。具体的には、焦点面(z = 0 μm)で2nm未満の横方向定位精度が達成され、最大9 μmの深さでは横方向精度が10 nm未満に保たれ、さらに53 × 53 μm²(76 × 76 μm²)の高度に適応性の高いFOVを実現しました。211 × 211 μm²の広い視野域でも、このシステムは9.5 nmの平均面内定位精度を誇りました。これらの結果は、システムが細胞全体で高解像度イメージングを行う能力を示しています。

異なる抗体の結合反応については、最適な抗体対DNA比率を確保するためにプロトコルを慎重に遵守する必要があります。この比率を超えると局所化の精度が低下し、qPAINT²⁵で行われるような定量的測定に悪影響を及ぼす可能性があります。したがって、DNAと抗体の最終的な1:1比率を確保するために、マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を用いて比率を検証することが極めて重要です。

微小管の高品質な超解像度画像を得るための重要なステップは、適切な固定です。従来の固定法は高濃度PFAのみに依存し、微小管の構造を破壊することが多いです。代わりに、グルターアルデヒド(GA)単独またはPFAと併用することで構造保存が有意に改善されます^26,27。

最適なイメージングのためには、高開口(NA)対物レンズが単一分子イベントあたりの光子収集を最大化するために不可欠です。商用SDC-OPRシステムでは、サンプルの光漂白を最小限に抑えるため、SMLMで使われる従来のTIRF顕微鏡よりもレーザー出力が意図的に低く設定されています。DNA-PAINTは光漂白の問題を排除し、理論的にはより高いレーザー出力を用いる可能性がありますが、現在の市販システムには制限があり、TIRF照明に比べて露光時間が長くなります。さらに、SDC-OPRの照明は共焦点であるため、露出中に分子が連続的に励起されるわけではありません。その結果、連続的なTIRF照明に比べてより長い露光時間が必要となります。本研究では、300 msの露光時間が用いられました。しかし、実験の解像度要件に応じて、分解能²⁸の損失を最小限に抑えた150〜200 msなどの短い積分時間が用いられます。

イメージャーストランドの濃度を最適化することは、単一分子信号が適切に分離されつつ、正確な再構築のために十分な局在化を生み出すための重要なステップです。この調整は、イベント密度と信号の重複のバランスを慎重に制御する標準的なSMLM取得に類似しています。最適なイメージャーの濃度は、それぞれ異なるターゲットごとに調整されるべきです。例えば、微小管の場合、初期イメージャーの鎖濃度は1 nM未満が推奨され、必要に応じて調整が行われます。

長時間の取得時に安定したピントを維持することは極めて重要であり、軸方向(z)ドリフトは後処理で修正できません。横方向(xy)ドリフトはRCCや基準マーカー によって 補正できます。このセットアップでは、顕微鏡のパーフェクトフォーカスシステム(PFS)が長時間の撮影中も焦点の安定性を保証します。

まとめると、SMLMとSDC-OPRの統合は、従来の解像度、深度、視野角のトレードオフを克服し、細胞全体での高解像度イメージングを実現する強力なプラットフォームを提供します。しかし、システムの能力を完全に発揮するには、抗体の結合や固定から取得設定、データ処理に至るまで、実験条件への細心の注意が必要です。試料準備からドリフト補正まで、各ステップが信頼性が高く高精度なデータを得る上で重要な役割を果たします。慎重なプロトコル最適化により、このアプローチは複雑な生物サンプルにおける定量的かつナノスケールのイメージングにおいて、堅牢かつ多用途なソリューションを提供します。このプロトコルは、単一分子局在顕微鏡の導入や、従来のTIRFやHILO照明ではアクセス困難なサンプル面からの超分解像取得を支援することが期待されています。これらの目的は、世界中の顕微鏡施設で一般的に見られる市販の顕微鏡を用いて実現されます。

他および将来の応用に関しては、この手法は、過去の研究¹⁴で示されたように、より深い画像深さのより複雑な組織サンプルだけでなく、より深い画像解析のサンプルにも応用可能です。物理的切片を必要とする手法とは異なり、この技術は無傷組織の体積イメージングを可能にし、自然な構造を保存し、物理的切片によって生じるアーティファクトを最小限に抑えます。ナノボディのような小型アフィニティプローブの使用は、全長抗体に比べて組織の浸透性を高め、厚いサンプル全体でより均一な標識を可能にします。このアプローチにより、細胞の組織や分子分布をより高精度で現場で研究する扉が開かれます。これらの応用に加え、この戦略はナノ構造や生体分子アセンブリのハイスループットスクリーニングにも適しており、構造の異質性や機能の体系的な調査を可能にします。さらに、最近のDNA-PAINTの発展により、染料-焼却器または染料-染料相互作用^29,30,31に基づく自己消滅イメージャープローブが登場し、背景信号を効果的に低減し、蛍光強度を高め、空間分解能を向上させ、より高速な獲得速度を実現しています。これらの蛍光プローブをSDC-OPRフレームワークに統合することで、画像処理速度と解像度の両方をさらに向上させる可能性があります。これらの進歩とSDC-OPRシステムの強みを組み合わせることで、より複雑な生物標本への適用可能性を拡大し、多様な組織における細胞および分子構造の詳細なマッピングのための柔軟なツールとしての地位を確立する可能性があります。

