CRISPR/Cas9を媒介した ent2*/CyOショウジョウバエメラノガスター 株の生成と特徴付け

サマリー

平衡ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)は、ヌクレオシド輸送および細胞代謝に関与する保存された膜貫通タンパク質です。本研究では、ショ ウジョウバエメ ラノガスターにおいてEnt2標的アレルを生成するためにCRISPR/Cas9ベースのゲノム編集ワークフローが確立されました。安定した Ent2*/CyO ヘテロ接合系系統はバランサー染色体戦略を用いて構築・維持されました。本研究では、変異体系統の設計、生成、分子検証、ならびに異なる温度条件下での表現型の特徴付けを記述しています。確立されたワークフローと変異株は、ホモ接合致死表現型を持つ遺伝子の研究やショ ウジョウバエにおける温度関連表現型変異の調査のための実践的な枠組みを提供します。

要約

本研究では、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集手法を用いて、ショウジョウバエメラノガスターの平衡性ヌクレオシドトランスポーター2(Ent2)遺伝子の変異を導入しました。Ent2のコード領域を標的としたガイドRNAを設計し、Cas9 mRNAと共注射してw¹¹¹⁸胚に導入しました。突然変異アレルはサンガー配列決定により同定され、バランス染色体を用いて安定したEnt2*/CyOヘテロ接合系統として維持されました。その後、22°Cおよび25°Cのショウジョウバエにおいて、体重、登攀能力、生存率、および超酸化物ジムターゼ(SOD)およびカタラーゼ(CAT)の活性をそれぞれ評価しました。結果は、22°Cおよび25°Cの両方で、Ent2*/CyOショウジョウバエの体長と体重がw¹¹¹⁸に比べて著しく減少し、発達が遅れていることを示しています。22°Cでは、Ent2*/CyOのバエの全寿命はw¹¹¹⁸よりやや長かったのに対し、25°Cでは有意な違いは観察されませんでした。運動能力に関しては、ヘテロ接合バエの登攀性能は両温度でw¹¹¹⁸よりも有意に劣っており、オスの方がより深刻な影響を受けました。さらに、Ent2*/CyOショウバエにおけるCATおよびSODの抗酸化酵素活性が有意に低下し、抗酸化能力の明確な低下を示しました。これらの結果は、CRISPRで生成されたEnt2変異体系統の表現型プロファイルを示し、ショウジョウバエにおけるゲノム編集とバランサー染色体戦略の組み合わせの実現可能性を示しています。本研究は、代謝や環境応答に関連する遺伝子の将来の研究のための方法論的枠組みと遺伝的資源を提供します。

概要

ショウジョウバエ・メラノガスターは遺伝学および発生生物学で最も広く使われているモデル生物の一つであり続け^{ています。}短いライフサイクル、急速な繁殖、確立された遺伝子操作ツール、そして完全に注釈されたゲノム^2,3が特徴です。この種は遺伝子機能、代謝調節、環境適応性の研究に広く応用されています ^4,5。ヌクレオシドおよびATPなどの誘導体はショウジョウバエにおける細胞エネルギー生成、核酸合成、シグナル伝達の中心であり、多生動物間で保存された代謝調節を反映しています⁶。ショウジョウバエにおけるピリネ作動性シグナル伝達経路は、細胞外アデノシンおよびヌクレオシド輸送機構に依存しており、膜を越えたヌクレオシド移動がエネルギーとシグナル伝達応答の調整に機能的に果たすことを強調し^{ています。}これらの過程の中で、細胞質膜を越えたヌクレオシドの輸送は主に平衡ヌクレオシドトランスポーター(ENTファミリー)によって媒介されており、DmENT2はショウジョウバエ⁸で機能的な輸送活動を示します。

ENTファミリーは複数のサブタイプから成り立ち、その中でもENT2は広く研究されている膜貫通ヌクレオシドトランスポ^ーター9です。これは様々なプリンおよびピリミジンヌクレオシドのエネルギーに依存しない膜貫通輸送を促進します^10,11。哺乳類において、ENT2はプリンおよびピリミジンのヌクレオシドおよびヌクレオ塩基の細胞取り込みを促進する、遍在する双方向トランスポーターです。この輸送活動はヌクレオチドの回収に寄与し、細胞の代謝恒常性維持を助けます¹²。ENT2はまた、さまざまなヌクレオシド由来薬剤の輸送を媒介し、その機能的関連性を内因性ヌクレオシド移動を超えて拡大し、その広範な生理学的および臨床的重要性を強調しています¹³。さらに、ENT2はヒトにおける神経障害¹⁴、腫瘍代謝¹⁵、血管機能障害¹⁶、細胞エネルギー代謝¹⁷に関与しています。しかし、ショウジョウバエにおけるEnt2の生物レベルでの役割に関する研究は依然として限られています。

ENT2が成長と発達、エネルギー代謝、運動能力、異なる温度条件下での抗酸化能力に果たす役割はまだ十分に解明^{されていません。}温度はショウジョウバエの基礎代謝率と寿命に大きく影響し、育成温度が高いと一般的に代謝活動が増加し寿命が短くなります¹⁹。これらの温度依存的な遺伝子発現の変化は生理学的経路に影響を与え、特定の遺伝子変異の表現型効果を変化させる可能性があります²⁰。

