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方法論記事

LC-MS/MSによる原一次ALL細胞におけるビンクリスチンの細胞内定量のための エクスビブ 顕微法の開発と標準化

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DOI：

10.3791/69535

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2026年1月23日

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1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、一次小児ALL細胞におけるビンクリスチン蓄積の相対定量のためのLC-MS/MS法の確立と最適化を目指しました。

要約

原発小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞における細胞内ビンクリスチン(VCR)の定量化は、薬剤の取り込みにおけるサンプル特異的な違いを理解し、希少な患者資料を用いた実験研究を支援するために不可欠です。ここでは、患者由来の異種移植(PDX)で得られる一次細胞に最適化された簡潔なLC-MS/MSマイクロメソッドを紹介し、細胞の利用可能性の限界、細胞サイズの小さい、複数回の洗浄後の再現性回復の必要性といった主要な課題に対応します。1時間から5時間の時間経過アッセイでは、3時間の潜伏期間が最も高く、最も安定した細胞内VCRレベルが得られ、複製間での変動も低く示されました。方法最適化により、1条件あたり2.5×10個の6細胞を使用することで分析の堅牢性が向上し、1×10個の6細胞は繰り返し実験で分散が大きく見られました。さらに重要な改良点としては、タンパク質沈殿効率を高めるためのコールドメタノールの使用や、手順の変動を監視・最小化するための内部標準の導入が含まれていました。この方法は、関連する濃度範囲にわたる細胞内 VCR の感度かつ正確な定量を可能にしますが、3時間のインキュベーション後は最低検査用量(0.01μM)を定量化できませんでした。総じて、このマイクロメソッドは、一次ALLサンプルにおける細胞内 VCR の実用的で再現性が高く、拡張可能なアプローチを提供します。その設計は比較解析、 生前 モデルの検証、そして細胞内薬物定量をより広範な薬理学的評価に統合する将来の方法論的応用を支援します。

概要

急性リンパ芽球性白血病(ALL)は、全小児がんの約25%を占めており、依然として最も一般的な小児悪性腫瘍です1,2。治療の進歩により生存率は著しく向上し、現在では90%を超えています。ALLの生物学的複雑さは、細胞レベルでの疾患をより良く特徴づけるツールの開発を推進し続けています。

ビンカアルカロイド、特にVCRは、すべての治療プロトコルの重要な成分です。VCRは細胞内で細胞毒性を発揮するため、白血病細胞での取り込みと蓄積を理解することは、薬物反応、薬理力学、細胞挙動に関する研究において、生体外システムにおける不可欠です。しかし、細胞内薬物レベルの評価に利用可能な多くの方法は間接測定や半定量的手法に依存しており、再現性と感度が制限されています5,6,7。

同時に、多くの研究は依然として白血病細胞株に大きく依存しており、患者由来の一次細胞のような生物学的異質性や臨床的関連性を欠いています。一次サンプルは、細胞数の制限、サンプル品質の変動、低存在比の細胞内化合物を検出できる高感度の分析技術の必要性といった課題を抱えることが多い8。

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS/MS)は化学療法薬の正確な定量に必要な特異性と感度を提供しますが、原発白血病細胞で細胞内VCRを直接測定する標準化されたプロトコルは依然として少ないです。限られた患者物質と互換性のある堅牢なマイクロメソッドを確立することは、薬理学的プロファイリング、薬物-細胞相互作用の評価、疾患サブタイプや治療状態を比較するなど幅広い応用を促進する可能性があります。

本プロトコルでは、原発性白血病細胞における細胞内VCRの 体外 定量のためのLC-MS/MSを用いたマイクロメソッドの開発と最適化について説明します。方法開発に必要な十分な材料を得るため、患者サンプルを免疫不全のNSGマウスに移植しPDXモデル9を生成しました。 生体内 増殖後、ヒト白血病細胞が単離され、10を凍結保存しました。その後、解凍され、VCRで培養され、洗浄され、溶解され、LC-MS/MSで細胞内薬物濃度を測定されました。

この方法にはいくつかの利点があります。少人数(250万個)で十分で、感度が高く迅速であり、臨床的に関連性の高い一次サンプルと互換性があります。細胞内薬物含有量を直接測定するため、薬物の取り込み、化学療法に対する細胞反応、その他の血液悪性腫瘍の薬理学的課題を調査する研究者にとって信頼できる定量的ツールを提供します。

全体として、このプロトコルは小児ALLの研究に利用可能な分析ツールキットを拡充し、他の薬剤やサンプルタイプにも容易に適応可能で、白血病生物学、薬物挙動、精密薬理学の将来の研究を支援します。