開示事項

著者たちには宣言するものは何もない。

謝辞

この研究は、ヒューマンフロンティア科学プログラム機構(HFSP)から、CZ(LT0025/2023-C)への学際的なポスドクフェローシップおよび工学・物理科学研究評議会の資金提供を受け、M.T.(EP/R513143/1およびEP/W524335/1)およびO.P.L.D(EP/R513143/1およびEP/T517793/1)を支援しました。S.Sはまた、ドロシー・ホジキン・フェローシップ(DHF\R1\およびDHF\R\191019 251006を通じて王立協会を称賛しています。この活動は、チャン・ザッカーバーグ・イニシアティブ(2023-321188)およびBBSCR(BB/Y513064/1)からの助成金によっても支援されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
(±)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸	メルク	238813-5G	トロロックス
3,4-ジヒドロキシベンゾン酸	メルク	37580-25G-F	PCA
60回以上;Apo NA 1.49 対物レンズ	ニコン
7.0 KDAスピン脱塩カラム(サイズ排除樹脂を含む );	フィッシャー・サイエンティフィック社	89882	ステップ2.4のZebaスピン脱塩カラム
アキュターゼ - 酵素細胞剥離培地	プロモセル	C-41310
アルパカsdAb(1H1)抗GFPとカスタムDNA結合(sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')	マッシブフォトニクス	カスタム製品	ショウジョウバエに対するアンチGFPナノボディ
アルパカsdAb(1H1)抗GFPとDNA結合	マッシブフォトニクス	MASSIVE-TAG-Q-FAST アンチGFP - F3	NUP用のアンチGFPナノボディ
抗αチューブリン(YL1/2)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	MA1-80017
抗ウサギIgG	マッシブフォトニクス	Massive-sdAB-FAST 2-Plex、セカンダリSDAB F2
反TCRζ(6B10.2)	バイオレジェンド	644102
牛血清アルブミン	メルク	A4503-10G	BSA
円錐形遠心管 15 mL	フィッシャー・サイエンティフィック社	17705004
円錐形遠心管 50 mL	VWRインターナショナル	734-0448
CSU-W1 SoRa	ニコン		SDC-OPR顕微鏡
スピンカラムの脱塩はSephadex G-25(DNA精製のためのサイズ除外樹脂)	フィッシャー・サイエンティフィック社	11743309	ブランド:シティバ。ステップ2.5のG-25列
D-グルコース	メルク	G8270-1KG
DMEMメディア	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11965092
DMSO、無水	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	D12345
DTT (ジチオスレイトール)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15976082
EDTA	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15575020
EGTA	マーク	324626
胎児用牛血清	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A5256701
グルターアルデヒド	セルヴァ	2311402
グリセロール	メルク	G5516-500ML
グリシン	MPバイオメディカル	219482580
マレイミド-PEG2-スクシンニミジル	メルク	746223-50MG
マッコイの5Aメディア	フィッシャー・サイエンティフィック社	16600082
MES(2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸)	メルク	M3671-50G
メタノール	フィッシャー・サイエンティフィック社	32213-25L
MgCl₂	フィッシャー・サイエンティフィック社	10418464
マイクロ遠心分離機チューブ 0.5 mL	フィッシャー・サイエンティフィック社	11508232
マイクロ遠心分離機チューブ 1.5 mL	エッペンドルフ	10509691
マイクロボリュームUV-Vis分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	ND-ONE-W	ナノドロップ
NaCl₂	シグマ・オルドリッチ	S6546-1L
ナノ粒子 90 nm -金	細胞診断	G-90-100
Orca Fusion-BT CMOS カメラ	浜松
ペニシリン・ストレプトマイシン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15070063	P/S
リン酸塩緩衝生理食塩水(1x溶液)	フィッシャー・サイエンティフィック社	11530546	PBS
ピアス 16% ホルムアルデヒド(w/v)、メタノールフリー	フィッシャー・サイエンティフィック社	11586711	PFA(顔色発射法)
塩化カリウム	メルク	P9541-500G
プロトカテチュアート3,4-ジオキシゲナーゼおよびnbsp;	メルク	P8279-25UN	PCD
ナトリウム水酸化物	フィッシャー・サイエンティフィック社	12963614
TOM20抗体	アブカム	Ab186735
トリスバッファ	VWRインターナショナル	A4577.1000
トリトン X-100	VWRインターナショナル	1086031000
トゥイーン-20	メルク	P9416-50ML
超外ろ過遠心ろ過装置、100 kDa MWCO	メルク	UFC510024	製造元:アミコン・ウルトラ
μ-スライド 8井戸高ガラス底	イビディ	IB-80807
μ-スライド VI 0.5 ガラス底	イビディ	IB-80607

参考文献

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