ポリグルタミン脊髄小脳失調症は、CAG増殖によって凝集しやすいタンパク質が生成されることによって引き起こされます。本プロトコルは、ベクター産生、立体誘導、包有物およびニューロンマーカー喪失の解析を記述し、神経変性疾患のメカニズムを調査し、標的治療を評価するための制御されたプラットフォームを提供します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ポリグルタミン脊髄小脳失調症は、各原因遺伝子のコード領域内のトリヌクレオチドCAG路の変異によって引き起こされる6つの神経変性疾患のグループです。この変異によりタンパク質内に異常に拡大したポリグルタミンの伸縮が生じ、凝集しやすくなり、神経内包摂物の形成が起こります。これはこれらの疾患の特徴です。これらの疾患の病因の分子メカニズムは複雑で、完全には解明されていません。しかし、これらの病気は今のところ治療法が依然として存在しています。脆弱な脳領域における分子メカニズムの理解は治療開発に不可欠です。選択的脆弱性には対処しなくても、複数のトランスジェニック系統を生成する時間とコストを抑えつつ、柔軟で地域特異的な実験プラットフォームを迅速に試験する必要があります。近年、私たちや他の研究者は、脳の特定領域における拡大タンパク質発現の影響を研究するために、いくつかのレンチウイルスベースのモデルを開発してきました。これらのモデルは、一部の疾患の特徴を模倣する神経病理学的および行動的特徴を示し、病因の理解や新たな治療戦略の開発において重要であることを強調しています。本論文では、SCA2を例として線条体モデルの開発を説明します。レンチウイルスベクターの開発と産生、そして病原タンパク質であるアタキシン-2の拡張型を発現させるベクターの立体注射を強調します。最後に、我々は二つの主要な神経病理学的特徴、すなわち包有物の形成と神経マーカーの喪失を特徴付けます。これらの主要な病理的特徴を再現する管理されたプラットフォームを提供することで、このモデルは神経変性の領域特異的なメカニズムを解明し、標的治療介入を評価するための貴重なツールを提供します。
概要
ポリグルタミン脊髄小脳運動失調症(polyQ SCAs)は、CAGトリヌクレオチドの繰り返し増殖が原因遺伝子内で増加し、コードタンパク質内に有毒なポリグルタミン(polyQ)路を引き起こすため、6つの常染色体優性神経変性疾患のグループです。その中でも最も一般的なpolyQ SCAはSCA3/マチャド・ジョセフ病とSCA22です。これらの疾患は主に、小脳や脳幹を含む特定の脳領域の神経細胞、さらに線条体やその他の領域に影響を及ぼします。その結果、進行性の運動協調不全、歩行障害、重度の神経変性、早死を引き起こします3。
ポリQ SCAの研究や治療アプローチの検証のために、複数の動物モデルが開発されています。トランスジェニックマウス、ノックインライン、条件付き発現マウスモデルを用いて、疾患進行の分子基盤や関与する細胞経路を明らかにしています。しかし、新しい疾患動物モデルの作成は時間とコストがかかり、疾患の病因における脳の領域関与の研究には適さないことが多い6。
レンチウイルス(LV)ベースのマウスモデルは、従来のモデルに対する補完的な代替手段を提供し、コストが抑えられ、脳の特定領域を研究できる可能性も備えています7,8。レンチウイルスベクターは最大8 kbの大型トランスジーンを送達可能にし、生殖細胞系修飾を必要とせずに特定の脳領域で病理を迅速に誘導し、異なる年齢の動物にも使用できます。レンチウイルスベクターを標的脳領域に直接注入することで、他のウイルスベクターと比べて免疫原性が低い病原性または治療用遺伝子の領域特異的発現を実現できます4。さらに、出生後の分娩は、より人間発症に近い条件下で疾患メカニズムを調査するための発達補償を回避します。発現レベルはウイルス用量を調整し、重症度の制御された表現型を作成し、段階的な疾患進行のモデリングを促進することで調整できます。さらに、この方法は選択したプロモーターに依存する細胞型特異的発現を可能にします。
複数の研究で、PolyQ SCAのモデリングにおけるLVベースのマウスモデルの実用性と有用性が示されています。私たちと他の研究者は、SCA11、SCA212、SCA311、12、SCA714のLVベースのモデルを開発し、神経病理学の重要な側面を再現しつつ、疾患遺伝子の迅速かつ領域特異的な発現またはサイレンシングのプラットフォームを形成しています。
まとめると、ここで述べたレンチウイルスアプローチは、polyQ SCAの病因をモデル化するための多用途かつ効率的なツールを提供します。現在の動物モデルの主要な欠点を克服することで、この方法は概念実証研究を加速し、発症、局所、重症度の制御を強化し、治療スクリーニングや分子メカニズムの研究に非常に適しています。ここでは、ポリグルタミン脊髄小脳運動失調症の線条体レンチウイルスモデルを生成・特徴づける再現可能な方法を説明し、早期病原性イベントの詳細な解析と候補治療薬の評価を可能にします。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての動物実験は、動物研究:生体内実験報告(ARRIVE)ガイドラインおよび米国国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイドに従って実施されました。本研究は、動物資源・動物資源局(Direção-Geral da Alimentação e Veterinária、DGAV)によって承認されました。本研究ではC57BL/6Jマウスを用い、標準ケージで12時間の明暗・12時間の暗循環でグループ飼育し、食事と水は 自由に提供されました。