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プロトコル

本研究で使用された白血病サンプルは、Centro Infantil Boldriniで治療を受けた患者のバイオバンクバイアルから採取され、インフォームドコンセントフォームを通じて細胞の使用が認められました。このプロジェクトは機関倫理委員会(CAAE 34601120.7.0000.5376)によって承認されました。動物におけるPDX生成のプロトコルは、Centro Infantil Boldrini(CEUA/Boldrini 0011-2020)の動物倫理委員会(Comissão de Ética no Uso de Animais)の規則と倫理指針に従って実施されました。

1. サンプル準備と薬物培養(1日目)

  1. 在庫および作業溶液の準備
    1. ビンクリスチン硫酸塩2.5mg(分子量:923 g/mol)を重量し、2.0 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶けて2.0 mLマイクロチューブに溶けて1.354 mMのストック溶液を合成します。完全に溶解するまでボルテックス。
      注意:DMSOは刺激物です。手袋を着用し、化学換気フードで取り扱ってください。
    2. 100μMの作動溶液は、VCRのストック溶液147.71μLとDMSO1,852.28μLを2.0mLマイクロチューブで混合して準備します。ボルテックスを徹底的に。
    3. 作業液500μLを4本の0.6mLマイクロチューブに分散し、-20°Cで最大数ヶ月保存します。アリコートを3回以上解凍するのは避けてください。
    4. 100 μMのビンブラスチン(VINB)作動溶液を、1.1 mMのストック溶液(硫酸ビンブラスチン 1 mg/mL、分子量:909.07 g/mol)と1,818.19 μLの滅菌超純水を2.0 mLマイクロチューブ内で混合して、100 μMビンブラスチン(VINB)作動溶液を準備します。均質になるまで渦巻き。
    5. VINBの動作するソリューションはVCRと同じ方法で分割してください。
    6. 50 mLチューブ内で49.95 mLのメタノールと50 μLのVINB作動溶液を混合し、メタノール+0.1 μM VINB溶液を準備します。均質になるまで渦巻き。-20°Cで最大3ヶ月間保存してください。
      注意:メタノールは有毒で可燃性です。適切なPPEを装着して、フムフードで扱ってください。
    7. 50mLのチューブ内で49.95mLの超純水と50μLの蟻酸を混ぜて、水+0.1%の蟻酸溶液を準備します。ボルテックスウェル。室温(RT)で保存してください。
      注意:蟻酸は腐食性があります。手袋と目の保護具をつけて扱う。
  2. 一次細胞の解凍と洗浄
    1. 細胞サンプルを凍結保存するには、37°Cの蒸留水15mL入ったビーカーでバイアルを優しく回して完全に解凍します。
      注:細胞採取および凍結プロトコルに関する情報は、過去の出版物9,10に記載されています。
    2. バイアルの内容物を、滅菌使い捨てパスツールピペットで10〜15mLの滅菌1x PBSを含む50mL円錐形チューブに移します。300 × g の遠心分離機をRTで5分間加熱します。
    3. チューブを逆さにして上清液を捨てます。
    4. ペレットを使い捨てのパスツールピペットで10mLのAIM V培地に再懸浮させます。生存可能な細胞を数え、自動カウンターを使って平均細胞サイズを測定します。
      注意:採取した細胞数に対して生存率が少なくとも80%以上ある細胞を使用することが推奨されます。
    5. 測定された濃度に基づく単純な比率を用いて、2.5個×10個の6個の生存可能な細胞を採取するために必要な体積を計算します。例えば、濃度が5×106 cells/mLの場合、必要な体積は0.5 mLとなります。
      注意:データの再現性を確保するために、各処理は三重に行ってください。自動セルカウンターで提供される培地サイズを保存し、それを使ってセルの体積を計算してください。
  3. 薬物治療のセットアップ
    1. 最終濃度1μMに達するために必要なVCR作業液の体積を計算し、合計体積2.0mLです。ピペッティング前にストック溶液を渦巻きます。
    2. AIM V培地を加え、6細胞10個×2.5個を加え、最後にVCR溶液を2.0mLマイクロチューブに入れます。一時的にボルテックスし、軽く(5秒)回転させてチューブキャップから液体を集めます。
    3. 開いたチューブは37°C、CO25%で3時間培養します。
    4. 培養後、蓋を閉じて300 × g で5分間RTで遠心分離します。
    5. ピペットで上澄液を慎重に排出し、その後RTで1mLのPBSをチューブに追加します。
    6. 300 × g でRTで5分間遠心分離を繰り返し、上清液除去とPBS洗浄を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。
    7. ピペットですべての上清液を慎重に除去し、ペレットを100μLのPBSに再懸濁させ、ペレットが完全に再懸浮するまでボルテージします。
    8. 試料に直接400μLの冷メタンオール+0.1μMビンブラスチン(-20°C)を加え、チューブ壁との接触を避けます。
    9. サンプルは-80°Cで一晩保存します。
      注意:サンプルは数週間-80°Cで保存可能です(安全停止)。

