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方法論記事

同一食道がん患者からの腫瘍オルガノイド、がん関連線維芽細胞および対応する線維芽細胞の確立

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DOI:

10.3791/69548

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2026年4月3日

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、食道扁平上皮癌(ESCC)患者から、がん性オルガノイド、がん関連線維芽細胞(CAFs)、非腫瘍関連線維芽細胞(CF)を同時に分離する方法を説明しています。これらの患者に合わせた材料の採用は、患者間変動の問題を回避し、ESCC研究に適した実験プラットフォームを提供する可能性があります。

要約

食道扁平上皮がん(ESCC)では、治療抵抗性の獲得と腫瘍再発が依然として主要な臨床課題となっています。がん関連線維芽細胞(CAFs)は腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、ESCCの進行や治療反応に影響を与えることが知られています。しかし、CAFsが腫瘍悪性腫瘍に果たす役割の多くは、ESCC患者の患者間変異性からまだ不明のままです。研究可能なさまざまなヒトESCC細胞株は、ヒト癌の性質を部分的に模倣していると考えられています。また、培養環境に適応するために、培養環境に適応するために、何年も、数十年にわたり培養培養皿で増殖させられます。さらに、ヒトESCC細胞株は元の患者ごとに異なるさまざまな遺伝的およびエピジェネティックな変異を有しており、患者間で多様性が生じています。それにもかかわらず、長期培養がん細胞株はこれまでのほとんどの研究で患者ミスマッチCAFsの実験に用いられてきました。がん細胞株内およびがん細胞とCAF間の患者間変動は、再現性や結果の信頼性を低下させる可能性があります。患者間変異を排除するため、同一患者から3つの異なる細胞タイプを分離しました。すなわち、外科的に剥離されたESCC領域のがんオルガノイドおよびCAFs、そして隣接する非腫瘍領域からの対応する線維芽細胞(CF)をCAFsの患者特異的対照群として用いています。がんオルガノイド、CAFs、CFの同時分離を可能にする詳細なプロトコルが提示されます。がんオルガノイドは三次元条件下で良好に成長しました。CAFおよびCFは線維芽細胞マーカーの一つであるビメンチンを陽性に染色し、これらの細胞の線維芽細胞系統における富集を支持しました。本プロトコルにより、ESCCオルガノイドおよび患者適合線維芽細胞の確立が可能となり、腫瘍と間質間質の相互作用研究における患者間変動を排除する貴重な実験的プラットフォームを提供します。

概要

食道がんは世界的に高い発生率と死亡率と関連しています。大まかに2つの主要な組織学的サブタイプに分類されます:食道扁平上皮癌(ESCC)と食道腺癌(EAC)2。ESCCはEACよりも多く、特に東アジアとアフリカで高い発生率が見られます。ESCCの治療戦略は比較的確立されています。粘膜層に限定された初期病変の場合、内視鏡的切除が治癒的かつ低侵襲の選択肢として示唆されます。局所進行性だが切除可能な疾患の患者では、新補助化学放射線療法と食道切除術の組み合わせが臨床的有効性を示しています。切除不能または転移性の場合、全身化学療法が治療の主力となります。それにもかかわらず、治療耐性や疾患の再発は依然として大きな臨床的課題となっています。

腫瘍はがん細胞だけでなく、さまざまな間質細胞タイプからなる複雑な腫瘍微小環境からも成り立っています。その中でも、腫瘍微小環境の主要な細胞成分であるがん関連線維芽細胞(CAFs)が腫瘍進行および治療反応性に重要な役割を果たすことが示されています(6,7,8,9)。ESCCでは、CAFsの腫瘍悪性腫瘍および治療抵抗への関与も増加傾向にあります(10,11,12)。しかし、ESCC悪性腫瘍の基盤となるCAFsの正確な分子メカニズムは、依然として大部分が不明です。