クラスター規則間間短回文リピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)は、ショウジョウバエにおいて、部位特異的なノックアウト、欠失、置換、タグ導入など様々なゲノム修飾操作に広く応用されており、その効率性と信頼性が示されています 21,22,23。最新の進展では、CRISPR由来の塩基エディタはショウジョウバエのより細かいサイト特異的塩基修飾にも利用可能であり、点変異や正確な表現^{型制御のための}新しいツールを提供することが示されています。化学的・放射線変異誘発やトランスポゾン媒介スクリーニングを含む従来の変異誘発法は、遺伝的変異を引き起こすことがあります²⁵。これらの手法は、変異イベントの効率が低くランダム性が高いため、しばしば制限されます。そのため、研究者^{は特定の関心}のある対立遺伝子を単離するために多数の個体をスクリーニングする必要があります。CRISPR/Cas9は、指定されたDNA配列でプログラムされたガイドRNA(gRNA)指向の切断を可能にします。その結果生じた二本鎖切断は非相同末端結合や相同指向修復によって修復され、明確で遺伝可能な突然変異を生じ、表現型解析を混乱させる可能性のある背景変異を著しく減少させます^27,28。CRISPR/Cas9によって生成された変異対立遺伝子は、Curly O (CyO)²⁹のようなバランサー染色体との連結によってヘテロ接合状態を維持できます。この戦略はショウジョウバエ遺伝学におけるホモ接合型の致死的対立遺伝子の喪失を効果的に防ぐことが示されています。その結果、さまざまな温度や環境条件下での機能的研究を含む、長期的かつ体系的な表現型評価を支えています^29,30。CRISPR/Cas9の単純な設計と高効率は、ストレイン構築サイクルを大幅に短縮し、遺伝的背景の安定性を高めました。これは、温度反応や発生恒常性といった長期的な環境要因の研究において特に重要です。

この基盤の上に、ショウジョウバエのEnt2遺伝子はCRISPR/Cas9システムでノックアウトされ、安定的に遺伝するEnt2*/CyOヘテロ接合型変異株が確立されました。抗酸化酵素SODおよびCATの発生サイクル、体重、運動能力、活性を体系的に評価しました。^w1118の多次元表現型と変異型バエを異なる温度条件下で比較することで、本研究はCRISPR由来の変異株系統の生成と維持のための再現性のある戦略を提示し、得られる表現型の記述的特徴付けを提供することを目指します。この研究は、代謝や環境応答に関与する遺伝子を調査する将来の研究において、方法論的枠組みと有用な遺伝的資源を提供します。

プロトコル

1. Ent2遺伝子のCRISPR/Cas9ターゲットの設計

1. CHOPCHOP (v3)³¹およびCCTop (v1.0)³²を用いて、Ent2のエクソン2および5(FlyBase ID: FBgn0263916)の候補CRISPR部位を選択します。
2. 参照ゲノムはショ ウジョウバエ メラノガスター リリース6(dm6)(RefSeq集合登録:GCF_000001215.4)と定義されました。その後、候補のgRNA部位が同定されました。最後に、特定部位をフィルタリングし、最適なgRNAを得ました。
3. MIT特異性スコア≥80(CHOPCHOP)、CFDスコア≤0.1(CCTop)、GC含有量40%–60%、最小PAM距離でターゲットを絞ります。
4. 加重スコア(効率50%、特異度30%、GC最適化20%)でターゲットをランク付けし、2つのgRNAを選択します。
5. T7プロモーター要件を満たすために、各gRNAの5′末端に1つの「G」を追加します。以下のgRNA特異的前方オリゴヌクレオチドを用いて、PCRによる全長sgRNA転写テンプレートを生成します。
   Ent2-sg1-F:TAATACGACTCACTAT(舌の先端)
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGGTTTAGAGCTAGAAAATAGC
6. 残りのsgRNAスキャフォールド配列は、PCR中にユニバーサルリバースオリゴヌクレオチドによって提供されます。

2. sgRNA転写テンプレートの準備

1. sgRNA転写テンプレートの調製
   1. 製造元の指示に従い、二重オリゴヌクレオチド焼きまし-PCR法³³を用いて60μLのPCR反応混合物を組み立てます。gRNA特異的前方オリゴヌクレオチド(Ent2-sg1-FまたはEnt2-sg2-F)と、sgRNAスキャフォールドをコードする普遍的な逆オリゴヌクレオチドを組み合わせることで、in vitro転写用の全長dsDNAテンプレートが得られます。
   2. サーモサイクラーのプログラム:95°C 3分;95°Cで30秒、55°C30秒、72°C20秒の35サイクル;その後72°C10分、12°Cで維持。
2. 転写テンプレートを精製する
   1. 60μLのPCR製品に100μLのアセテートアンモニウム(材料 表参照)を加えます。混合。400μLの無水エタノールを加えます。逆まくして混合し、-20°Cで20分間培養します。
   2. 遠心分離機は4°C、20,000 x g で15分間使用;上清液を捨てる。
   3. チューブを開けたまま10分間自然乾燥させます。ペレットをヌクレアーゼフリーのddH₂O10μLに再懸濁させます。
3. in vitro gRNAの転写
   1. キットの指示に従って10μLのT7体外転写反応を設定しました( 材料表参照)。
   2. 37°Cで35分間インキュベートします。転写キットに付属のDNase Iを0.5 μL加え、37°Cで15分間インキュベートします。
4. gRNAを精製する
   1. 転写混合物をヌクレアーゼフリーのddH₂Oで60μLに希釈します。60μLの水分飽和フェノール/クロロホルムを加えます(材料表参照);一時的に渦を巻き、4°C、16,000 x g で5分間遠心分離機を使いました。
   2. 水相45μLを新しい1.5 mLのRNaseフリーチューブに移します。酢酸ナトリウム5μLを加えます。ミックス。
   3. 125μLの予備冷却無水エタノールを加えます。混合して-20°Cで20〜30分間培養します。遠心分離機は4°C、20,000 x g で15分間使用;上清液を捨てる。
   4. ペレットを70%エタノール(RNaseフリー)200μLで洗浄します。遠心分離機は4°C、20,000 x g で5分間使用;上澄液を除去してください。
   5. ペレットを37°Cで乾燥させ、エタノールが完全に蒸発するまで続けます。20 μL ddH₂Oで再懸濁;分割して-80°Cで保存します。
   6. ナノドロップ分光光度計でgRNA濃度を測定し、注入のために濃度を250 ng/μLに調整します。A260/A280比率を約2.0でgRNAの純度を確保してください。
      注:RNase保護のために、プロセス全体を通じて手袋を着用することを強調しています。事前冷却されたRNaseフリー遠心分離管やピペットチップを含むすべての消耗品は、手順中は一貫して使用しなければなりません。操業中に発生した有機試薬廃棄物は、種類に応じた指定された廃棄物容器に別々に回収され、適切に取り扱うために認定された有害廃棄物処理施設に定期的に輸送されなければなりません。

