病原体関連分子パターンによる精巣上体炎のマウスモデル

サマリー

ここでは、マウスの初期セグメント(間質注射)および尾部上体(血管内注射)における炎症刺激誘導のための2つの異なる外科的注射モデルを記述しています。これらの手法により、エピディジムの異なる領域における領域特異的反応の研究が可能となります。

要約

精巣上体炎は外来泌尿器科クリニックで非常に多く見られ、男性不妊の重要な要因です。性感染症や一般的な尿路病原体を含む細菌感染は、精巣上体炎の最も一般的な病因要因です。それにもかかわらず、細菌性精巣上体炎の発症、自然経過、転帰の病態生理学的メカニズムは依然として十分に解明されていません。この点で、齧歯類モデルは、さまざまな炎症性や感染刺激に挑戦された際の精巣上体のメカニズム的応答を調査する上で貴重なツールとなります。ラットとマウスの研究では、グラム陰性菌とグラム陽性菌のリポ多糖(LPS)やリポテイコ酸(LTA)などの細菌由来病原体関連分子パターン(PAMPs)が、精巣上体に急性炎症を引き起こすことが示されました。これらの炎症反応の重症度は、影響を受ける精巣上体領域によって異なり、精子パラメータの低下と関連しています。本書では、マウスの初期セグメント間質区画または尾精管上体部にPAMPsを注射して上体上体炎を誘発する2つの異なる外科的アプローチを詳細に述べ、これにより上体上体近位および遠位領域の炎症反応の調査を可能にします。これらの精巣上体炎の実験モデルは、侵入する病原体に対する上体体反応を支配するメカニズムの理解を進める将来の研究を可能にし、男性の生殖能力への影響を緩和するための治療的介入の新たな道を開くことが期待されています。

概要

精巣上体は粘膜の男性生殖器官で、遠心性の管と精管をつなぐ単一の非常に複雑な管から成ります。精巣上体は精子の成熟(精子の運動性と受精能力の獲得)、集中、輸送、貯蔵、射精までの保護に不可欠です^1,2。古典的には、齧歯類の上体上体は4つの解剖学的領域から成り立っています:初期節、頭節、尾体、尾^部1(図1)。さらに、各精巣上体領域は間質結合隔隔で区切られた追加の節に細分することができ、マウスの上体上体³には10節の存在を示しています(図1)。

精巣上体の免疫生物学は、免疫調節障害と男性不妊の関連により研究分野が拡大^{しています。}過去20年の研究により、上体体は免疫系の異なる成分で構成されていることが明らかになりました。例えば、常駐免疫細胞タイプ(例:単核食細胞やリンパ球)や病原認識受容体[PRRs、例:トール様受容体(TLRs)やNOD様受容体]が複数の非免疫・免疫細胞タイプに発現し、これらが一体として動的な領域特異的上体上体微環境を形成しています5^{。6、7、8、9}。これらの上体上体免疫成分は、上行性精子に対する免疫耐性を調整しつつ、上行尿道感染症やその他の有害刺激に対する免疫応答を迅速に誘導する二重の能力において重要な役割を果たします(^4,10)。この精巣上体における複雑な免疫バランスに影響を与える要因は、上体機能に悪影響を及ぼし、男性の生殖能力に悪影響を及ぼす可能性があるため、さらなる調査が必要です。

この文脈で、精巣上体炎(総称して副上体炎)はあらゆる年齢の男性で非常に多く見られ、男性の不妊および不妊の重要な病因要因となっています^4,11,12。精巣上体炎は18歳から50歳の男性泌尿器科で5番目に多い診断で、米国だけで年間約60万件(^4,13件)が報告されています。尿生殖器病原体(例:大腸菌)や性感染症(例:クラミジア・トラコマティス)による上行性管感染症が、精巣上体炎の最も一般的な原因です^4,14。ほとんどの精巣上体炎患者は尾部上体上体に痛みを感じますが、口部ではそれほど頻度が低く、上体上体が炎症刺激に対して領域特異的な反応を引き起こす能力に関連する臨床的意義を強調しています¹⁰。精巣上体炎は精液の指標(例:精子濃度や運動性)の著しい悪化を引き起こし、急性期には明らかな白血球精子症も発症^します。特に、薬物治療が成功し症状寛解があったにもかかわらず、持続性の少精子症または無精子症を患う患者のかなりのコホートが存在します^16,17。精巣上体炎の結果が精子の質に与える長期的な影響のメカニズムは、依然として十分に解明されていません。