これまでの多くの研究では、CAFががん細胞に与える影響は、PETRI皿内で長年、あるいは数十年にわたり増殖させられた様々なESCC細胞株を用いて評価されてきました。そのような細胞株は培養条件に適応し、元の腫瘍とはほとんど似ていません13。さらに、ESCC細胞株は異なる患者から由来し、それぞれのESCC細胞で明らかに異なる遺伝的およびエピジェネティックな変異を有しており、患者間変異として機能します。あるがん細胞株の実験結果は、別のがん細胞株のものとしばしば矛盾することがあります。したがって、異なるESCC細胞株と患者に合わないCAFsを用いた実験では、これらの細胞間の相互作用を再現性かつ信頼性のある方法で正確に解析することが困難になる可能性があります。

これらの制限に対処するため、患者に適合した腫瘍オルガノイド(CAFs)および非腫瘍対応線維芽細胞(CF)を同一のESCC手術標本から同時に分離するプロトコルが開発されました。患者由来のオルガノイドは、分子異質性を保ちつつ、原発腫瘍の主要な構造的および表現型的特徴を再現することが多いです。確立されたオルガノイドは三次元(3D)培養条件下で球状体を形成し、安定した増殖能力を示しました。CAFsとCFは、線維芽細胞マーカーであるビメンチン陽性の線維芽細胞群で豊富であることが確認されました。

このプロトコルは、組織処理、酵素解離、オルガノイドシーディング、CAF/CFの単離、パッセージング、クライオパーソイションのための詳細かつ再現可能な手順を提供します。実装前に研究者が適用可能性を評価するため、実践的な情報も含まれています。オルガノイドは通常3〜5日以内に形成され、7〜10日で通過準備完了に達し、10回以上の通過に安定して拡張可能です。CAFとCFは少なくとも8世代にわたって通過可能です。オルガノイドや線維芽細胞は約20日以内にクリオ保存が可能です。定着成功率はオルガノイドで約70%、CAFおよびCFで約80%に達します。さらに、CAFまたはCF調整培地を用いた検証済みの条件付き培地アッセイも含まれており、間質細胞が腫瘍オルガノイド挙動に与える副分泌効果を評価するための堅牢なアプローチを提供します。このマッチングされた腫瘍オルガノイド–間質プラットフォームは、ESCC腫瘍–間質相互作用を調査し、精密治療戦略の開発を支援するための実験的にアクセス可能で生物学的に関連性の高いモデルを提供します。

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プロトコル

ヒト組織を扱うすべての手技は、適切な機関のバイオセーフティ承認のもと、認証された生物安全キャビネット内で行われなければなりません。患者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、プロジェクトは順天堂大学医学部の研究倫理委員会によって承認されました。プロトコル2からプロトコル6までの手順の概要は 図1に示されています。ESCCオルガノイド培地(Eso_v1)中の各成分の組成と濃度は、Kijimaら14 および他の研究15、16、17 に基づいてわずかな修正のみで決定されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 試薬と組織調製