注:本プロトコルで使用される材料は、 材料表に詳細記載されています。
1. レンチウイルスベクターのパッケージング
注意:レンチウイルスベクターを含むすべての処置は、機関の安全ガイドラインに従いBSL-2検査室で実施されなければなりません。4プラスミドトランスフェクションシステムを用い、他のレンチウイルス産生系に比べて高いバイオ安全性が評価されました(トランスファープラスミドの詳細は 図1 参照)。
- HEK 293T細胞を水浴で解凍し、T75フラスコにDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)を2 mM L-グルタミン、10% FBS、1% ペン-ストレプ菌を補足して種子をまきます。この完全なDMEM媒体はプロトコルのすべてのステップで使用されました。高いウイルス抗体価と安定した結果を得るために、パスジェッジ番号≤10の細胞を使用します。
注意:進める前に必ずマイコプラズマ汚染の有無を確認してください。 - 細胞が80%〜90%の合流に達したら、初期培養を1:2分割して2つのT175フラスコに拡張します。1皿あたり3.8×10個の6 細胞(最終体積10 mL)で100mmの培養皿を20個播種し、5% CO₂の加湿インキュベーターで37°Cで24時間培養します。ノイバウアー血液細胞計を用いてトリパンブルー排除による細胞数。
注意:細胞ストレスを減らし、結果として細胞トランスフェクションを最大化するために、培地からペンストレプ菌を除外することを検討してください。 - 翌日、 表1に記載された形換えミックスを準備します。ボルテックスし、一時的にスピンダウンして均質化します。混合物を室温で10〜20分間培養し、DNAのPEI複合体が形成されます。
- DNA:PEI複合体を室温で15分間形成させた後、完全なDMEMで混合物を5 mLに調整しました。
各培養皿から5mL(総体積の半分)を除去し、5mLのトランスフェクション混合物に置き換えます。これにより、トランスフェクション中は最終培養体積を10mLに維持します。 - 表1に記載された3つのパッケージングプラスミドとトランスファープラスミドで細胞をトランスフェクトします。
注意:レンチウイルス産生に使用されるすべてのプラスミドは、エンドトキシンフリーの精製キットで準備されるべきです。さらに、トランスフェクション前にLTR領域およびトランスジーンカセットの正確性を確認するために、制限酵素解析でプラスミドの完全性を検証する必要があります。 - トランスフェクションミックス5mLを各プレートに滴りずつ加え、6時間培養します。すべての培地を吸引し、10mLの新鮮培地に置き換えます。48時間潜伏してください。
注意:ウイルス価を上げるには、培地を48時間後に採取し、各プレートに新鮮培地10mLを加え、24時間後に再度採取してください。以前に採取した培地は4°Cで最大24時間保存可能です。これにより、体積の2倍の濃度が得られ、ウイルス価が増加します。 - レンチウイルスベクターを含むすべての調理培地を0.22μmフィルターユニットでろ過します。
2. レンチウイルスベクターの精製および滴定
- ろ過した上清液を適切な円錐形超遠心分離機管に移し、65,000 x g で4°Cで1時間30分遠心分離機に移します。例えば、スイングバケットローターなどを用います。
- 上清液を慎重に捨て、各ペレットを1x PBSで希釈した1%BSAを400μLで再懸濁し、気泡の発生を防ぎます。氷で少なくとも1時間孵化させてください。
- 1時間の培養後、各チューブを優しく混ぜてペレットが完全に再懸浮し均一になるようにし、その後すべての再懸濁ペレットを1本のチューブにまとめます。
- 遠心分離中の崩壊を防ぐため、チューブ内に1%のBSA/PBSを少なくとも3分の2まで満たしてください。
- 再び65,000 x g で4°Cで1時間30分遠心分離し、レンチウイルスベクターをペレット化します。上澄液を慎重に捨て、チューブの縁を滅菌紙で乾かします。
- レンチウイルスベクターを含むペレットを1% BSA/PBSの45μLに再懸浮させ、気泡を避けます。チューブを透明膜で密封し、4°Cで24時間培養します。
- 翌日、レンチウイルスベクター10μLのアリコートを準備します。滴定には10μLのアリコートを保持してください。p24 ELISAキットは5μL、qPCRキットは2μLです。製造元の指示に従ってELISAとqPCRを用いてレンチウイルスベクターを滴定します。
注:滴定方法の選択は、感染単位の迅速な評価や正確な定量化など、実験的ニーズによって異なります。p24に基づくELISAはカプシドタンパク質を定量化し、したがって総物理粒子数を測定します。これは迅速で、他の方法よりも安価で、再現性も高いです。しかし、感染性粒子と非感染性粒子を区別できず、機能的滴価の過大評価につながることがあります。qPCRに基づく滴定は、粒子にパッケージ化されたウイルスゲノム(vg)の数を測定し、ゲノム含有ウイルス粒子のより正確な推定を提供し、ベクター調製物間の直接比較を可能にします。しかし、ウイルス粒子の効果的な感染力は依然として評価できません。最後に、蛍光ベクターのフローサイトメトリーや抗生物質耐性コロニー形成などの感染性に基づくアッセイは、機能的トランスデューシング単位(TU/ml)を直接測定し、生物学的に最も関連性が高いものの、より労力がかかり、細胞型に依存し、時間がかかり、高価です。15,16。