ヒト急性精巣上体感染のサンプルは稀であり、精巣上体生検は穿刺による病原体の制御不能な拡散リスクがあり、敗血症や臓器損傷、管破裂による間質区画への精子漏れのリスクがあるため禁忌^です。したがって、精巣上体炎の動物モデルは疾患のメカニズムを調査する重要なツールとなり、炎症反応と転帰の評価を可能にします ^4,12。この点で、齧歯類(ラットとマウス)は、制御された実験環境で精巣上体炎を研究するために最も一般的に用いられるモデル生物です(^4,12)。細菌性精巣上体炎の異なる齧歯類モデルは、病原体の種類(例:尿路性大腸菌やC. trachomatis)、感染経路(例:逆行性管状注射および間質注射)、感染局所(例:初期節および尾尾上体上腺)、および注射後の時間経過(例:数時間から数^{日)に基づいて}確立されています^4,12。

病原体関連分子パターン(PAMP)の利用は、異なる病原体(例:細菌、ウイルス、真菌)に関連する異なる分子によって引き起こされる病因生理機構を、TLRやシグナル伝達^経路5,18,19,20,21の活性化を通じて、精巣上体炎の研究に貴重なツールを提供します.例えば、リポ多糖(LPS)などのグラム陰性菌およびグラム陽性菌の細胞壁由来のPAMPs;TLR4作動薬)およびリポテイコ酸(LTA;それぞれTLR2/TLR6作動薬は、静脈内投与、腹腔内投与、または上体上体部位への直接注射など複数の投与経路を通じて精巣上体炎を引き起こすために用い^{られています。}これらの条件下では、LPSとLTAの両方がラットおよびマウスの上体に炎症反応を誘導し、特定の炎症メディエーターの調節や免疫細胞の部位・時間特異的な動員に関連しています(^19,20)。特に、マウスの初期節節間質区画や尾尾上体上体筋への管腔区画におけるPAMPsの領域特異的投与は、異なる炎症刺激に対する上体上体の近位および遠位応答を調査するための有用モデルとして最近浮上しました。^{これにより}、臓器の異なる免疫環境とそれらが疾患転帰に与える影響を理解するための枠組みを提供します^。18、19。

ここでは、マウスの上体上体、すなわち初期節と尾尾上体をそれぞれ間質性および逆行性の血管内注射経路を用いて、直接炎症刺激を誘導するための2つの異なる実験プロトコルを提示します。これらの異なるアプローチを組み合わせることで、PAMPsの局所的な投与と炎症中の副上体の反対領域の評価が可能になります。

プロトコル

すべての動物実験は、米国国立衛生研究所(NIH)および動物実験管理協議会(CONCEA、ブラジル)に従って実施されました。手続的承認は実験動物利用倫理委員会(CEUA-IBB/UNESP、ブラジル、プロトコル番号:6272050320; 2269040625)によって付与されました。これらの研究では成体のC57BL/6オスマウス(90〜120日)を用いました。本研究で使用される試薬および機器は材料表に記載されています。