  1. 試薬と装備を準備しろ。
    1. 処置開始前に、ハサミ、鉗子、ピペットを含むすべての器具を滅菌してください。
    2. 15mLのチューブにリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)10mLを準備します。
    3. 低付着型の15 mLチューブを準備し、サンプルの産地に応じてラベルを付けます(例:腫瘍洗浄チューブ(A)、腫瘍消化チューブ(B)、非腫瘍洗浄チューブ(C)、非腫瘍消化チューブ(D))。
    4. 処理中の細胞接着を減らすために、胎児用牛血清(FBS)を2〜3回吸引・投与することでピペットをコーティングします。
      注:FBSコーティングは、機械的解離時に組織片がプラスチック表面に付着するのを防ぎます。
  2. 酵素溶液を準備する
    1. 腫瘍消化用酵 素溶液I を、2.7 mLのDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)と10% FBSおよび1xペニシリン–ストレプトマイシン(PS)(以下、DMEM/10% FBS)、10 mg/mL コラーゲン酵素0.3 mL、10,000 PU/mL分散酵素0.15 mL、2.5 μg/mL アンホテリシンB0.03 mLを混合して準備します。37°Cまで温めます。
    2. 非腫瘍消化用に酵 素溶液II を準備します。DMEM/10% FBS2.7 mL、コラーゲン1 mg/mL 0.3 mL、2.5 μg/mL アンホテリシンB0.03 mLを混合して準備します。37°Cまで温めます。
      注:コラーゲン酵素と分散は腫瘍組織の解離を促進します。
  3. オルガノイド培養培地を準備します
    1. 60%オルガノイド基底培地、40%L-WRN調整培地18 (ステップ1.4参照)、EGF(成長因子)50 ng/mL、抗酸化物質1 mM N-アセチル-L-システイン、5 mM ニコチンアミド(水溶性ビタミン)、500 nM A83-01(線維芽細胞増殖防止剤)、1x1 B-27(血清フリー培養サプリメント)、1x N-2(血清フリー培養サプリメント)、10 μM Y-27632(ROCK阻害剤)をEso_v1準備します。
    2. 使用前に培地を37°Cに平衡させてください。
      注:L-WRN調修培地(L-WRN細胞からの上清液)は、オルガノイドの起始に不可欠なWNT、R-スポンジン、ノギン信号を提供します。Y27632は培養期を通じて培地内に含まれています。
  4. L-WRN調制培地を準備します
    1. L-WRN細胞のバイアルを解凍し、10 mLのDMEM/10% FBSを含む100mmの皿にシードし、1〜2日間培養します。
    2. 培地を10mLのDMEM/10% FBSに置き換え、G418(最終500μg/mL)とヒグロマイシンB(最終500μg/mL)を含むものを培養し、細胞が80%の合流に達するまで培養します。
    3. 細胞を100mmの皿に10mL/10% FBS(G418とヒグロマイシンBを含む)を2枚の100mm皿に移し、細胞が100%合流に達するまで培養します。
    4. 細胞を150mmの5皿に20mLのDMEM/10% FBS(抗生物質なし)を1皿に投与し、100%のコンフルンスまで培養します。
    5. 各150mm皿から培地を吸引して捨てます。
    6. 採集培地(オルガノイド基礎培地に5%FBSを補足)1皿あたり25mLを加えます。
    7. 24時間潜伏させます。
    8. 5つの皿すべてから培地(25 mL × 5 = 125 mL)を滅菌ガラス瓶に集めます。
    9. ステップ1.4.6–1.4.8を繰り返し、合計8回の採取(目標プール体積:~1,000 mL)を行います。
    10. ボトルトップフィルターを使って溜まったCMを滅菌フィルターしてください。
    11. 40mLを25本の滅菌50mLチューブに分けます。
    12. アリコートは−80°Cで保存します。
  5. 線維芽細胞培養培地を準備します
    1. 線維芽菌ミディウム-1を準備します。
    2. 使用前に培地を37°Cに平衡させてください。
  6. ティッシュ処理皿を用意してください
    1. P1000チップを使ってFBSを3〜5滴ずつ、2つの100mm皿(腫瘍組織用Dish T、非腫瘍組織用Dish N)に塗布します。
      注:FBSコーティングは機械的な粉砕を滑らかにし、小さな組織片が皿の表面に付着するのを防ぎます。
  7. 組織取り扱いと標本同定
    1. 腫瘍標本と非腫瘍標本が氷で運搬されていることを確認します。
    2. 組織を少量のDMEM/10% FBSを含む60mmの皿に置き、使用まで氷で保存します。手術切除後16時間以内に処理を開始し、生存可能性を維持してください。
    3. 腫瘍組織は、非腫瘍組織とは異なる硬い組織と不規則な表面形態によって識別します。