3. マウス線条体における両側レンズ状ウイルス送達のための立体誘導手術
- 動物の調理
- 動物の体重を測り、必要な麻酔用量を計算します。レディミックス溶液を用いて、体重10μL/gの量で腹腔内麻酔を投与します。この溶液は、0.9%ナチュラル7.5 mL、メデトミジン500 μL(1.0 mg/mL)、ミダゾラム1.0 mL(5.0 mg/mL)、フェンタニル1.0 mL(0.05 mg/mL)を混合して、最終体積10 mLと合成します。完全な麻酔誘導には約10分の時間を確保してください。
- 麻酔の深さ(例:つま先のつまみ反射)を確認しましょう。両目に眼科軟膏を塗り、頭皮を剃ります。
- 動物を立体誘導フレームの温熱パッドの上に置きます。イヤーバーとバイトバーを使って頭の位置を調整します。
注:注射すべき動物の数やタイムラインは実験に依存し、特定の仮説と期待効果量に基づく 事前 統計的検出力分析によって決定されるべきです。例えば、前回の研究12では、注射後4週、8週、12週に注射された脳を分析し、神経病理学的変化の進行を評価しました。
- 注射器の調製とウイルス負荷
- 装填には標準のハミルトン針を使い、注射には26Gの鈍先針を使いましょう。注射器にレンチウイルスベクター溶液2μLを注入します。注射部位あたりのウイルス用量はp24抗原400 ng/mL、または5 x 109 IU/mL 10,12,17であることを確認してください。
- シリンジを自動マイクロインジェクションポンプ(例:ストールティング)に取り付けます。注射器を注入モードでプライミングし、針先に液体の滴が出るまで待ちます。面取りが前方を向いていることを確認してください。
- ポンプのパラメータを設定してください - 速度:0.25 μL/min、半球あたりの容積:2 μL、使用されるシリンジの種類:使用する量に適しています。
注:注入量は齧歯類の種類や移植対象の脳領域によって異なります。1 μLの注射は焦点発現を引き起こしますが、最大10 μLの総量は注入速度が非常に遅く、組織の破壊や逆流のリスクが高まります。
- 紋状体標的化と注射
- 頭皮を70%エタノールで消毒してください。無菌メスの刃を使って、耳の間から目まで中央線(~1.5cm)の切開をします。
- 頭蓋骨を露出し洗浄し、綿棒で骨膜を除去します。ブレグマを特定し、立体走位ゼロ点(手動またはデジタル)を記録します。
- Bregmaに対する注射座標を決定します(生後8〜12週、体重約18〜20gのマウス):前後(AP)+0.6 mm;中外側(ML)±1.8 mm;背腹側(DV):–3.3 mm。
- マークされたAP/ML座標で慎重に掘り下げてください。脳を貫かないようにゆっくり進めてください。あるいは、骨が十分に薄くなったら停止する方法もあります。これは頭蓋骨を通る硬膜内の血管の可視化によって示されます。小さな針で硬膜を慎重に貫通してください。
- 注射針を下げて穴が正しい位置にあるか確認してください。針詰まりの検査は、溶液の一部を注射して滴がはっきり見えるまで確認してください。
- 注射針をゆっくりとDV座標まで下げてください。各半球あたり2μLのウイルス溶液を0.25μL/分で注入します。注射後は、逆流を防ぐために針をゆっくり引く前に5分待ちます。
- 野生型タンパク質をコードするレンチウイルス(ATXN2WTまたはATXN3WT)を片側に、変異/拡大タンパク質(ATXN2MUTまたはATXN3MUT)を反対側(ランダム化または事前定義)にレンチウイルスを注入します12,13。
注:マウス脳アトラス18を用いると、皮質、海馬、黒質、小脳を含むほぼすべての脳領域を視体的に標的的に捉えることができます。小脳はSCAにおける病理の主な部位であるため、ベクターデリバリーにおいて特に重要な標的となります。この小脳SCA3マウスモデルの開発において、座標は前端からラムダまで1.6mm、正中から0mm、腹側から頭蓋骨表面まで1mm、口バーは−3.3に設定され、小脳皮質12,15の正確なターゲットを確保しました。
- 手術中のモニタリング
- ひげの動きや反射神経をモニターしてください。動きが確認された場合は、初期体積の3分の1の補助麻酔投与を行います。
- 創傷の閉鎖と回復
- 切開部を3〜5本の間断5-0ナイロン縫合糸で閉じます。初期麻酔薬の効果を逆転させるため、10 μL/gの量で皮下投与する。この溶液は、0.9%ナチュラル1.5mL、アチパメゾール500μL(5.0 mg/mL)、フルマゼニル5.0 mL(0.1 mg/mL)、ナロキソン3.0 mL(0.4 mg/mL)を組み合わせて、最終体積10 mLと合成します。
- 動物を清潔なリカバリーケージに入れ、温熱パッドの上に置き、一晩中観察してください。
注:注射室には理想的にはベクター取り扱い用の生物学的安全キャビネットが設置されているべきです。研究者は、白衣、手袋、目の保護具を含む適切な個人用防護具(PPE)を着用しなければなりません。すべての廃棄物(例:針、注射器、汚染物質)は、機関および国の規制に従いバイオハザード容器で処分されなければなりません。