2. LC-MS/MSのサンプル処理(第2日目)

  1. サンプル抽出
    1. -80°Cの冷凍庫からサンプルを取り除く前に遠心分離機を4°Cまで予冷します。
    2. 冷凍庫からサンプルを取り出したらすぐに、13,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
    3. 300μLの上清液を1.5mLのマイクロチューブに移します。
    4. 真空濃縮機で40〜45°Cで1時間40分、サンプルを完全に乾燥させます。
      注意:乾燥ペレットは-20°Cで数週間保存可能です(安全停止)。
    5. 各ペレットを400μLの水+0.1%の蟻酸(事前に調製)に再懸浮させます。ペレットが完全に溶けるまで優しく渦巻きます。
    6. サンプルを13,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
    7. 上清液300μLを2.0 mLのスクリュートップバイアルに移し、LC-MS/MS分析を行います。

3. LC-MS/MSのセットアップとデータ取得

  1. 移動相調製とカラム調整
    1. 溶媒Aは、超純水と0.1%の蟻酸を混ぜて調製します。
    2. アセトニトリルと0.1%の蟻酸を混ぜて溶媒Bを準備します。
      注意:アセトニトリルは有毒で可燃性です。化学換気フードの中のハンドル。
    3. 各溶媒を超音波浴で5分間超音波処理します。ボトルをポンプモジュールに接続し、高流量でシステムを浄化して汚染物質を除去します。
    4. 逆位相BEH C18カラム(1.7μm、2.1mm×50mm)を設置します。
      注:本研究では、分析を行うためにAcquity HクラスクロマトグラフィーシステムをXevo TQS-Micro三重四重極質量分析器と結合して使用しました。
    5. 溶媒AとBからなる二進勾配を用い、どちらも事前に準備済みです。
    6. 最初の2分間で溶媒Bの5%から95%までのクロマトグラフィー勾配を行い、その後2分間溶媒Aを用いてカラム洗浄と再平衡を行います。
    7. 4分間のランで流量を0.2 mL/minに設定してください。カラム温度を40°Cに保ち、各サンプルを10μL注入します。
  2. LC-MS/MS法のセットアップ
    1. LC-MS/MSソフトウェアを開きます。新しい方法を始めるには「 新しい>MSメソッド>ファイル 」をクリックしてください。
    2. 機能タブに行き、機能タイプを多重反応監視(MRM)に設定します。VCRおよびVINB(内部標準)のイオン遷移とパラメータを表1に入力します。
    3. 取得時間を4分に設定してください。「応募」をクリックして保存してください。
      注意:注射間でカラムの再平衡を確保するために4分を超えないようにしてください。
    4. UHPLCパラメータをInlet Method > Edit LC メソッドで設定し、.mthファイルとして保存します(表2)。
    5. 表3に従ってチューンタブでソースパラメータを設定してください。.tunファイルとして保存してください。
    6. 完全な保存方法: ファイル>「名前を付けて保存」、.mthファイル としてエクスポート してください。
  3. サンプルリストの作成とラン開始
    1. ソフトウェアのホーム画面で サンプルリスト を開き、サンプル名、注入体積、バイアル位置、使用する方法のリストを作成します。
    2. 超純水の入ったバイアルをオートサンプラートレイに入れ、それをブランクとして指定します。三重注射の間にはブランクを回して、持ち越しを防ぎましょう。
      注意:ラン開始前に、カラム圧力(ΔP)が安定し、10 psi未満であることを確認してください。
    3. サンプルリストから希望する行を選択し、「実行>OK」をクリックしてデータ収集を開始します。

4. データ分析

  1. データ可視化とエクスポート
    1. 実行終了後、サンプルを選択してメニュー上部のクロ マトグラム をクリックしてクロマトグラムを確認できます。
    2. ホーム画面で TargetLynxをクリックし、先ほど実行されたファイルを選択し、「Process >」をクリックします。「 Selected the vincristine method」>OKで出力表を生成してください。
    3. エクスポート テーブル>レポート をクリックし、処理済みデータを.csvまたは.xlsxファイルとして保存してください。
      注意:分析対象および内部標準体の生ピーク面積はエクスポートしてください。
  2. データの整理と比率計算
    1. エクスポートしたファイルを開いて、以下の列を作成します:
      1. サンプル:サンプルまたはバイアル名を追加してください。
      2. 実行:どのレプリケートに対応するかを示します。
      3. VCRエリア:ピーク下のエリアにビンクリスチンを入力してください。
      4. VINBエリア:ピークの下の面積をビンブラスチンに入力します。
      5. VCR/VINB比率:各VCRの値を対応するVINB値で割って正規化します。
    2. 各三重セットごとにVCR面積、VINB面積、VCR/VINB比率の標準偏差値の列を追加します。
      注意:内部標準を用いた正規化により、抽出量や注入量の変動を補正できます。
  3. プロット結果
    1. 希望するグラフソフトを開き、「 グループドテーブル 」形式を選択します。
    2. 「 入力 または新しいテーブルに インポート 」を選択し、 オプションの「並列のサブカラムで3つの複製値を 入力 」を選択します。
    3. 各サンプルの正規化されたVCR/VINB比率のみをプロットし、生の面積値は省略します。