2. 組織処理、洗浄、酵素的消化

注:この工程は、異なる酵素溶液を用いたミンス腫瘍および非腫瘍組織切片を消化するために行われます。

  1. 腫瘍組織と非腫瘍組織を細かく刻む
    1. 各組織標本(約5mm×5mm)をそれぞれのFBSコーティングされたディッシュ(腫瘍組織用はDish T 、非腫瘍組織用は Dish N )に移します。
    2. 無菌メスで組織を~0.5mmの断片に細かく刻みます。
      注:小さな断片ほど酵素の利用が可能になり、消化効率が向上します。
  2. ミンチを洗い流す。
    1. 組織の付着を防ぐために10mLピペットにFBSを塗布してください。
    2. FBSコーティングされたピペットを使って各皿に5mLのPBSを加え、挽いた組織を優しく再懸浮させます。
    3. 懸濁液を対応する腫瘍洗浄チューブ(チューブA)または非腫瘍ウォッシュチューブ(チューブC)に移します。
    4. ステップ2.2.2および2.2.3を繰り返します(総容量:10 mL)。
    5. チューブを室温で2分間置き、上澄液を除去し、約0.5〜1 mLのPBSと組織を底部に残します。
    6. 新しいピペットで新鮮なPBSを10mL追加します。FBSでピペットをコーティングした後、気泡の発生を防ぎながら力強くサスペンションをピペットで押します。
      注:強制ピペッティングは機械的解離と血液・粘液の除去を助けます。気泡を避けることでせん断誘発性細胞溶解を防ぎます。すべての洗浄工程はゴミを除去することを目的としています。
    7. チューブを室温で2分間置き、上澄液を除去し、約0.5〜1 mLのPBSと組織を底部に残します。
    8. この洗浄手順(ステップ2.2.6および2.2.7)を2回繰り返し、合計3回洗います。
  3. 組織を消化管に移す。
    1. 新しいピペットで新鮮なPBSを10mL追加します。ピペットにFBSをコーティングした後、腫瘍組織を腫瘍消化管(チューブB)に、非腫瘍組織を非腫瘍消化チューブ(チューブD)に移します。
    2. チューブを室温で2分間置き、上清液を取り除き、約0.5mLのPBSと組織を底部に残します。
  4. 酵素的消化を行います。
    1. 腫瘍組織の消化
      1. 酵 素溶液I (コラーゲン酵素+分散)の全量を腫瘍消化管(チューブB)に加えます。
      2. 37°Cで2時間、穏やかに回転させて培養します。
    2. 非腫瘍組織の消化
    3. 酵 素溶液II の全量(コラーゲナーゼのみ)を非腫瘍消化管(D管)に加えます。
      1. 37°Cで4時間、穏やかな回転させて培養します。
    4. サンプルの発生地に応じて、ステップ3(腫瘍サンプル処理)またはステップ6(対応する線維芽細胞シーディング)へ進みます。
      注:腫瘍組織および非腫瘍組織の消化に使用される酵素の種類や処理時間は、事前の実験最適化に基づいて決定されました。腫瘍組織にはしばしば高密度な細胞外マトリックスが含まれています。コラーゲンゼと併用すると、ディスファレンスは消化能力を高めます。

3. オルガノイドおよびCAF分離のための腫瘍サンプル処理

注:この工程は、同じ消化腫瘍サンプルからオルガノイド形成のための上皮腫瘍細胞および間質線維芽細胞(CAFs)を分離するために行われます。

  1. 腫瘍由来の細胞をろ過し、収集する。
    1. 100μmの細胞ストレーナーを50mLの円錐形チューブに置きます。
    2. ストレーナーに3 mLのDMEM/10% FBSを通して事前に湿らせます。
      注:事前湿潤は乾燥メッシュ繊維への付着を防ぐことで細胞損失を減らします。
    3. 腫瘍消化チューブ(チューブB)の内容物をすべてFBSコーティングされたP1000チップを使ってストレーナーに移し、未消化の組織断片を除去します。
    4. 残留クラスターをストレーナーで洗い流すために、さらに6 mLのDMEM/10% FBSを加えます。
    5. ストレーナーを外してろ過液をチューブBに戻します(新しい低付着型15 mLチューブも使用可能です)。
  2. ろ過液を洗浄して濃縮します。
    1. チューブを300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
    2. 使い捨てピペットで上清液を除去します。
    3. DMEM10mL/10% FBSを加え、逆回転で優しく混ぜ、再び300 × g で遠心分離機で5分間加熱します。
    4. ペレットを保持したまま、上澄液を慎重に吸引してください。
    5. 残りの体積をP200ピペットで40μLに減らします。
  3. オルガノイドおよびCAF培養のための細胞を割り当てます。
    1. オルガノイドシーディングに30μLを割り当てます。
    2. CAFシーディングに10μLを割り当ててください。
      注:この比率は経験的に、並行拡大に十分な上皮および線維芽細胞の集団を提供します。