3. Cas9 mRNAの調製

1. 転写テンプレートの作成
   注: RNA関連の手順ではRNaseフリーのチップとチューブを使用してください。
   1. Cas9発現プラスミドMLM3613(材料 表参照)を氷上で解凍します。RNaseフリーチューブ内で、20μgプラスミドDNA、7.5μL10倍制限バッファー、1μL PmeI(10,000 U/mL)、ヌクレアーゼフリーddH₂Oを75μLに組み合わせます。
   2. 37°Cで30分間孵育します。1%アガロースゲルに5μLを120Vで30分間投与して完全な線形化を確認します。
2. 転写テンプレートの精製
   1. 70μLの消化液に23μLの2%硫酸ナトリウムドデシル(SDS、詳細は 材料表 を参照)と0.5μLのプロテイナーゼK(詳細は 材料表 を参照)を加えます。50°Cで30分間培養します。
   2. クロロホルム45 μLとトリス飽和フェノール45 μLを加えます。ボルテックスは一時的に現れます。遠心分離機13,800× g、5分。
   3. 90μLの水相を新しいチューブに移します。キットから提供された酢酸ナトリウム10μLと予冷却無水エタノール200μLを加えます。ミックス;−20°Cで30分間培養します。
   4. 遠心分離機20,000 x g、4°C、15分;上清液を捨てる。ペレットを100μLの70%エタノールで2回洗います。遠心分離機 20,000 x g、各2分;自然乾燥。
   5. DNAを20μLのヌクレアーゼフリーddH₂Oに溶解させる。>500 ng/μLを確認してください。
3. 共キャッピングを用いたin vitro転写
   1. 製造元の指示に従い、T7のin vitro転写キット(材料 表参照)を用いて反応をセットアップします。
   2. 37°Cで2時間インキュベーションしてキャップされたCas9 mRNAを生成します。
   3. 転写反応が完了した後、キットに付属のDNase1 μL(濃度2 U/μL)を加え、十分に混合し、37°Cで15分間培養してDNAテンプレートを分解します。
4. ポリ(A)の尾を追加してください
   1. RNAを14 μL ddH₂Oに到達させます。
   2. 2 μL 10x 大腸菌 ポリ(A)ポリメラーゼバッファー、2 μL ATP(10 mM)、1 μL RNase阻害剤、1 μL ポリ(A)ポリメラーゼを追加します。
   3. 37°Cで45分間培養します。
5. mRNAを精製する
   1. 反応をスピンカラム全RNAキットに適用します(材料表参照)。サンプルを2 mLのシリカ膜スピンカラムに積み込みます。遠心分離機8,000 x g、15秒;破棄フロースルー。
   2. RNeasyカラムにRPEバッファー500μLを加え、8000 x g で遠心分離機で15秒間、残留液体を廃棄します。この工程を一度繰り返し、その後2分間遠心分離機で残った液体を捨てます。
   3. RNeasyカラムを新しい1.5 mL遠心分離機チューブに入れます。RNaseフリーのddH₂Oを30μL加え、8000 x g で1分間遠心分離してRNAを溶出します。mRNA濃度を注射用に500 ng/μLに調整します。溶出したRNAは-80°Cで保存します。