4. 組織採取、調製および処理
- 調理
- マウスの安楽死および組織採取のためのすべての解剖器具と必要な溶液(例:麻酔、PBS中の4%パラホルマルデヒド[PFA])を準備してください。
- 事前に4%のPFAを準備し、冷凍保存し、使用の24時間以内に解凍してください。灌流前に溶液が十分に冷却されていることを確認してください。
注意:PFAは有毒です。適切な個人用防護具(PPE)と訓練を受けたフムフード内でのみ取り扱ってください。 - 致死量のペントバルビタール(100〜200 mg/kg、腹腔内投与)を投与して動物を麻酔します。足の指をつまむ反射がないことで深麻酔を確認し、反射が続く場合は、追加の投与を行います。
- 心内灌流
- 動物を解剖装置に位置づけて固定します。鉗子を使って腹部の皮膚を持ち上げ、ハサミで上昇方向の垂直切開を行います(図2A、ピンクの矢印)。
- 浅い筋膜を持ち上げ、肝臓が見えるように上切開を行い、腹部臓器の損傷を防ぎます。
- 横隔膜を水平に切り、切開部を腋窩に向かって伸ばします(図2A、白い矢印)。胸郭壁を反射してピンバックします。
- 左心室の頂点に灌流針を挿入し、心室壁を貫かないように注意します。右心房に細いハサミで小さな切開を入れます(図2B)。
- 1〜2 mL/分の流量で50 mLの氷冷4%パラホルマルデヒド(PFA)を用いて心裏灌流を開始します。
注:冷たい溶液はしばしば尾の巻き上げや筋肉の痙攣を引き起こし、良好な灌流の指標となります。
- 脳解剖
- 脳を完全に浸すのに十分なPFA4%を含むチューブを準備します。大きなハサミでネズミの首を切り落とす。遺体は密閉されたバイオハザードバッグに入れて焼却処理してください。
- 頭皮を反射させて頭蓋骨を露出させる。大孔を特定し、脳に平行に細いハサミで横切って頭蓋骨の除去を開始します(図2C)。
- 反対側でも繰り返し、次に嗅球の上にある目の間の頭蓋骨を切ります。
- 頭蓋骨を小脳から嗅球の方へ持ち上げて脳を露出させます。ヘラを使って脳を後方から前方へ慎重に取り出し、4%のPFAに4°Cで24時間以内に浸します。
- 埋め込み溶液をPBS中に20%〜30%ショ糖に置き換え、浸透が完了するまで4°Cで培養します。脳は最初は浮かび上がり、完全に浸潤すると通常24時間以内に沈みます。浮いている場合は、培養期間を延長してチューブの底に沈みます。
注:このクライオプロテクション工程は、組織の水分含有量を減らし、アーティファクトの凍結を最小限に抑えます。
脳とチューブを優しく乾燥させ、さらに使用するまで-80°Cで保存します。
- クライオセクシングと浮遊組織採取
- 断片処理前に、クライオスタットを-20°Cと希望の厚さに設定します。
注:線条体に関しては、厚さ20〜25μmの冠状切片が構造保存と抗体浸透性の理想的な妥協点を提供し、取り扱いに適した堅牢な断片でありながら、高い染色品質と空間分解能を保ちます。最適な厚さは細胞構造によって異なるため、他の脳領域についてもクライオセクション条件を指定する必要があります。小脳では、矢状面25〜35μmの切断が一般的に推奨されており、この厚さは小脳皮質の層状組織を保つことができます。 - 脳をドライアイスで運び、クライオスタット内で5〜10分間平衡させます。このステップは組織の損傷を防ぐために重要です。
- 嗅球をメスで取り除き、柔らかくて切りやすいものが望ましいです。新たにO.C.T.をエンドウ豆大の滴を標本ディスクに落とし、小脳を接触させます(図1D)。コロナ切片のために脳の位置を整えてください。凍結したら、追加のO.C.T.を加えて脳全体を埋め込みます。
注:O.C.T.は室温では透明ですが、完全に凍結すると不透明な白色になります。光沢が残るなら、クライオスタットでさらに冷凍時間を確保してください。 - 標本ディスクをホルダーに取り付け、線条体(両半球に2つの白い円)が見えるまでトリミングします。もし半球に異なる治療を受けた場合は、片方の半球を針で刺して向きを保ちます。後で分析するために記録しておけ。
- セクション化モードに切り替え、細かいブラシや焼火で研磨されたガラス製パスツールピペットを使って、48ウェルプレートに浮遊区画を採取します。
注意:フリーフローティング法は抗体浸透を改善し、背景を減らし、長期保存を可能にし、均等間隔の断片を確保して完全な線条状体被覆を実現します。 - 井戸に0.05%アジドナトリウムを含むPBSを充填します。
注意:アジドナトリウムは有毒です。PPEで取り扱い、廃棄物は適切に処分してください。 - 最初の区間をA1井戸に、2番目の区間をA2に置き、順に進みます。プレートが満タンになったら、新しいプレートで続けるか、ウェルA1に戻り、線条体全体が切断されるまで進めます(~3枚の48ウェルプレート)。プレートを透明膜で密封し、使用まで4°Cで保存します。
注:全線条体解析では、プレートから1カラムを選択すると、領域全体を代表する均等間隔の断片が得られます。
- 断片処理前に、クライオスタットを-20°Cと希望の厚さに設定します。
5. DAB染色を用いた免疫組織化学
- 残留するアジドナトリウムを除去するために、PBSで3回の断片を洗い流します。フェニルヒドラジン溶液(PBS中0.2 - 0.3 mg/mL)で37°Cで30分間培養します。