4. オルガノイドシーディング(3次元培養)

注:この工程は腫瘍由来の細胞懸濁液からESCCオルガノイドを確立するために行われます。

  1. 地下室の膜マトリックスドームを準備してください。
    1. 標準的な24ウェルプレートを37°Cまで予温してください。
      注:プレートの予温は基底膜マトリックスドームの固化を加速させます。
    2. 腫瘍由来懸濁液30μLと氷のように冷たい基底膜マトリックス90μL(1:3比率)を混ぜます。
    3. 4つの井戸にそれぞれ30μLを注入します。
    4. ドームをCO₂インキュベーターで15分間固化させます。
  2. オルガノイド培養培地を加える
    1. オルガノイド培地に、あらかじめ混合されたサプリメント(FGF10、SB202190、抗生物質(使用時は1×アンホテリシンBおよび100 μg/mLプリモシンなど)を準備します。
      注:井戸1:Eso_v1;井戸2:Eso_v1 + 10 μM SB202190;ウェル3:Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10;井戸4:Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10(最終濃度)。
    2. 壁沿いの各ウェルに1mLの培地を優しく加えます。
    3. 標準的なCO₂培養条件下で培養してください。
    4. 培地は3〜5日ごとに交換してください。
      注:サプリメントを予め混ぜることで、脆弱なベースメント膜マトリックスドームに直接少量をピペットで送る必要がなくなります。抗生物質はオルガノイド形成後最初の6日間のみ追加されます。培養条件(FGF10 +/-、SB202190 +/-)は成長速度と形態(できれば球形)に基づいて決定されます。
  3. オルガノイド形成を監視してください。
    1. 毎日倒立顕微鏡でドームを観察してください。
      注:予想形態:3日目から5日目→球状体;7日目から10日目→密集した球体が通過準備を整えました。
    2. オルガノイドが約100〜200μmの大きさに達した場合、またはドームの混雑率が90%以上に達したときに通過します。

5. CAFシーディング

注:この工程は腫瘍由来の細胞懸濁液からCAFsを確立するために行われます。

  1. コラーゲンコーティングされた皿にCAFをまきます。
    1. 線維芽細胞培地-1を1.5mL入れたコラーゲン被覆60mmの皿を準備します。
    2. CAFシーディング用に割り当てられた腫瘍ろ過液を10μL加えます。
    3. アンホテリシンB1×プリモシン100μg/mLなどの抗生物質を加えます。
    4. 標準的なCO₂培養条件下で培養してください。
    5. 培地は3〜5日ごとに交換してください。
      注:経験的に、線維芽細胞媒介物-1はCAFsおよびCFの初期の確立と成長に他の培地よりも適していることが多いです。抗生物質は最初の6日間のみ添加されます。
  2. CAFの成長を監視する
    1. 線維芽細胞様紡錘形の出現を3日目から5日目頃から監視します。
    2. 通路線維芽細胞は90%〜100%の合流度で形成されます。
      注:上皮細胞汚染が発生した場合、線維芽細胞は通過時に上皮細胞よりも早く剥離するため、トリプシン化の時間を調整して選択的に単離できます。

6. CFシーディング

注意:このステップは、隣接する腫瘍のない組織から患者に適合したCFを取得するために実施されます。

  1. 腫瘍のない消化体を洗浄し、準備してください。
    1. 非腫瘍消化管(チューブD)を300× g で5分間遠心分離します。
    2. 使い捨てピペットで上清液を除去します。
    3. DMEM10mL/10% FBSを加え、逆流で優しく混ぜ、再び300× g で遠心分離機で5分間行います。
    4. ペレットを保持したまま、上清液を慎重に吸引してください。
    5. 6.1.3と6.1.4のステップをもう一度繰り返します。
  2. コラーゲン被覆皿にCFをシードします
    1. 懸濁液全体を、1.5mLの線維芽細胞培地-1を含むコラーゲン被覆60mm皿に移します。
    2. アンホテリシンB1×プリモシン100μg/mLなどの抗生物質を加えます。
    3. 標準的なCO₂培養条件下で培養してください。
    4. 培地は3〜5日ごとに交換してください。
      注意:抗生物質は最初の6日間のみ追加されます。
  3. CFの成長を監視してください。
    1. 線維芽細胞様紡錘形の形態が3〜5日目から始まるのを観察します。
    2. 通路線維芽細胞は90%〜100%の合流度で形成されます。