1. 精巣上体の初期区間への間質性注射

1. マウス術前準備
   1. ケタミン/キシラジン(60/20 mg/kg、独立投与)で全身麻酔を誘導します。(機関で承認されたプロトコルに従っています)。麻酔後は、マウスを手術フィールドの仰向け姿勢に置きます。
      注意:切開前に足の指をしっかりつまんで、ペダル反射がないか確認してください。吸入麻酔薬(例:イソフルラン)はケタミンやキシラジンの代替として使用できます。
   2. 電動トリマーペンの形状を使ってマウス腹部のトリコトミーを作成します(図2A)。
   3. クロルヘキシジン0.25%(v/v)で湿潤した滅菌綿で腹部無菌を行います。
2. 初期セグメントの間質区画への注入
   1. サイズ15のメスを使い、腹壁右側に~4mmの垂直切開を優しく行います(図2A)。
      注意:包皮腺には注意してください。
   2. 斜めの鈍い手術用鉗子で、優しく皮膚を切り離します。サイズ15のメスを使い、腹壁の最初の切開箇所の腹膜に~4mmの垂直切開を優しく行います。
   3. 腹部の空間のために精巣上腺と精巣を慎重に持ち上げ、陰嚢の右側を押します。
      注意:以下の処置を行うには、ヘッドバンド拡大鏡または立体顕微鏡のいずれかを使用してください。
   4. カーブ手術用鉗子を使い、上体上体白色脂肪組織(eWAT)を慎重に引き抜き、上体上体の最初の区間を局所化します。eWATを使い、切開部の初期セグメントを優しく露出させます(図2A)。
   5. 注射液をあらかじめ装填したハミルトン注射器を、初期セグメントのセグメント#1に約90°平行な角度で配置します。針の面取りを下向きにして、間質空間に慎重に針を挿入します(図2A および 補足図1)。
      注意:精巣上体管を刺さないように注意してください。針を傾けないでください。
   6. カーブ手術用鉗子を針の挿入部分に位置させ、精巣上体包と針を優しくつまみます。注射器プランジャーをゆっくりと下げ、刺激液がすべて排出されるまで続けます(図2A)。
      注:最大注入量:10 μL。
   7. 湾曲手術用鉗子を正しい位置に保ち、慎重に針を抜いてください。約30秒後に手術用カーブ鉗子を外します。
   8. eWATを使って、組織を優しく腹腔に戻します。
      注意:最初のセグメントはピンチせず、eWATのみをピンチしてください。
   9. 腹膜を局所化し、針ホルダーとサイズ5/0の外科用縫合糸で2針縫合します(補足図1参照)。
      注意:腹膜の切開部が閉じているか確認してください。必要ならもう一度縫い目を作ってください。
   10. 皮膚切開部を針ホルダーとサイズ5/0の外科用縫合糸で2針縫合して閉じます(図2A)。
   11. 左側に間質性注射を行うために、ステップ1.2.10-1.2.10を繰り返します。
3. 術後ケア
   1. 術後のマウスの回復を観察し、適切な回復を確認しましょう。手術後はケージ内での動きがより遅くなり、約12〜24時間で通常の行動に戻ると予想されます。

2. 尾部精巣上体への血管内注射

1. マウス術前準備
   1. ケタミン/キシラジン(60/20 mg/kg、無理内)で全身麻酔を誘導します。麻酔後は、マウスを手術フィールドの仰向け姿勢に置きます。
      注意:切開前に足の指をしっかりつまんで、ペダル反射がないか確認してください。吸入麻酔薬(例:イソフルラン)はケタミンやキシラジンの代替として使用できます。
   2. 人差し指と親指を陰嚢の下に当てて、精巣と精巣上体の位置を確認します。必要に応じて、腹部の側面を陰嚢に向かって慎重にマッサージし、精巣と精巣上体を陰嚢内に位置させます。
   3. 電動トリマーペンの形状を使ってネズミの陰嚢の三分法を作成します(図3A)。
   4. 無菌綿にクロルヘキシジン0.25%(v/v)で濡らした陰嚢無菌を行います。
2. 輸精管の腔室への逆行性注射は尾精巣上体炎に向かって行われます
   注意:以下の処置を行うには、ヘッドバンド拡大鏡または立体顕微鏡のいずれかを使用してください。
   1. 陰嚢の下に人差し指と親指を置き、陰嚢の皮膚を優しく伸ばしたまま、サイズ15のメスで陰嚢の内側部分に~2mmの垂直切開を優しく行い、皮膚、外精膜を切断します(図3A)。
   2. 人差し指を使って、左精巣と精巣上体を優しく腹部に戻し、右精巣と精巣上体は陰嚢内に留めます。
   3. 人差し指と親指を右精巣と精巣上体の下に置き、陰嚢の皮膚を優しく伸ばしたまま、内精膜の斜めの鈍頭外科用鉗子を慎重に開閉し、内精膜と膣のチュニックを破るまで続けます。
   4. 人差し指と親指の圧力を和らげてください。膣のチュニックの開口部から、斜めの手術用鉗子を陰嚢の根元に挿入します。尾部精巣上体脂肪を慎重に引き抜き、尾部精巣上体を局所化します。
   5. 精管を局所化し、直線的な外科用鉗子をその下に配置します。精管内では、ブルドッグピンセットクランプを位置させ、尾部精巣上体とブルドッグピンセットクランプの間に置く直線的な手術用鉗子を開けるための十分なスペースを確保します(必要に応じて、血管を損傷しないように手術用鉗子の開口を制限してください)(図3A)。
   6. 注射液をあらかじめ充填したハミルトン注射器を、精管に対して約10〜15°平行な角度で位置づけ、針の面取りを上向きに挿入します(図3Aおよび 補足図1)。
   7. 直線の手術用鉗子を絞って精管を緩め、その後シリンジプランジャーをゆっくりと下ろして刺激液をすべて排出します(図3A)。
      注:最大注入量:10 μL。
   8. まっすぐな手術用鉗子を外してください。湾曲した手術用鉗子を針の挿入部分に位置させ、優しくつまみ、慎重に針を抜きます。
   9. 約30秒後に手術用カーブ鉗子とブルドッグピンチクランプを外します。静脈管を陰嚢に優しく戻します。
   10. 膣のチュニックを局所化し、針ホルダーとサイズ5/0の外科用縫合糸で1針縫合します(補足図1参照)。
       注意:膣のチュニックの切開部が閉じているか確認してください。必要ならもう一度縫い目を作ってください。
   11. 人差し指を使って右精巣と精巣上体を優しく腹部に戻し、左精巣と精巣上体を陰嚢内に位置させます。
   12. 左側に血管内注射を行うために、手順2.2.3-2.10を繰り返します。
   13. 皮膚切開部を針ホルダーとサイズ5/0の外科用縫合糸で2針縫合して閉じます(図3A)。
3. 術後ケア
   1. 術後のマウスの回復を観察し、適切な回復を確認しましょう。手術後はケージ内での動きがより遅くなり、約12〜24時間で通常の行動に戻ると予想されます。