4. ショウジョウバエ 胚のマイクロ注射

1. 注入試料の準備
   1. 15 μgのCas9 mRNAと7.5 μgの二本鎖gRNAを体積比2:1で混合します。
   2. DEPC処理済みRNaseフリー水で30μLに調整;氷をつけておけ。
2. ショウジョウバエ の育成
   1. 注入した ショウジョウバエ 株を大きな栄養^管に移 して増幅します。^W1118 のフライは、バランサー関連の影響なしの基準生理状態を表す基準対照群として用いられました。
   2. ハエは人工気候室で14日間、湿度60%〜70%、明暗サイクル12:12で維持します。
   3. 14日間の育児期間の翌日(15日目)の17:00に、成虫のハエを集めて、タイミングを合わせて胚の産卵を同期させます。この特定の採取期間により、注射に使用される胚は一貫した発生段階にあります。時間帯の管理は、胚の発生や生殖行動に対する概日リズムの影響を最小限に抑え、実験的な再現性を確保し、バッチ間の生理学的変動を減らすために重要です。
3. ショウジョウバエのマイクロインジェクション
   1. 成虫のハエを採取し、約400羽の成虫をハエケージに注入します。酵母被覆寒天プレートで胚を採取し、卵を産んでから60分以内に胚を採取し、カバースリップにすすいでください。注射前に脱胆毛は行われませんでした。
   2. 胚をカバースリップに並べ、後部の極を外側に向けて、上から下へ整然と配置します。注射針が胚の長さの約5分の1の深さまで後極に貫通し、安定した細胞質送達を行ってください。本研究では合計300個の胚が使用されました。
   3. 立体顕微鏡の下で、針先と胚を同じ平面に焦点を合わせます。
   4. 注射器具を使い、後極を貫通し、各胚に0.001μLの混合物を注入します。
   5. 注射された胚を栄養バイアルに移植する;25°C、~70%の相対湿度(RH)で培養し、P₀生成(注入された成体で子孫を残します)。

5. ショウジョウバエにおける安定発現株の構築

1. P₀を Bc/CyO フライと交差して閉じます。
   1. 目的の遺伝子を標的としたgRNAとCas9タンパク質の混合物を 、w1118ショウジョウバエ 株の300個の胚にマイクロインジェインします。注射後、合計30個の生存可能で受胎可能なP0成体を得ます。各P0成虫(モザイク)を w1118 系統のハエと個別交配すると、16匹の単一対交配が得られます(P0オスを処女メスと交配した8バイアル、P0メスとオスを交配した8バイアル)。すべての交配種は、常に培養条件下で25°Cに保ちます。
   2. F1幼虫が出現した後、P0親バエを除去します。F1の子孫からゲノムDNAを抽出し、PCR解析でF1成体遺伝子型(Ent2/+)を特定します。
   3. BcとCyOのバエ同士の単一交配でF2子孫を生成します。個々のF2成虫を選び、Ent2/CyO遺伝子型を持つハエを同定するために遺伝子型を測定します。
   4. Intercross F3(Ent2/CyO)はホモ接合変異体の存在を評価するために飛んでいます。ホモ接合バエが回収されない場合は、 Ent2/CyO の交配をさらに一世代行い、ホモ接合型が致死的かどうかをさらに判断します。
2. ショウジョウバエ ゲノムDNA抽出
   1. 成虫のハエを1.5mLのEPチューブに1匹または2匹採取し、110μLの植物DNA抽出バッファーPAを加えます。
   2. ティッシュグラインダーで少なくとも3分間、サンプルを徹底的に均質化します。
   3. 均質菌は65°Cの金属浴で少なくとも30分間培養します。
   4. クロロホルム100μLを加え、混合物を優しく逆さまに混ぜ、10秒間渦を巻きます。サンプルを室温で14,000回転で10分間遠心分離します。
   5. 約65μL以上の上澄液を慎重に新しいチューブに移し、4°Cで少なくとも10分間プレカキュベートした絶対エタノールを2巻追加し、そっと逆に混ぜ、-20°Cで少なくとも15分間培養します。
   6. 遠心分離機で14,000rpmで4°Cで10分間サンプルを取り、上澄液を慎重に廃棄します。
   7. DNAペレットは室温またはインキュベーターで完全に乾燥するまで自然乾燥させ、その後適切な量のPBバッファーに再懸浮させます。女性(f)サンプルにはPBバッファーを50μL、男性(m)サンプルには15μLを追加します。
3. PCR増幅とサンガーシーケンス
   1. gRNAターゲット部位の上流および下流領域を側面に配置する特定のプライマーを用いてPCR増幅を行います。
   2. PCR産物を精製し、サンガーシーケンスにかけます。SnapGeneソフトウェア³⁴ を使用してシーケンスクロマトグラムを解析し、比較解析のために野生型参照配列と整合させます。
   3. gRNAターゲット部位近くのピークプロットで、インデル変異を示す重なり合うピークを調べます。ピークスプリッティングを行い、混合シグナルを解消し、標的部位での挿入や欠失を含む変異の種類を確認します。
   4. Ent2/CyOの雄と4世代にわたって交配し、Ent2/CyOを確立しました。
      注:Ent2*/Ent2*およびCyO/CyOは早期発達段階で致死的であることが観察されています。したがって、Ent2*/CyOヘテロ接合体は維持されます。
4. Ent2*/CyOヘテロ接合体を確立した後、同じバッチのEnt2*/Cyヘテロ接合体から立体顕微鏡でサンプルを採取します。
5. 成虫を20羽ランダムに選び、0.001gの精度測定器で計量します。表現型の特徴を記録するためにサンプルを写真に収めてください。

6. 記述的表現型の特徴付け

1. 後方にはEnt2*/CyOを22°Cと25°Cで、各グループに3バイアルずつ検査し、各グループに20匹のハエを含んでいました。
2. 毎週死亡者数を記録し、生存曲線をプロットしましょう。
3. グループごとに30組のランダムな交尾ペアを設置します。24時間の交尾を許可し、
4. 成虫は新しいチューブに移す。後継子です。
5. エクロージョン後7日目に、各グループに6回の重複で登攀成功(≥30秒以内に8cm)を評価します。
6. すべての観察は変異体系統の記述的特徴として記録され、遺伝子機能の推定には用いられませんでした。