7. オルガノイド通過と低温保存

  1. オルガノイド通過。
    注:このステップの目的は、オルガノイドが適切な密度に達したら拡張することです。
    1. 古い培地を吸引し、それぞれ1mLのPBSで洗浄します。
    2. 各ウェルにオルガノイド用に予熱したトリプシンを0.5mL加えます。
    3. P1000チップでピペットを激しく流し、チップの縁を使ってベースメント膜マトリックスドームを破壊します。
      注:機械的せん断は密度の高い基底膜マトリックスを分解し、酵素へのアクセスを改善します。
    4. すべてのゲル塊が溶けるまで、CO₂インキュベーターで10〜15分間培養します。オルガノイドを20〜50個の細胞塊に解離させます。
      注意:完全な単細胞解離は生存率を低下させるため避けてください。
    5. 懸濁液を低接続の15 mLチューブに集めます。
    6. 0.5mLのDMEM/10% FBSで4回洗浄し、すべての洗浄液を同じ低付着チューブに移します。
    7. チューブを300 × g で5分間遠心分離します。
    8. 上澄液を取り除き、最小限のDMEM/10% FBSでペレットを再懸濁します。サスペンション容積を80μLに調整します。
    9. オルガノイド懸濁液80μLと氷のように冷たい基底膜マトリックス240μL(1:3比率)を混ぜます。
    10. 混合物を事前に温めた6ウェル板(37°C)にメッキし、1ウェルあたり4〜6個のドームを設けます。
    11. ドームを15分間固めた後、各ウェルごとに3mLのEso_v1培地(ステップ4.2の初期培養で最適とされた組成)を加えます。
    12. 培地は3〜5日ごとに交換してください。
      注:オルガノイドは直径約100〜200μmに達するか、ドームの混雑率が90%を超えるときに通過します。細胞数は行われません。通常のサブカルチャーでは、オルガノイドは1:4から1:10の比率で分割されます。球体の急速な再形成は48〜72時間以内に予想されます。
  2. オルガノイド冷凍保存
    1. それぞれのウェルを3mLのPBSで洗浄します。
    2. 各ウェルにオルガノイドトリプシン1.5mLを加え、激しくピペットを回して10分間培養します。
    3. 懸濁液全体を低接続の15 mLチューブに集め、井戸を4回洗い流します。
    4. チューブを300×gで遠心分離して5分間過ごし、上清液を取り除きます。
    5. ペレットを90%FBS/10%DMSOの2 mLに再懸濁します。
    6. 各クライオビアルに0.5mLずつ注入してください。
    7. バイアルを冷凍容器に入れ、−80°Cで一晩保存します。
    8. バイアルを液体窒素に移して長期保存してください。
      注意:オルガノイドは直径約100〜200μmに達するか、ドームの混雑率が90%を超えるときにストックされます。
  3. 凍結オルガノイドの回収
    1. 37°Cの水浴でクライオビアを速やかに解凍します。
    2. 内容物を15mLチューブ内の5 mLのDMEM/10% FBSに移します。
    3. チューブを300 × g で5分間遠心分離します。
    4. 上清液を取り出し、ペレットを40〜60μLのDMEM/10% FBSに再懸濁させます。
    5. 懸濁液を氷のように冷たいベースメント膜マトリックスと1:3の比率で混ぜます。
    6. 混合物を事前に加熱された6ウェル板(37°C)に4〜6個のドームとして1ウェルに盛り付けます。
    7. ドームを15分間固めた後、各ウェルごとに3mLのEso_v1培地(ステップ4.2の初期培養で最適とされた組成)を加えます。

