血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム

Summary

本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。

Abstract

血栓症は、血管内に血小板や凝固因子が異常に蓄積することを記述する病理学的状態です。多くの研究が血栓症の基礎的なメカニズムとして可溶性作動薬による血小板活性化に焦点を当てていますが、血流が血栓形成を促進することもしばしば見落とされがちです。特に動脈では血栓症は動脈狭窄と関連しており、これにより血流のせん断応力が上昇し、血栓形成の過程が促進されます。この現象は生体力学的血栓形成と呼ばれます。長い間、生体力学的血栓形成の過程について包括的かつ詳細な洞察を提供するバイオアッセイは存在しませんでした。これに対処するため、マイクロフルイディクスと多色蛍光イメージングを組み合わせた血栓プロファイリングアッセイが開発され、血栓の大きさや組成、血小板活性化レベルをカバーする7つの読み取り結果により生体力学的血栓形成の包括的な特徴付けが可能となりました。この血栓プロファイリングアッセイは、ヒトにおける血栓促進傾向や抗血栓薬の有効性を評価するために用いられ、動脈血栓症のメカニズムの理解を深めるためにも有用です。

Introduction

血栓症は心血管疾患の主な原因であり、毎年世界中で何百万人もの死亡の原因となっています^。現在、血栓症リスクを評価する標準的な臨床現場でのバイオアッセイは利用されていません。市販化された検査室および現場での血液機能測定法の中で、従来の凝固検査や凝集測定法は血栓症や重大な心血管有害事象の予測に信頼性がないことが証明されています(^2,3,4)。全局血栓症検査⁵、PFA-100/2006、および全局凝固試験^{7、8、9、10、11}も、その性能を裏付けるデータは限定的です。

現在の理解に基づき、血栓形成の過程は主に3つのメカニズムによって寄与しています。従来認められている生化学的血小板凝集と凝固の2つのメカニズムに加え、3つ目のメカニズムとして、せん断駆動の血小板凝集(「生体力学的血小板凝集」とも呼ばれた)があります^12,13。生体力学的血小板凝集において、高いせん断応力とせん断勾配が、GPIbα-フォン・ヴィレブランド因子(VWF)、インテグリンα_IIbβ 3-VWF、インテグリン α_IIbβ₃-フィブリノーゲン相互作用による血小板架橋の主な駆動力となります。動脈血栓症において、生体力学的血小板凝集は最も重要なメカニズムであると考えられます。動脈狭窄による高いせん断流によって大きく強化されているためです。したがって、生体力学的血小板凝集による血栓形成は「生体力学的血栓形成」と呼ばれました^12,14。

過去の研究では、生体力学的血小板凝集を実験的に観察する一般的な手法としてマイクロ流体狭窄アッセイがあり、重度の狭窄部位を直線的なチャネルに埋め込む方法である。生理的な壁せん断応力の下で血流がチャネルに灌流されると、狭窄部位周辺に病理的に高いせん断応力が発生し、血小板の蓄積を促して血栓を形成します。しかし、以前の研究では血小板に対して血栓の大きさを反映した15,16,17,18,19、最大でも1つ(血小板用と別のバイオマーカー用)^13,20のみを使用しており、血栓の包括的な特徴解析はできませんでした。

最近開発された血栓プロファイリングアッセイは、マイクロ流体狭窄アッセイに多色蛍光イメージングを取り入れ、7つのバイオマーカー(血小板、フィブリノーゲンレベル、フォン・ヴィレブランド因子レベル、P-セレチン発現レベル、ホスファチジルセリン曝露レベル、拡張インテグリンα_{IIbβ 3発}現レベル、完全活性インテグリンα_IIbβ₃)をリアルタイムで追跡します発現レベル)を形成し、生体力学的血栓形成を包括的に特徴づける基盤^{となります。}本研究では、血栓プロファイリングアッセイの調製と実施、および関連するデータ解析に関する詳細なプロトコルが提供されています。アッセイに必要なハードウェアには、逆さまの多色蛍光顕微鏡とマイクロ流体システムが含まれます。このアッセイは比較的少量のヒト全血(2 mL未満)を使用し、コスト効率が高く(サンプルあたり約12ドル)、30分以内に結果を導き出します。このアッセイは、個人の多次元的な血栓前異常を正確に検出し、血栓の大きさ、組成、血小板活性化状態を変化させる抗血栓薬の効果を評価することができ^{、将来的に}研究および臨床目的での広範な応用を支持します。このアッセイは新たに採取したヘパリン化血液を使用する必要がある点は注目に値します。血液を4°Cで保存するか、6時間以上保管するか、ヘパリン以外の抗凝固剤を使用すると、血栓形成を防ぐか、結果が誤りとなります。