7. 抗酸化酵素活性の測定

1. 雄300匹と雌300羽の成虫(各群3バイアルを試験し、各バイアルに100匹のハエを含む)を採取し、排出後5日でEnt2*/CyOおよびw¹¹¹⁸の対照バエを採取し、生理的成熟と同等の年齢を確保します。
2. 移送は空のチューブに餌なしで飛んでしまい、代謝状態を標準化して生化学的アッセイに移行します。
3. スチールビーズ/チューブを1つ追加します。60Hzで均質化、2分。
4. 遠心分離機 4°C、161 x g、10分;上清液を採取しろ。
5. キットの説明に従って、全スーパーオキシドディスミューターゼ(SOD、詳細は 材料表 を参照)およびカタラーゼ(CAT、詳細は 材料表 を参照)を測定してください。

8. データ統計と分析

1. すべてのデータを平均±標準誤差( ±SEM)として表現します。
2. 一方変量ANOVAを用いて酵素活性データを比較し、体重、登攀能力、体長の三因子ANOVA(遺伝子型、温度、性別)を適用します。^{適切な場合}、TukeyのHSDポストホック検査を実施してください。
3. すべての統計検定において有意性をP<0.05と定義します。
4. 生存曲線を用いて寿命データを解析し、実験コホート間の生存軌跡に有意な差があるかどうかを評価する対数ランク検定(Mantel-Cox)を行う³⁶。
5. すべての解析およびプロットは、GraphPad Prism 9.5.0ソフトウェアで、ソフトウェアガイドライン³⁷に従って実施してください。
6. すべての統計解析は記述的比較のみを目的としており、因果関係の確立は目的ではありません。

結果

Ent2遺伝子標的部位の設計および有効性検証解析
Ent2遺伝子の候補標的部位はCHOPCHOPおよびCCTopプラットフォームを用いて設計されました(図1)。特異性および効率基準に基づき、エクソン2およびエクソン5領域を標的とした2つのgRNAが選定されました。ゲノム編集の成功を検証するために、確立されたEnt2*/CyO系統の無作為に選ばれた個体のゲノムDNAを増幅し、サンガーシーケンスにかけました。シーケンシングクロマトグラムでは、標的部位付近から重なり合うピークが見られ、挿入/欠失(indel)変異と一致しました。さらなる配列解析により、フレームシフト変異が早期停止コドンを引き起こすことが明らかになりました(図2)。これらの結果は、CRISPR/Cas9システムが標的となったEnt2遺伝子座での変異を成功裏に導入し、ゲノム編集ワークフローの実現可能性を示したことを裏付けています。

図1. Ent2遺伝子のノックアウト部位の概略図とゲノム内の検出プライマーの位置。この概略図はEnt2遺伝子座のゲノム構造を示しており、CDS(緑)、開始・終了コドン(赤)、gRNA PAMモチーフ(灰色)、gRNAターゲット配列(青)、gRNA増幅プライマー配列(黄色)を強調表示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2。安定系統自家近配Ent2*/CyOのショウジョウバエ子孫のシーケンス結果のピークプロット。安定したEnt2*/CyOヘテロ接合系を自己交配して得られた子孫の遺伝子型を確認するシーケンシングクロマトグラム。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Ent2/CyO系統の記述的形態学的観察
22°Cおよび25°Cの条件下で、2つのショウジョウバエの遺伝子型間の体形の違いを立体顕微鏡を用いて観察しました(図3)。両方の温度条件下で、オスもメスも典型的な「長い紡錘」型の体型を示しました。雌の腹部は幅広く紡錘状で、翼の先端は腹部の先端をわずかに超えて伸びていました。雄の胸部と腹部の接合部は明確に区別され、腹部末端の暗色素沈着(雄の特徴)も確認されました。w¹¹¹⁸バエの両性の翅は透明で、明確に脈があり、翼の縁の曲率や脈の断裂は観察されませんでした。対照的に、Ent2*/CyOヘテロ接合体は翼基部の曲がりや翼縁の曲がりが顕著でした。22°Cでは、性別に関わらず、ショウジョウバエの体長は同じ遺伝子型の25°Cよりも有意に長くなりました。 さらに、同じ温度の女性の体長は男性よりも有意に長かった。さらに、22°Cと25°Cの両方で、Ent2*/CyOヘテロ接合体の体大は対応するw¹¹¹⁸匹のハエよりも小さくなっていました。形態学的基盤を調べるために、同時にハエの体長も測定しました(図3E、表1)。三者間ANOVAにより、遺伝子型(F(1,16)=230.1, P<0.0001)、体温(F(1,16)=19.50, P=0.0004)、性(F(1,16)=166.9, P<0.0001)に有意な主影響が明らかになりました。また、有意な遺伝子型×性相互作用(F(1,16)=14.96, P=0.0014)および遺伝子型x温度×性三者相互作用(F(1,16)=6.231, P=0.0239)も観察されました。

図3。 w¹¹¹⁸ および Ent2*/CyO 成体の対照形態。 22°Cおよび25° Cでのメ ス(A、C)とオス(B、D)の姿勢特徴を示す代表的な画像と、体長(E)の定量的比較。** P < 0.01。スケールバー:1 mm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