8. 線維芽細胞の通過と低温保存

  1. CAFとCFの通過
    注意:このステップの目的は、線維芽細胞が適切な密度に達したときに拡張することです。
    1. 食器をPBS2mLで洗います。
    2. 0.25%トリプシンを0.4mL追加します。
    3. CO₂インキュベーターで5分間培養し、顕微鏡で剥離を観察します。
    4. トリプシンをDMEM/10% FBSで中和し、細胞懸濁液全体を100mmのディッシュに10mLの培地を移します。
      注:線維芽細胞は90%〜100%の合流に達したときに通過します。日常的なサブカルチャーでは、1:3の比率で分けられます。経験的に、細胞密度が低いと線維芽細胞の増殖は遅くなるか停止します。
  2. 線維芽細胞凍結保存
    1. 細胞を5mLのPBSで洗浄します。
    2. 0.25%トリプシン1mLを加え、CO₂インキュベーターで5分間培養します。
    3. トリプシンをDMEM/10% FBSで中和し、細胞懸濁液全体を15mLチューブに移します。
    4. 遠心分離機で300 × gで5分間加熱します。
    5. 細胞ペレットを90%FBS/10%DMSOの2 mLに再懸浮させます。
    6. 各クライオビアルに0.5mLずつ注入してください。
    7. バイアルを冷凍容器に入れ、−80°Cで一晩保存します。
    8. バイアルを液体窒素に移して長期保存してください。

9. 条件付き媒体アッセイ

注:このステップの目的は、調整培地(CM)を用いて線維芽細胞がESCC腫瘍オルガノイドに与える副分泌効果を評価することです。このアッセイは、直接共培養がまだ最適化されていない場合でも再現可能なストロマル-腫瘍相互作用モデルを提供します。

  1. CAF/CF調配培地の調製
    1. 同じ数のCAFまたはCFを3 mLのDMEM/10% FBSで60mm皿に80%〜90%の合流率まで培養します。
    2. 細胞を2mLのPBSで一度洗浄します。
    3. DMEM3mL/2% FBSを加えます。
    4. CO₂インキュベーターで48時間培養します。
    5. 上澄液を15mLのチューブに集めます。
    6. 2000 × g で5分間遠心分離機で細胞の残骸を除去します。
    7. 2.5 mLの上清液を新しい15 mLチューブに採取します。
    8. 調整培地を100〜500μLの分量に分割し、-80°Cで保存します。
  2. オルガノイドアッセイ培地の調製
    1. ステップ1.3で説明されたESCCオルガノイド培地を準備します。
    2. オルガノイド培地と調理培地を1:1の比率(50% v/v)で混ぜます。
  3. オルガノイドアッセイ培地を用いたがんオルガノイドの培養。
    1. ステップ7で説明したオルガノイド通過の後、オーガノイドを1ウェルごとに20μLの基底膜マトリックスドームにシードし、事前に温めた48ウェルプレート(37°C)に設置します。
    2. ドーム凝固後、各ウェルに0.3mLのオルガノイドアッセイ培地を加えます。
    3. オルガノイドアッセイ培地は3〜7日ごとに交換します。
    4. がんオルガノイドの形態と大きさを評価してください。
      注意:すべてのヒト由来の物質は感染の可能性があるとみなされます。手袋、マスク、保護メガネなどの適切な個人用防護具を常に着用してください。コラーゲン酵素、分散酵素、ジメチルスルホキシド(DMSO)は皮膚、目、呼吸器の刺激を引き起こすことがあります。したがって、直接接触や吸入は避けられます。ヒト組織を対象としたすべての酵素的手技は、機関のバイオセーフティガイドラインに従って行われます。人間の組織を含む液体廃棄物は密閉されたバイオハザード容器に回収され、処分前にオートクレーブ処理されます。DMSOや酵素溶液を含む化学廃棄物は、機関の有害廃棄物ガイドラインに従って処分されます。再利用可能なすべての器具は70%エタノールで洗浄され、再利用前にオートクレーブ処理されます。