注意:フェニルヒドラジンは発がん性があります。この作業はフームフード内で行い、廃棄物は有害として処分してください。 - PBSで3回、5分、10分、10分ずつ順に洗います。組織をRTで1時間ブロックし、10%の正常ヤギ血清(NGS)と0.1%のTriton X-100を含むPBSでブロックします。
- 推奨希釈濃度(例:マウス抗タキシン2、ブロッキング溶液中の1:1000)で一次抗体を4°Cで一晩培養し、穏やかな攪拌のもとで。PBSで3回、5分、10分、10分ずつ順に洗います。
- ビオチン化二次抗体(ブロッキング溶液中の1:200)をRTで2時間、穏やかに攪拌しながら培養します。PBSで3回、5分、10分、10分ずつ順に洗います。
- ABC複合体内で30〜40分間RTで培養します。PBSで3回、5分、10分、10分ずつ順に洗浄します。
- DAB溶液を新鮮に準備します:超純水2.5mLにバッファー1滴を加えてボルテックスを。DABとボルテックスを2滴追加;H₂O₂を1滴加えて、再び渦を巻きます。
注意:DABは発がん性があります。排気フードで取り扱い、廃棄物は適切に処分してください。 - DAB溶液で各断片を個別に発現し、所望の染色強度(通常1〜10分)に達するまで続けます。反応をすぐに止めるためにPBSに転送してください。
注:DAB反応性は時間とともに低下します。効率的に働きましょう。一度に複数のセクションが井戸内に入っている場合は、それらが接触しないようにしてください。接触していると染色プロセスに影響が出ます。 - PBSで3回、5分、10分、10分ずつ順に洗います。ゼラチンコーティングされたスライドにセクションを取り付け、完全に乾燥させます。グラファイト鉛筆でスライドにラベルを貼るのは避けてください。画像処理の妨げになる可能性があります。
- 脱水、クリア、カバースリップは以下の通りです:蒸留水に30秒浸し、エタノールシリーズで脱水:75%、96%、100%(それぞれ3分)。キシレン代替品で5分間クリアし、自然乾燥させます。カバースリップは速硬化性のマウントメディウムで塗り、イメージングや保管前に少なくとも24時間フュームフード内で硬化させます。
6. FIJIを用いたマウス線条体におけるDARPP-32減少体積の定量化(ImageJ)
- 画像取得
- 紋状体全体にわたる冠状脳断片の画像を撮影します(約ブレグマ+1.0から–0.5 mm)。一定の照明、倍率(例:10倍)、解像度を維持しましょう。画像はTIFF形式で、ファイル名を連続したもの(例:Striatum_Bregma_+0.5.tif)で保存します。
- フィジーにおける画像準備
- フィジーで各画像を開いてください。ピクセルサイズのキャリブレーション:「分析」へ進 >「スケール設定」へ。マイクロメートルや画像メタデータの既知のスケール(例:1ピクセル=1μm)を使用します。
- 画像を8ビットに変換する: 画像>タイプ>8ビット。 必要に応じて明るさやコントラストを調整して、減少した領域を最適に表示してください(この段階での閾値設定は避けてください)。
- ROIの枯渇面積の選択
- ポリゴン、フリーハンド、またはブラシツールを使って、DARPP-32が枯渇した領域(通常は薄いか、線条体の染色がありません)を描き出します。面積をμm2で記録するには「Analyze > Measure」へ行ってください。
- ROIを保存するには ROIマネージャー> Add > More > 保存 またはマルチメジャー機能を使ってバッチ分析を行います。
- 関連するすべての脳のセクションでこれを繰り返します。
- 枯渇体積の計算
- 各セクションの減少面積にセクション間の距離(通常は120〜240μm、セクションの厚さや間隔によります)を掛けます。
セクションあたりの体積(mm3)= 枯渇面積(mm2) × セクション間隔(mm) - すべてのセクションの体積を合計してください:
総消耗体積(mm3)= Σ(×区間面積) - オプション:視覚化のためのオーバーレイ。 ROI>画像オーバーレイ> を使って、セクション間の枯渇領域を可視化します。図形の要約画像やアニメーションをエクスポートしてください。
- 各セクションの減少面積にセクション間の距離(通常は120〜240μm、セクションの厚さや間隔によります)を掛けます。
- 正確な頭尾のマッピングのために、必ずマウスブレインアトラスでアライメントを確認してください。片側効果(例:WTと変異注射)を区別するために、各半球を個別に分析してください。
7. マウスの線条体におけるタンパク質集合体の定量化
- FIJIを用いた手動定量化
- 画像を読み込み、キャリブレーションしてください。フィジーで画像を開いてください。ピクセルサイズのキャリブレーション(メタデータを含む画像を使う場合はこのステップを省略してください)。
- 「 Analyze > Set Scale 」に移動し、既知距離(例:1ピクセル=0.5μm)を入力してください。FIJIでは、 プラグイン> セルカウンター>セルカウンター>解析へ進みます。「 初期化 」をクリックし、画像を選択してください。