異なる温度条件下での生存分析
22°Cおよび25°CのEnt2*/CyOヘテロ接合体とw¹¹¹⁸のハエの生存曲線を統計的に解析しました(図4)。結果は、Ent2*/CyOヘテロ接合型女性の生存曲線が最も高く、14週時点で2名が生存していることを示しました。¹¹¹⁸頭の女性は14週までに全て死亡しました。 Ent2*/CyOヘテロ接合オスはすべて12週までに死亡し、w¹¹¹⁸オスはすべて11週までに死亡しました。これらの発見は、22°Cでメスの全寿命がオスより長く、同性内でEnt2*/CyOヘテロ接合体の生存能力がw¹¹¹⁸型よりやや強いことを示しています。

25°Cの条件下では、全体の生存期間は大幅に短縮されました。w¹¹¹⁸雌とEnt2*/CyOヘテロ接合雄の生存曲線は10週までにゼロに低下しました。Ent2*/CyOヘテロ接合雌と^w1118雄の生存曲線は8週目までに1〜2個体に減少し、9週目にはゼロに達しました。変異体とw¹¹¹⁸の差は統計的に有意ではありませんでした(P > 0.05)。これらの観察は、異なる環境条件下での変異株系統の生存特性を記述しています。

図4。異なる温度条件下でのショウジョウバエの生存曲線。Ent2*/CyOとw¹¹¹⁸の寿命を22°Cと25°Cで比較した生存分析。n=3。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

運動活動評価
w¹¹¹⁸とEnt2*/CyOの果バエの登攀能力は、22°Cと25°Cの2つの温度条件下で比較されました(図5、表2)。結果は、22°C(図5A)で、w¹¹¹⁸のメスの98.15%が30秒以内に8cm以上登ることに成功したのに対し、Ent2*/CyOヘテロ接合メスでは89.74%に低下しました(P < 0.05)。w¹¹¹⁸のオスはすべて8cm以上登ることができ、Ent2*/CyOヘテロ接合オスの登攀成功率は98.14%(P < 0.05)でした。25°C(図5B)では、w¹¹¹⁸の雌(100%)が30秒以内に8cm以上上昇しましたが、Ent2*/CyOヘテロ接合雌ではこの割合が91.31%に減少しました(P < 0.05)。w¹¹¹⁸人の男性のうち、77.28%が8 cm以上登ることに成功しました(P < 0.01)が、Ent2*/CyOヘテロ接合男性では63.57%にとどまりました(P < 0.01)。運動性能をさらに評価するために、15cmを超えるハエの割合を分析しました(図5C)。三者間ANOVAにより、性別(F(1,16) = 201.7, P < 0.0001)および育児温度(F(1,16) = 72.60, P < 0.0001)が登攀性能に与える非常に有意な主な影響があることが明らかになりました。しかし、遺伝子型の主な影響は有意ではありませんでした(F(1,16) = 0.59, P = 0.4545)。これらの結果は、運動性能が実験条件によって異なり、グループ間で文脈依存的に異なる可能性があることを示しています。

図5。異なる温度でのショ ウジョウバエ の登り能力の比較。 22°C(A)および25°C(B)での登攀性能の定量化と、15cm(C)>登攀距離を持つ個人の統計。** P < 0.01。n=3。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

体重測定
体重はw¹¹¹⁸およびEnt2*/CyOヘテロ接合型ショウジョウバエを22°Cおよび25°Cで測定しました(図6)。結果は、w¹¹¹⁸匹のハエと比較して、Ent2*/CyOヘテロ接合体の重量が22°Cおよび25°Cで有意に減少していることを示しました(P < 0.05またはP < 0.01)。オスのw¹¹¹⁸ハエの重量は雌のw¹¹¹⁸ハエよりも有意に低くなっていることが観察されました(P < 0.01)。同様に、雄のEnt2*/CyOヘテロ接合体の重量は雌のEnt2*/CyOヘテロ接合体よりも有意に低く(P < 0.01)。私たちは、遺伝子型、育成温度、性別がショウジョウバエの体重に与える独立かつ相互作用的な影響を評価するために、三者間ANOVAを実施しました。解析では、遺伝子型(F(1,16) = 32.38, P < 0.0001)、温度(F(1,16) = 23.31, P = 0.0002)、および性(F(1,16) = 25.52, P = 0.0001)に有意な主な影響が示されました(図6;表3)。さらに、温度と性別の間に有意な双方向相互作用(F(1,16) = 24.76, P = 0.0001)が見られ、体温が体重に与える影響は性別によって異なることが示されました。しかし、遺伝子型と温度(F(1,16) = 0.40, P = 0.538)、遺伝子型と性(F(1,16) = 1.31, P = 0.269)、または三者相互作用(遺伝子型 x 温度 × 性: F(1,16) = 0.48, P = 0.497)との間に有意な相互作用は見られず、Ent2*/CyO変異体の温度と性に対する応答は野生型と類似していることを示唆している。

性×温度の重要な相互作用を考慮し、その特定のパターンを明確にするために単純な効果解析を行いました。結果は、メスのハエでは22°Cで飼育された個体よりも体重が有意に多かったことを示しました(P = 0.0012)。しかし男性では、両体温間で体重に有意な差は見られませんでした(P > 0.9999)。これは、温度を25〜22°Cから下げることでメスの体重が増加した一方で、オスには有意な影響がなかったことを示しています。

