本プロトコルは、ラットの新生児腕神経叢損傷を段階的に作成し、腕叢の出生性損傷研究のモデルとして使用する手順を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
腕神経叢の出生性損傷(BPBI)の研究は、臨床症状が異様で信頼できる動物モデルが限られているため、困難を伴っています。そのために、私たちは生後5日のスプラグ・ドーリーラットの子犬に対して、汎神経プレクサル新生児腕神経叢損傷を再現性に誘発する手術プロトコルを開発しました。この記事では、ラットの子犬の腕神経叢に近づくためのステップバイステップの手順を提供します。この技術は15匹のスプラグ・ドーリーラットの子に実施されました。手術顕微鏡下での背側アプローチを用いて、頭蓋骨の基部からC7-T1椎体遷移のレベルに向かって5mmの背側切開を行いました。鈍的解離は僧帽筋まで下に行い、その後、下の菱形筋と肩甲筋の提起筋を通って解離します。脊椎や肩甲骨などの解剖学的ランドマークを特定した後、肩甲骨の上角を優しく引き戻し、腕神経叢を可視化しました。腕神経叢は局所化し焼灼されており、上肢の皮けんが観察で示されました。神経再生を防ぐために、損傷した神経の近位端と遠位端の間に吸収可能なゼラチンスポンジの小さなブロックが置かれました。この手術は15匹すべてのラット子に対して成功裏に実施され、生存率は87%でした。術後および犠牲処置において、生存したすべてのラットは完全な全神経叢損傷を示し、このモデルが腕神経叢の出生性損傷研究において有効かつ再現性であることを裏付けました。
概要
腕神経叢の出生性損傷(BPBI)は、分娩時に発生する外傷性神経損傷です。肩難産、長時間陣痛、胎児マクロソミアなどにより複雑な分娩中の牽引力が、影響を受けた腕に筋力低下や麻痺を引き起こします。発生率は出生1,000人あたり1〜2人、2,3,4人です。ほとんどの赤ちゃんは完全な機能を回復しますが、成人に入っても機能制限、四肢の長さの不均一、変形、関節攣縮などの症状が残ります(5,6,7,8)。
BPBIモデルは異なる損傷パターンを示し、治療や予後に示唆を与えます。上部神経叢損傷(C5-C6、エルブ麻痺)が最も一般的で、主に剥離ではなく破裂を伴う9。対照的に、全神経叢損傷(C5-T1)は頭蓋根破裂と尾部剥離の混合パターンを示すことが多い10。脱脱とは、背根神経節を破壊し自然回復能力を持たない節前損傷のことです。
現在の臨床管理戦略は、損傷の重症度に応じて保存的理学療法から早期の微小外科神経再建まで多岐にわたります12,13。患者は運動機能、生活の質、二次的な筋骨格系後遺症の改善のために、軟部組織の解放、腱移植、骨切開などの二次手術を必要とすることが多いです。しかし、これらの早期介入と後期介入の効果は14、15、16にばらつきがあります。さらに、変わった筋骨格系の発達は機能的制限、四肢の長さ不均等、その他の変形を引き起こしており、現在治療が不可能なため、さらなる研究の必要性が浮き彫りになっています(17,18)。したがって、これらの損傷を調査するためには、信頼性が高く実現可能かつ再現性のある動物モデルが依然として重要です。
齧歯類モデルは腕神経叢損傷モデルで一般的に使用されており、コスト効率と取り扱いの容易さからマウスが最も一般的です。しかし、再現可能な新生児腕神経叢損傷の作り方は、その小ささゆえに解剖学的に難しい場合があります。ウサギ、豚、霊長類などの大型動物モデルはモデル作成にいくつかの利点がありますが、コストはかなり高くなります。一方、ラットはマウスよりも大きく、人間に遺伝的にも似ており、大型動物モデルよりもはるかにコスト効率が高く、利用しやすいです。したがって、BPBIを研究するために実現可能かつ再現可能な動物の必要性は依然として存在します。本研究は、新生児ラットにおける段階的な汎-プレクサルBPBI創製モデルを説明し、損傷メカニズム、治療介入、短期および長期後遺症の研究に利用できます。
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プロトコル
すべての動物処置は、施設動物ケア・利用委員会(IACUC A0007335)の承認を得て実施されました。この技術は、15匹のスプラグ・ドーリーラットの子ラットを対象に実施され、実現可能性と長期的な機能的転帰を評価するために行われました。
1. 畜産
- 妊娠週数:14日の多産妊娠スプラグドーリーラットを、セルロース紙ベースの寝床(巣材やケージの装飾で豊富に)を設置したブリーダーボックス(1354 cm²)に収容します。室温は21°C、相対湿度は28%に保ち、12時間12分の明暗サイクルを行ってください。ラットの食事と水を 自由に提供してください。