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結果

VCRおよびVINBを併用した一次ALL PDX細胞を用いた細胞内蓄積アッセイ後に得られた代表的なクロマトグラフィー結果は 図1に示されています。サンプルは各条件ごとに2.5個×10個の6セルを用いて調製されました。記載されたクロマトグラフィー条件下では、VCRは2.85分で一貫してマトリックス効果を最小限に抑え、ピーク形状は対称的かつ良好に分解能が取れました。これらのプロファイルは、プロトコルが正しく実行された場合にVCRとVINBの期待されるクロマトグラフィー挙動を示しています。

このプロトコルを原発性白血病細胞に適用する前に、方法の線形性、検出限界(LOD)、最適細胞数、およびインキュベーション時間を決定するための予備アッセイが実施されました。これらの手順は本プロトコルには詳細記載されていませんが、校正曲線の代表的な結果を方法検証の一部として以下に示しています。

この手法の感度と線形性を評価するため、VCRのキャリブレーション曲線は2つの実...

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ディスカッション

原発白血病細胞における細胞内薬物レベルの正確な評価は、細胞レベルでの薬物取り扱いを理解し、分子プロファイリングを補完する機能的アッセイの開発を支援するために不可欠です。既存の分析手法は、多数の細胞を必要とし、長時間の処理ステップを含み、化学療法薬の細胞内利用可能な真の利用可能性を反映しない間接的な読み取りに依存することが多い5,6。これらの制約は、患者由来サンプルで細胞内薬物蓄積を直接定量化できる迅速かつ感度が高く、スケーラブルな方法の必要性を浮き彫りにしています。

本プロトコルは、原発小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞における細胞内VCRの相対定量をLC-MS/MSを用いるマイクロメソッドを記述しています。この方法は、細胞内薬物成分を直接かつ敏感に評価するために開発され、しばしば細胞の大量物質、半定量的検出戦略、間接代理マーカーに依存する従来の分析手法の限界に対応しています。少数の一次細胞内...

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

Centro Infantil Boldriniと、この研究のためにサンプルを寄付してくださったすべての患者様に感謝します。アドリエリ・C・ソアレスは、ブラジル・ニーベル・スーペリオール・ペソアル・アペルフェイソアメント(CAPES)およびサンパウロ研究財団(FAPESP、2023/18389-3)からフェローシップを受けました。ホセ・A・ユネスは、国家技術科学開発評議会(CNPq、308399/2021-2021-8)から生産性フェローシップを受けました。この研究は、ブラジル保健省のPRONONプログラム(Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica、NUP 25000.211174/2019-45)による研究資金の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2.0 mL ねじ蓋バイアルフローサプライ8-2400同社製のガラスインサート(5×29 mm)と組み合わせて使用(カタログ5-29015)
2.0 mL ねじ蓋バイアルフローサプライ8-2400同社製のガラスインサート(5×29 mm)と組み合わせて使用(カタログ5-29015)
アセトニトリルメルク(シグマ・オルドリッチ)100030
アセトニトリルメルク(シグマ・オルドリッチ)24010152
目標Vサーモフィッシャー・サイエンティフィック12055091
クロマトグラフィーシステム Acquity UPLC Hクラスウォーターズ社https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
伯爵夫人3 FLサーモフィッシャー・サイエンティフィックA49892
DMSOメルク(シグマ・オルドリッチ)D 8418
ファルコン 50 mLサーステット62.547.254
蟻酸メルク(シグマ・オルドリッチ)F0507
ガラス瓶メルク(シグマ・オルドリッチ)41121800
インキュベーターPHCBIMCO-50M-PE
メタノールメルク(シグマ・オルドリッチ)34860
マイクロチューブ 1.5 mLエッペンドルフ41121702
マイクロチューブ 2.0 mLエッペンドルフ30120094
PBSメルク(シグマ・オルドリッチ)PPB006
Speevac miVacフィッシャー・サイエンティフィック56340
データ取得用のソフトウェアウォーターズ社マスリンクス
三重クアドルーポール質量分析計 Xevo TQ-S microウォーターズ社https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
超音波超音波装置クイミスQ335D
ビンブラスチン 1 mg/mLリブスhttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/ビンブラスチン硫酸塩
ヴィンクリスチンケイマン・ケミカルズ11764

参考文献

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