遺伝子型と他の因子の間に有意な相互作用はなかったものの、遺伝子型の強い主効果は、 Ent2*/CyO 変異体が野生型に比べて全ての条件下で体重が一般的に低いことを示しました。事後比較では、22°Cの時点で野生型メス(w¹¹¹⁸:22 °C)はすべての変異群よりも有意に体重が高い(P < 0.0001)を示し、同じ温度内では両遺伝子型とも有意な性的二形性(メス>オス、 P < 0.01)を示しました。25°Cでは野生型と変異体の体重差も同様の傾向を示しましたが、統計的有意には達しませんでした。これらの発見は、異なる環境的および生物学的条件下での変異体系統の体重特性を示しています。

図6. 異なる温度でのショウジョウバエの体重比較。体重測定は22°Cおよび25°C。^{n P} > 0.05、* P < 0.05、** P < 0.01。n=3。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

抗酸化酵素活性
w¹¹¹⁸とEnt2*/CyOヘテロ接合ショウジョウバエの抗酸化酵素活性は25°Cで比較されました(図7)。結果は、w¹¹¹⁸匹のハエと比較して、オスとメスのEnt2*/CyOヘテロ接合体がカタラーゼ(CAT)および超酸化物ジムターゼ(SOD)活性を有意に低下させた(P < 0.01)を示したことを示しました。また、w¹¹¹⁸オスのCATおよびSOD活性はw¹¹¹⁸のメスよりも有意に高かった(P < 0.05またはP < 0.01)。同様に、Ent2*/CyOヘテロ接合オスの抗酸化酵素活性はEnt2*/CyOヘテロ接合メスよりも有意に高かった(P < 0.01)。

図7。最適な摂食温度における ショウジョウバエ の抗酸化能力の比較。 酵素活性アッセイでは、Ent2/CyOバエにおけるCAT (A)およびSOD(B)活性を示し、w¹¹¹⁸ 個のハエと比較して示されました。* P < 0.05、** P < 0.01。n=3。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

	SS	DF	MS	F(DFn、DFd)	P値
遺伝子型	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230.1	P<0.0001
温度	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19.50	P=0.0004
性別	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166.9	P<0.0001
遺伝子型 x 温度	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1.662	P=0.2156
遺伝子型×性別	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14.96	P=0.0014
温度×性別	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3.793	P=0.0692
遺伝子型×温度×性別	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6.231	P=0.0239
残留	0.05581	16	0.003488

表1: ショウジョウバエの体長測定の分散解析。

ANOVA表	SS	DF	MS	F(DFn、DFd)	P値
性別	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201.7	P<0.0001
遺伝子型	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0.5877	P=0.4545
温度	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72.60	P<0.0001
性別×遺伝子型	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19.30	P=0.0005
性別×温度	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9.708	P=0.0067
遺伝子型 x 温度	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18.37	P=0.0006
性別×遺伝子型×温度	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8.032	P=0.0120
残留	0.01176	16	0.0007349

表2: ショウジョウバエの登山能力(> 15 cm)の分散分析。

	SS	DF	MS	F(DFn、DFd)	P値
遺伝子型	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32.38	P<0.0001
温度	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23.31	P=0.0002
性別	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25.52	P=0.0001
遺伝子型 x 温度	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0.3958	P=0.5381
遺伝子型×性別	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1.310	P=0.2692
温度×性別	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24.76	P=0.0001
遺伝子型×温度×性別	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0.4834	P=0.4968
残留	2.156E-07	16	1.347E-08

表3: ショウジョウバエの体重測定の分散解析。

ディスカッション

エントは進化的に保存されたタンパク質であり、複数の^{生物学的プロセス}に影響を与えます。ツメガエルの卵母細胞で発現すると、Ent2はヌクレオシド輸送活性⁸を示します。研究により、Ent2のホモ接合変異体は幼虫後期から蛹期初期の¹⁰段階で致死的であることが示されています。本研究では、ショウジョウバエメラノガスターにおいてEnt2標的アレルを生成するためにCRISPR/Cas9ベースのゲノム編集ワークフローが確立されました。株確立時のホモ接合変異体の致死率はこれらの報告と一致しており、ゲノム編集戦略の妥当性を支持しています。この枠組みの中で、本研究で生成されたEnt2*/CyOヘテロ接合系統は、Ent2の部分的喪失に関連する表現型的特徴を記録するモデルを提供します。実験条件下で、Ent2*/CyOとw¹¹¹⁸のハエ間で体格、体重、運動活動、抗酸化酵素レベルに違いが観察されました。これらの観察は確立された変異体系統の表現型プロファイルを記述しています。

発生と体のサイズの観点から、Ent2*/CyOヘテロ接合体は22°Cおよび25°Cの両方でw¹¹¹⁸バエよりも有意に小さかった。 この違いは、Ent2遺伝子の欠如によるヌクレオシド輸送効率の低下に起因しており、これがエネルギー代謝の安定性やエクジゾン調節に影響を与えます。さらに、25°Cで悪影響がより顕著になりました。 研究によれば、動物の寿命は代謝率に影響されることが示されており、この概念は代謝率理論として^{知られています。}本研究の結果は、高温でのショウジョウバエの代謝率の上昇が、ヌクレオシド代謝の障害による栄養不足や発達遅延と密接に関連している可能性を示唆しています。しかし、単一のCRISPR由来アレルが用いられているため、これらの発見は遺伝子機能の直接的な証拠というよりは記述的な観察として解釈されるべきです。

複数の表現型読み取り値でも温度依存的な変動が認められました。この変異体は特に雌で22°Cでわずかな寿命延長を示し、これは以前の研究と一致する^39,40。対照的に、25°Cでは寿命差は減少するか、消えることさえあります。ショウジョウバエは温熱性生物として、より高い代謝率を示し、その結果、高温時の寿命が短い^41,42度であり、これは本研究の発見と一致しています。この文脈では、観察されるパターンは温度に対する一般的な生理学的反応を反映している可能性があります。