- 週に一度ケージを掃除すること;子犬が出産された後、ケージを48時間は手つかずのままにしておきましょう。慣れを促進しストレスを軽減するために、優しい扱いや話し言葉を通じて聴覚的な安心感を与えましょう。妊娠後期には、毎日優しい扱いと嗅覚調整を行い、エタノールやベタジンの香りの綿球をダムのケージに入れて、調査者に慣れさせてください。
- 子犬が出産した後は、48時間ダムを乱さずケージを開けずにおやつをケージに入れます。
2. 材料の準備
- 手術前に必要なすべての手術器具を準備しておくこと(材料 表を参照)。すべての外科用具は121°Cの蒸気オートクレーブで1時間滅菌します。
- 膨張した発泡スチロールで手術用ベッドを作りましょう。(図1)
3. 手術準備
- 生後5日のラットの子ラットに手術を行います[3日から9日の範囲]。
- ラットを誘導チャンバーに2%イソフルランを酸素2L/minで投与し、中〜深麻酔段階に達するまで誘導します。鉗子を使って足の指を優しくつまんで十分な麻酔を確認しましょう。ラットの子を予温された温めた温熱パッドの上に置きます。酸素に1.5〜2%のイソフルランを投与し、呼吸数を継続的にモニタリングしてください。
- 子犬の体重に基づいて適切な鎮痛剤の用量を決めてください。痛みの管理のためにブプレノルフィン徐放性(1 mg/kg)を投与します。
- ベタジンとエタノールを交互に3回塗布して無菌手術部位を準備します。
- 麻酔を受けた子犬をあらかじめ用意された手術用ベッドにうつ伏せに置き、鼻と口をイソフルランのヴェポライザー鼻錐にしっかりと収めます(図1B)。
- 操作中の動きを最小限に抑えるために、ラットの頭をイソフルラン・ヴェポライザーにテープで固定し、上肢のすぐ下の下半身をホイルで覆います。
4. 腕神経叢への外科的アプローチ
- No.11ブレードを使って、頭蓋骨の基部から始まり、尾方方向にC7-T1椎体遷移部まで5mmの皮膚切開を行います(図1C)。
- 皮膚の縁を避けつつ、浅い動脈を慎重に焼灼してください。
- 僧帽筋に到達するまで鈍的解離を行います。
- 寺院筋およびその下の菱形筋と提肩甲骨筋を焼灼術で解離します。皮膚の縁に熱損傷を避けるために、焼灼鉗子を組織に対して垂直に置いてください。
- 肩甲骨の上角を優しく引っ込めて腕神経叢を露出させます。鈍的解離によって腕神経叢を特定し、分離します(図1D および 図2A)。
- 両極電気灼熱を15に設定して腕神経叢の特定神経を焼灼し、上肢の筋肉のけいれんを観察して損傷の成功を確認します。
- 神経再生を防ぐために、吸収性ゼラチンスポンジの小片(約2mm×2mm)を腕神経叢の近位節と遠位節の間に置きます(図2B)。
- 7-0吸収性縫合糸で皮膚を連続縫合パターンで閉じ、傷口の裂開を防ぐために獣医用組織接着剤を塗布します(図3)。
5. 術後管理
- ネズミの子を、ネズミダムのケージの巣材で温めたパッドの上に置きます(図4)。ラットの子犬の呼吸数と動きを観察し、正常な呼吸パターンに戻るまで続けてください。
- 母猫の拒絶を防ぐために、子ネズミを巣用の巣材で優しくこすりつけてから、再びダムに戻してください。
- 手術後最初の48時間は、1日3回ラットの子を検査してください。痛みや乳斑の欠如が確認された場合は、補助鎮痛剤(ブプレノルフィン 0.05 mg/kg)を投与します。
- 術後の合併症、創傷の裂開、創傷感染、四肢感覚の低下(自傷の可能性)、母体のカニバリズムなどを注意深く監視してください。
- 毎日ラットの子犬の体重を測ってください。ラットの子が2日間体重減少または体重増加が見られない場合は、それは繁殖不良とみなし、ペントバルビタール(390 mg/mL)腹腔内注射による安楽死を進めてください。
- 手術後1日以内に運動機能を評価し、週に一度四肢運動スケールを用いてフォローアップします:0=機能不全、1=部分機能、2=正常対称機能。
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結果
手術技術の効果は、影響を受けた肢の可動性の欠如、拘縮の有無、可動域の低下、そして犠牲時の筋萎縮、四肢の短縮、形態的な骨や筋肉の違いの程度から評価できます。本研究には合計15匹のラットの子が含まれました。生存期間中、2匹のラットの子は体重増加不良により術後に繁栄できませんでした。生存した13匹のうち2匹で自傷行為が観察されました。感染症、血腫、母体からの共食いなどの術後合併症は認められませんでした。
術後最初の2週間は毎日、術後は週ごとに運動機能が評価され、先に20で記述されたスコアリングシステムを用いて行われました。簡単に言えば、四肢の動きの欠如は0、部分的な動きは1、正常な対称運動は2と評価されました。含まれたすべての子犬はパンプレクサル損傷を示し、運動量表で0点でした (表1)。16週の終点に生贄に行われたすべてのラットの子ラットで、脱神経化肢の筋萎縮が観察されました(図5