- アグリゲートにはマーカータイプ(例:タイプ1)を選択します。見える集約体を手動でクリックしてラベル付けしてください。記録データ:FIJIはセルカウンターパネルにカウントを表示します。各画像やセクションごとに記録数を付けてください。エクスポートカウントは手動で行うか、マクロを使って結果をまとめる方法もあります。
- IHCAggreCountを用いた半自動定量化
- 画像をアップロードし処理します。IHCAggreCountを開き、「 画像のアップロード 」(補足図1)をクリックしてください。
注:IHCAggreCountアプリケーションは、顕微鏡画像からの細胞集合体の定量化を効率化・標準化するために、当研究室が独立した科学ツールとして開発しました。このソフトウェアは完全にPythonで構築され、画像処理、処理、選択補正、測定計算などを分離したモジュラーアーキテクチャを採用しています。IHCAggreCountはWindows 10およびWindows 11、さらにmacOS 13 VenturaおよびmacOS 14 Sonomaと完全互換であり、両プラットフォームで成功裏にテストされています。従来の手動画像検査手法と比較して、このソフトウェアは大きな解析上の利点を提供します。ユーザーの主観性を減らし、繰り返しの手作業を排除し、画像処理を高速化し、再現可能な測定を保証し、一貫した関心領域抽出を可能にし、複数の環境をバッチ処理できるという点です。全体として、このアプリケーションは従来の手動方式よりも高速で客観的かつ堅牢な球状検出と定量ワークフローを提供します。申請書は、著者から合理的な要望があれば入手可能です。 - 画像はオリジナル画像表示に表示されます。処理タブに移動し、HiLoを適用してアグリゲートや背景コントラストを強化します(補 足図2参照)。背景からアグリゲートをフィルタリングするために明度閾値を適用します(補足図3参照)。最小サイズフィルターを使って小さな粒子(ノイズ)を除去します(補足図4)。非集合形状を除外するために、円度閾値を適用することも可能(補足図5参照)。
- IHC集約率検出については、一般タブの「 総集計数の計算 」および 「集計面積の計算 」をクリックしてください。検出されたすべての集約体はハイライトされ、マトリックステーブル(ID、面積、平均サイズ; 補足図6)。
- 画像をアップロードし処理します。IHCAggreCountを開き、「 画像のアップロード 」(補足図1)をクリックしてください。
- 手動補正(オプション)
- 訂正タブに移動し、Smart Addを使って選択した地域の集約を自動検出します(補足図8参照)。手動で追加してアグリゲートにラベルを付けましょう。不要なラベルを削除するにはSmart Deleteを使ってください。(ハイライトされた骨材は視覚的に表示されます。 補足図7)。
- 輸出結果
- 現在の画像データをエクスポートするには 「CSVエクスポート 」をクリックしてください。「 すべてエクスポート 」をクリックすると、複数の解析画像からデータをバッチエクスポートできます。IHCAggreCountの実験群間で、同じ明るさ/コントラスト設定やその他のパラメータ(例:閾値)で画像を分析する際には常に行ってください。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
本研究は、本プロトコルを用いてアタキシン-2およびDARPP-32の発現を成功裏に特定しました。C57BL/6Jマウスの紋状体にレンチウイルスベクターを立体注射した後、12週間後に 野生型 および変異型アタキシン-2の強発現が検出されました。これらの構成要素がニューロンに特異的であることを12 件示しており、実質的に1 mm3あたり平均20,000個のニューロンを変換していることが示されました。実験条件下で、アタキシン-2の免疫染色により、離散的な包有物を形成しない 野生型 アタキシン-2の拡散的な細胞質分布が明らかになりました(22Q; 図3A、黄色の矢印)。対照的に、変異型アタキシン-2(104Q)は球状の形態を持つ細胞質集合体を示しました(図3B、赤い矢印)。これらの集合体は、野生型で観察された均一な細胞質染色とは明確に区別される、明確に定義...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
本記事では、polyQ SCAに対する線条体レンチウイルスマウスモデルの生成について説明しています。また、 野生型 および拡張型の致病タンパク質をコードする高価レンチウイルスベクターの産生や、立体誘導手術によるマウス線条体へのLVの両側注射も記述しています。さらに、脳の採取手順、組織学的処理、疾患の特徴の画像に基づく定量化についても説明しています。これらの手法を組み合わせることで、線条体におけるタンパク質凝集体や神経マーカーの喪失を示すレンチウイルスpolyQ SCAマウスモデルの作成が可能となり、これは他の脳領域にも応用可能です。このプロトコルの主な目的は、疾患モデリングに不可欠な要素として神経病理学的特徴を特徴づけることですが、対象となる脳領域によっては行動の変化が生じることもあります。紋条体におけるレンチウイルス媒介の変異アタキシン-2発現は、変異アタキシン-2を注入したマウスの野外実験で、野生型アタキシン-2注射または非注射対照群と比較して運動活動お...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。
謝辞