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結果

腫瘍領域および腫瘍から3cm離れた隣接する非腫瘍領域から組織サンプルを採取し、新補助化学療法を受けていないESCC患者から外科的に切除した。がん性オルガノイドおよびCAFは腫瘍領域から単離され、CFは非腫瘍領域から分離されました。手術用組織は約0.5mmの大きさの細かい部分に細かく刻まれ(図2A)、その後酵素処理を行い、その後がんオルガノイドと線維芽細胞を別々に分離しました。オルガノイドや線維芽細胞は、細胞株として低温保存のために成長するまでに約18〜21日かかりました。

がんオルガノイドは3〜5日で可視球体を形成し、7〜10日で通過準備状態に達しました。腫瘍組織由来のオルガノイドは安定した形態を示し、位相差イメージングの下で≥10回の通過に成功し、一貫した球状構造を形成しました。培養2日目と3日目を比較すると、球体の数とサイズの両方で3日目に顕著な増加が観察されました(図2B)。さらに、球体の数...

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ディスカッション

これまでの報告では、がんオルガノイドと患者マッチしたCAFsを用いて、ヒトの大腸がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がんにおける増殖および薬剤耐性におけるCAFの役割を調査しました(20,21,22,23,24)。これらの研究は、CAFsが増殖や薬剤耐性に影響を与えることを示しました。一方で、現時点での知見の範囲では、がんオルガノイドや患者適合型CAFをESCCで実験に利用した報告は発表されていません。

本研究では、同じESCC患者からがんオルガノイド、CAFs、CFを同時に分離し、CAFsの患者特異的対照群として機能するプロトコルが確立されました。複数の標本を対象としたがんオルガノイドの定着成功率...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、順天堂大学若手研究者賞(2024年および2025年)をP.Z.に、また日本文部科学科学技術省からの科学研究助成金(23K07362, 21K08693)によって支援されました。病理学・腫瘍学部門、そして食道・消化器外科の全メンバーの皆様に感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100mmディッシュTPP93100
100倍ペニシリン・ストレプトマイシン(PS)ナカライ26253-84
15mlチューブファストジーンFG2001
24ウェル細胞培養プレートTPP92024
48ウェル細胞培養プレートTPP92448
50mlチューブファストジーンFG2004
60mmアンテナTPP93060
6ウェル細胞培養プレートTPP92006
A83-01ケイマン9001799
高度なDMEM/F12 ギブコ12634010オルガノイド基底培地 = Advanced DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 アンチマウス IgGインビトロジェンA11029
アンフォテリシンBサーモフィッシャー15290018
抗ビメンチン抗体(V9)サンタクルーズSC-6260使用のための希釈量は1/500
B-27サーモフィッシャー17504044
ボトルトップフィルターサルトリウス180F15
セルストレーナー、100およびマイクロ;m 孔BDファルコン352360
コラーゲン酵素、タイプI。シグマC0130
コラーゲン被覆60mmディッシュ岩城4010-010
ジメチルスルオキシド(DMSO)和子043-07216
Dispase I後道修星386-02271
ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム(DMEM)ナカライ08459-64
エクリプス Ti2ニコン
胎児用牛血清(FBS)セラナS-FBS-CO-015
線維芽細胞成長培地2プロモセルC-23020線維芽細胞培養地-1 = 線維芽細胞成長培地2
G418インビボジェンアント-GN-1
グルタMAX ギブコ35050061
HFDM-1KSK87-160線維芽細胞メディウム-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 × PS
Hoechst33342 ナカライ04929-82
ヒグロマイシンインビボジェンアント-HG-1
IncuCyteシステムエッセン・バイオサイエンス
L-WRNセルATCCCRL-3276
マトリゲルコーニング354234基底膜マトリックス = マトリゲル
N2サーモフィッシャー17502048
N-アセチル-L-システイン和子017-05131
ニコチナミドTCIN0078
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)ナカライ14249-24
プリモシンインビボジェンANT-PM-05
組換えヒトEGFペプロテックAF-100-15
組換えヒトFGF-10ペプロテックPEP-100-26
SB202190セレックS1077
メス、第11号フェザー8-3086-02
ステムフル住友ベークライトMS-90150低付着型15 mLチューブ=STEMFULLです
TrypLEエクスプレスギブコ12605028オルガノイドのためのトリプシン = TrypLE Express
トリプシンナカライ35556-44
Y-27632セレックS1049

参考文献

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