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ディスカッション
このプロトコルは、新生児ラットにおける腕神経叢損傷の発症を詳細に扱い、BPBIの短期および長期的転帰の研究を行い、治療選択肢を探り、後遺症を理解します。
腕神経叢損傷の研究に非侵襲的な齧歯類モデルを用いることは以前に記述されていますが、しかし、これらのモデルは特定の神経損傷を再現するために特化されたものではありません。出生後の5日目のラットの子に注目することで、このモデルはBPBIが発生する段階を密接に模倣しています。新生児神経損傷が筋骨格系の発達に与える長期的な影響を調査する独自の機会を提供します。
過度な外傷なしに腕神経叢の正確な外科的曝露を行うことが、変動を最小限に抑えるために重要です。焼灼術を用いて新生児腕神経叢損傷を作ることで、一貫した全神経叢損傷が保証され、動物間の変動を大幅に減らします。一方、機械的な力を利用して損傷を誘発する牽引...
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開示事項
著者には利益相反を主張するものはありません。
謝辞
ラットの子犬およびラットダムの取り扱い、術前期および術後のケアに関して専門的な指導をしてくださったフェリシア・ボイントン博士およびクリス・ゴウ医師に感謝申し上げます。これらの助言は本プロトコルの最適化に大きく貢献しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 ルアーロク チップ | BD | 309628 | |
| 7-0 コーティングされたヴィクリル(ポリグラクチン910) | エティコン | J576G | |
| 70%イソプロピルアルコール | ベテラン・ワン | 13985-598-01 | |
| 吸収性ゼラチンスポンジ | サージフォーム | ETH1972 | |
| ベタジン溶液 5% ポビドン-ヨウ素抗菌抗菌剤 | PBS動物保健 | 11205 | |
| 巣材 | ベッド・ア・ネスト | BRN8SR | |
| 双極性索 | ASSI | アッシー。ATK26426 | |
| ブプレノルフィン(塩基0.5 mg/mL)徐放性 | ウェッジウッド・コネクション | 49426-0517-1 | |
| ケージのリッチメント | ツイスト・ン・リッチ | 10003949 | |
| セルロースベースの寝具 | アルファ・ドリ | NC2193839 | |
| 膨張発泡スチロール(発泡スチロール) | フィッシャー | 22-130-407 | |
| フリーアースキンフック | より自由 | MI2152 | |
| ギリーズ・スキンフック セミシャープ | DTR | GHB2001 | |
| イソフルラン自動流麻酔装置 | E-Zシステムズ | EZ-190F | |
| イソフルラン、USP | パターソン獣医 | 1403-704-06 | |
| ジュエラーズ バイポーラ・ピンセット ノンスティック、11cm、直線尖り、0.25mm、チップ直径 | ASSI | アッシー。BPNS11223 | |
| マイクロハサミ ベヨネットスタイル | ASSI | アッシー。SNS21 | |
| 顕微鏡(外科用) | ライカ | M525 F40 | |
| 顕微外科用デュモン #4 鉗子 デュモン・スイス製 1708-4TM-PO | アンブラー外科 | 31-906 | |
| 顕微外科用針ホルダー | ASSI | B-14-8 | |
| ノーズコーン、9mm、マウス、長さ2cm | VetEquip | 921609 | |
| ペントバルビタール安楽死バイアル(390 mg/mL)250 mL | 致命的なボーナス | 9373 | |
| プラスチック製のフードラップホイル | Press 'n Seal | Press'n-70-1-no3 | |
| 使い捨て針、30 G | BD | 14-821-13A | |
| 小動物用加熱手術台(調整可能) | ペコ・サービス株式会社およびnbsp; | 69023 | |
| ステンレス製ブレード番号11 | バード・パーカー | 371211 | |
| 滅菌タオルのドレープ | ダイナレックス社 | 4410 | |
| 組織接着剤 | ヴェットボンド3M | NC9259532 | |
| 木製綿棒とアプリケーター | フィッシャー | 22-363-157 |
参考文献
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