クレビオ・ノブレガの研究室は、Cure CSBプロジェクト、スロベニアのヴィリェム・ユリヤン希少疾患小児協会、アルガルヴェ生物医学センター研究所(ABC-Ri)から資金提供を受けています。本論文の著者の一部は、Fundação para a Ciência e Tecnologia(FCT)による博士課程フェローシップを受けており、参考文献はTiago Moreira-Gomes(2022.11008.BD 年)、Inês T Afonso(2022.10161.BD 年)、Rafael G. Costa(2022年)です。11973.BD)。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl | ローカルサプライヤー | — | 麻酔および拮抗剤の混合物の調製に使用 |
| 100 mm 組織培養皿 | SPL ライフサイエンス | 11090 | |
| ABC キット (アビジン-ビオチン複合体) | VECTASTAIN Elite | ||
| アティパメゾール (5.0 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | メデトミジンの拮抗剤 |
| 卓上遠心機 | - | - | |
| バイオセーフティキャビネット、クラス II (BSL-2 準拠) | - | - | |
| ビオチン化二次抗体 | - | - | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | NZYTech | MB47002 | |
| 脳切片 (例：30–40 µm 冠状切片) に DARPP-32 で免疫染色 | - | - | |
| セルカウンタープラグイン (FIJI) | 組み込み / ImageJ | — | 手動集合体カウント用ツール |
| CO2 インキュベーター (37 °C、5% CO2、湿潤) | - | - | |
| コンピューターワークステーション | ローカルサプライヤー | — | 画像処理とソフトウェア実行に使用 |
| コーン形超遠心管 | Beckman Coulter | 358126 | |
| 綿棒 | ローカルサプライヤー | — | 骨膜の除去に使用 |
| 標本ディスクホルダー付きクライオスタット | - | - | |
| DAB (ジアミノベンジジン) | - | - | |
| デジタルステレオタキシック座標リーダー | Stoelting/WPI | 51725 | 座標測定用デジタルディスプレイ |
| デュルベッコ改変イーグル培養基 (DMEM、高グルコース) | Gibco/Thermo Fisher | 11-965-092 | |
| エタノール 70、96、100% | - | - | |
| エタノール、70% | ローカルサプライヤー | — | 頭皮消毒用 |
| フェンタニル (0.05 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | 麻酔成分 |
| 胎児ウシ血清 (FBS)、熱不活化 | Gibco/Thermo Fisher | 10500064 | |
| FIJI (ImageJ 配布版) | NIH / ImageJ | https://fiji.sc/ | 集合体の手動定量用オープンソースソフトウェア |
| 爪楊枝 (足指ツイッチャー用) | ローカルサプライヤー | — | 麻酔深度モニタリング用 |
| フルマゼニル (0.1 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | ミダゾラムの拮抗剤 |
| 鉗子とメス | ローカルサプライヤー | — | 骨膜の除去と頭蓋骨露出用 |
| ハミルトン 700/1700 シリーズ マイクロリットル/ガスタイトシリンジ | Hamilton / Fisher Sci. | 7653-01/10550203 | ウイルス溶液のローディング用 |
| ハミルトン スモールハブ取り外し可能針 (26G) | Hamilton / Fisher Sci. | 7804-03/ 10698205 | ウイルス送達用 |
| 加熱パッド (げっ歯類用) | Kent Scientific / SOMNI | 例：04-777-177 | 体温維持用 |
| HEK 293T 細胞 (≤ 通過数 10、マイコプラズマ不在) | ATCC または同等 | CRL-3216 | |
| 過酸化水素 | - | - | |
| IHCAggreCount ソフトウェア | 要求に応じて提供 | N/A | 集合体の半自動検出と定量用社内専用ソフトウェア |
| 倒立顕微鏡 (細胞の密度用) | - | - | |
| ラボボルテックスミキサー | - | - | |
| レンチウイルスベクター (WT と変異体) | 社内 / コア施設 | N/A | 注射用ウイルス溶液 |
| L-グルタミン (200 mM) | Gibco/Thermo Fisher | 25030081 | |
| カメラ付き光学顕微鏡 (ブライトフィールド) | - | - | |
| メデトミジン (1.0 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | 麻酔成分 |