結果

ここでは、マウスの初期セグメントにおける炎症刺激(間質注射)と尾尾上体(血管内注射)に対する2つの異なる外科的注射モデルを記述します。前者は近位精巣上体に炎症反応を引き起こし、後者は遠位上体に炎症反応を引き起こします。

間質性注射は腹部の切開から行われ、鼠の精巣と精巣上体を陰嚢から鼠径管を通じて腹部へ移動させる可能性を利用します。切開部の初期セグメントを慎重に露出した後、精巣上体の最初のセグメント(セグメント#1)の間質空間に注射を行います(図2Aおよび補足図1)。Blue Evans染料を用いて、注入された溶液は主にマウスの上体部#1に最大30分間限定され、間質隔膜が^{注入物質の}ゲートに果たす役割が確認^{されました。}それにもかかわらず、染料は初期...

ディスカッション

ここでは、マウスにおける領域特異的エピディダミティス誘導のための2つの異なる外科的注射手法を提示します。これらは、間質注射 による 初期セグメントや逆行性血管内注射 による 尾部精巣上体炎を標的とした実験モデルの実施に用いられます。詳細で視覚的なガイドは、これらのプロトコルの明瞭さとアクセスしやすさを高め、再現性の向上を目指しています。

上体上体管の直径は近位から遠位領域にかけて大きくなり、管とその結合中隔とともに上位細菌感染に対する物理的なバリアとして機能します^22,23。研究は一貫して、逆行性の腔内細菌感染やPAMPsなどの他の炎症刺激が精巣上体領域間で異なる反応を誘導することを示しており、尾部上体は強健な免疫細胞の動員(例:単核食細胞や白血球のサブセット)や炎症性メディエーター(例:サイトカインやケモカイン)の調節を示します。一方、近位領域(上体体の初期節お...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
斜めの鈍頭外科用鉗子など;	ボンサー	xtycga1012
角度付き手術用鉗子	ボンサー	PWGHVV1012
ブルーエバンス解	シグマ・オルドリッチ	E2129
ブルドッグピンセットクランプ	ボンサー	JTKPQS1012
クロルヘキシジン	リオク&イアキューテ;雲母	リオヘックス 0.25%
カーブ手術用鉗子	ボンサー	506e6e1012
電動トリマーペン形状	-	-
ハミルトン注射器	ハミルトン	80400
ヘッドバンドの拡大鏡	OptiVISOR(OptiVISOR)	-
ケタミン	ヴェンコ動物健康	ケタレックス
LPS 大腸菌より 055:B55	インビボジェン	TLRL-pb5lps
黄色ブドウ球菌によるLTA	インビボジェン	tlrl-pslta
ニードルホルダー	ボンサー	8pihbf1012
サイズ5/0 外科用縫合糸	シャロン・メディカル	N550CTI20
無菌生理食塩水	-	-
ストレート外科用鉗子	ボンサー	ejaiuz1012
キシラジン	シンテック	シラジン