運動能力や抗酸化酵素活性は遺伝子型、性別、温度条件によっても異なっていました。特定の条件下でEnt2/CyOフライでは、登攀性能の低下とSODおよびCAT活動の低下が観察されました。これまでの研究では、ヌクレオシドトランスポーターがNAD⁺代謝、ミトコンドリア機能、酸化ストレス調節に関与していることが示されています(^{17,43,44,45,46,47})。これらの報告は生物学的な文脈の可能性を提供しますが、現時点でのデータは表現型の特徴付けに限定されており、Ent2とこれらの経路との機構的関連は確立されていません。

また、同じ条件下ではオスのショウジョウバエは通常、メスよりも高い抗酸化酵素活性を示すことが示されています^39,48。これは、性別に関連する要因が異なるシグナル伝達経路を通じて抗酸化反応を調節している可能性があることを意味します。抗酸化反応に関連する転写因子、例えばNrf2/CncCおよびその下流標的遺伝子は、性別間で発現の違いを示し、それにより全体的な抗酸化能力に影響を与えます⁴⁹。この観察は、ショウジョウバエにおける酸化ストレス耐性および抗酸化防御の性差に関する報告と一致しており、メスは一般的に雄に比べて低いROSレベルと高い基準抗酸化酵素活性を維持しており、これが性別間のストレス耐性や寿命の違いに寄与している可能性があります(⁵⁰).これらの観察は、変異表現型を特徴づける際に性別などの生物学的変数を考慮する重要性をさらに強調しています。

方法論的観点から、本研究はショウジョウバエにおけるCRISPR/Cas9介在変異の生成および検証のための再現可能なワークフローを示しています。gRNAの正確な設計と選択は不可欠であり、効果的なgRNAはCas9による標的切断の効率を決定し、意図しない修飾を最小限に抑えます(^21,51)。Cas9およびgRNA成分を胚に高精度でマイクロインジェインすることも重要であり、非効率な注入は編集率の低下やモザ^イク現象を引き起こす可能性があります。シーケンスによる徹底的な遺伝子型確認により、意図された編集が存在し、目標外や不完全な編集を排除することで、^{モデルの整合}性を強化します。特に、ホモ接合変異体の致死性からCyOバンダー染色体の使用がEnt2変異アレルを維持するために不可欠でした。この手法はショウジョウバエの遺伝学で有害な変異を保存し、下流解析を可能にするために広く用いられています。本研究は、この戦略がCRISPR/Cas9編集フレームワークにおいて実際にどのように応用されているかを示しています。

いくつかの制限点を認めておくべきです。まず、単一のCRISPR由来変異体系統を用いた表現型解析を実施しました。CRISPR/Cas9編集によって異質な対立遺伝子が生成されることはよく知られており、遺伝的結論を強化するために複数の独立した系統の解析が一般的に推奨されています。したがって、ここで報告された発見は、1つの変異アレルの予備的特徴付けとして解釈されるべきです。今後、独立生成された追加のEnt2対立遺伝子を取り入れた研究が、結論の堅牢性を高めるために必要となるでしょう。第二に、変異体系統はCyOバランサー染色体で維持されていましたが、対照群(w¹¹¹⁸)はバランサー染色体を持たない点です。バランサー染色体自体が発達や生理的特徴に影響を与える可能性があるため、バランサーマッチングコントロールがないことは交絡因子の原因となる可能性があります。この制限は、遺伝子型間の表現型の違いを解釈する際に考慮すべきです。第三に、湿度、光サイクル、食事などの環境条件は標準的な実験室環境下で維持されましたが、体系的に変化させられませんでした。これらの要因は代謝やストレス反応に影響を与えるため、制御された環境勾配を取り入れた今後の研究は、表現型と環境の相互作用をより包括的に評価することができるでしょう。

まとめると、本研究はショ ウジョウバエメ ラノガスター におけるEnt2変異アレルの生成と維持のためのCRISPR/Cas9ベースのワークフローを確立し、異なる環境条件下で得られるヘテロ接合系統の記述的特徴を提供します。この結果は致死表現型遺伝子の研究におけるこのアプローチの適用可能性を示し、遺伝的背景、バランサー染色体、環境変数などの実験設計の重要性を強調しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンモニウム酢酸塩	Sigma	A1542
カタラーゼ（CAT）アッセイキット（可視光法）（アンモニウムモリブデン酸法）	南京建成バイオエンジニアリング研究所	A007-1-1
ドデシル硫酸	Sigma	L3771
注射デバイス	Eppendorf FemtoJet	4i
線形化プラスミド：MLM3613	Addgene	42251
顕微鏡	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7キット	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7転写キット	Thermo Fisher	AM1344
PmeI制限酵素	NEB	R0560S
ポリ（A）ポリメラーゼ	NEB	M0276S
プロテアーゼK	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Miniキット	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express大規模RNA生産システム	Promega	P1320
T7 RiboMAXキット	Promega	P1320
総スーパーオキシドジスムターゼ（T-SOD）アッセイキット（ヒドロキシルアミン法）	南京建成バイオエンジニアリング研究所	A001-1
w1118 ショウジョウバエ	Fangjing Biology
水飽和フェノール/クロロホルム	Sigma	P2069