| マイクロドリル (ステレオタキシック互換) | Stoelting / ローカルサプライヤー | — | 頭蓋骨開頭用 |
| マイクロ注入ポンプ (例：Stoelting) | Stoelting/WPI | 53210 | ウイルス注射用自動注入ポンプ |
| マイクロピペット (P1000、P200、P10) とチップ | - | - | |
| 顕微鏡画像 (IHC 切片) | 社内生成 | N/A | 分析する免疫組織化学画像 |
| ミクロトームブレード (低プロファイル、使い捨て) | - | - | |
| ミダゾラム (5.0 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | 麻酔成分 |
| 実装メディア | - | - | |
| ナロキソン (0.4 mg/mL) | ローカルサプライヤー | — | フェンタニルの拮抗剤 |
| 針ホルダーと細かい解剖針 | - | - | |
| 正常ヤギ血清 (NGS) | - | - | |
| O.C.T. 化合物 | Tissue-Tek | ||
| 眼科用軟膏 (ベパンテン眼科用軟膏、5% デキスパテン) | バイエル | 11568-0053 | 手術中の角膜乾燥を防ぐ |
| オービタルミキサー | - | - | |
| p24 ELISA キット | ZeptoMetrix | 0801111 | |
| パラフィルム | - | - | |
| パラホルムアルデヒド (PFA) | - | - | |
| PBS | - | - | |
| PBS (Ca2+/Mg2+ なし、pH 7.0) | Gibco/Thermo Fisher | 10-010-031 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | Plasmid #12263 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (100×) | Gibco/Thermo Fisher | 1514 |
参考文献
- Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
- Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
- McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
- Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
- Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
- Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
- Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
- Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
- Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
- Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
- Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
- Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
- Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
- Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
- Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
- Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
- Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
- Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
- Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
- Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
- Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
- de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
- Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
- Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
- Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