Protocol

このプロトコルはテキサス大学医学部の人間研究倫理委員会のガイドラインに従い、承認されています。実験用ハードウェア構成は、マイクロ流体装置、灌流部品(コネクター、チューブ、シリンジ、シリンジポンプ)、そして明視野および多色蛍光イメージングを可能にする光学部品を備えた倒立顕微鏡で構成されています。顕微鏡ではマルチLED灯台とマルチパスフィルターキューブを用いて、相互に漏れを最小限に抑える4つの蛍光チャンネルを分割します:励起度:391/32、479/33、554/24、638/31、そして放射:435/30、519/25、594/32、695/58です。すべての実験処置では、手袋、目保護具、実験用ジャケットなどの個人用防護具を着用してください。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. マイクロ流体デバイス準備

1. マスターモールドは、長方形のチャネル(幅200μm×高さ50μm)を含み、80%の光の狭窄部分を組み込むように設計します。各チャンネルにはチューブ接続用の専用のインレットとアウトレットがあります(図1;元の設計ファイルは 補足ファイル1 を参照)。
2. 設計に基づき、シリコンウェハーを用いて標準的なフォトリソグラフィー で SU-8フォトレジストマスターモールドを製造します。型を15cmのペトリ皿の底にテープで貼り付けます(図2A参照)。
3. PDMS混合物は、シリコーンエラストマーキット内でプレポリマーベースと硬化剤を10:1の重量比で混合して調製します。混合物をマスターモールド(図2B)に注ぎます。
4. PDMS混合物を含む板を真空乾燥器に入れて脱ガスし、閉じ込められた気泡を除去します。
   注意:気泡が完全に除去されるまで、プレートは最低2時間真空で保温してください。
5. PDMS混合物は75°Cで2時間培養して熱硬化します。
6. マスターモールドから硬化したPDMSを慎重に切り出し(図2C,D)、個々のチップユニットに区切ってください。
7. プローブニードルを使って指定された場所に穴を開けて、入口と出口を作ります(図2E)。
   注意:パンチした穴に残ったゴミを取り除くには圧縮空気ダスターを使用してください。表面汚染を最小限に抑えるために、接着前にPDMSデバイスを接着テープで洗浄してください。
8. 化学フードで75%エタノールをタスクワイプにスプレーし、濡らしたタスクワイプでガラススライドを拭き掃除します。ガラススライドは乾かすまで放置してください。
9. 化学フード内では、ガラススライドとPDMSチップをそれぞれ高周波発生器で30秒と20秒処理し、その後各チップをガラススライドで整列させます。チップをガラススライドの表面に優しく押し付けて、バインドできるようにします。
   注意:この工程は化学フード内で行う必要があります。なぜなら、高周波発生装置は使用中にオゾンを発生させ、健康に有害だからです。
10. 150°Cで15分間培養して熱接着します。冷却後、デバイスは使用可能になります(図2F)。
11. デバイスを室温のホコリのない環境で保管してください。
12. ピンサーでプローブ針のプラスチック部分を取り除き、金属管を90度に曲げます。これらの曲げ管はマイクロ流体デバイスのコネクターとして使用されます。

2. 蛍光センサーの準備

注:この実験は合計7つの蛍光センサーを使用します:SZ22-FITC、フィブリノーゲン-Alexa Fluor 405、2.2.9-Alexa Fluor 555、AK4-Alexa Fluor 647、Annexin V-Pacific Blue、MBC 370.2-Alexa Fluor 555、PAC-1-Alexa Fluor 647。その中でも、フィブリノーゲン、2.2.9、MBC 370.2は市販されている非共役形態のみであり、実験室で蛍光共役する必要があります。

1. アレクサフルオ405とフィブリノーゲンの共役を組み合わせる方法:
   1. 新たに0.1Mの重炭酸ナトリウムバッファー、pH8.5を作ります。
   2. フィブリノーゲンストックをリン酸塩緩衝塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4)に希釈して1 mg/mLにします。
   3. フィブリノーゲン溶液に炭酸水素ナトリウムバッファーを1/10の量に加えます。
   4. 1 mLのフィブリノーゲンと1 mgのAlexa Fluor 405 NHS-エステルを混合し、室温で回転子に1時間培養します。光から守る。
   5. 1,100 × g で2分間遠心分離してカラムを分離し、フロースルーを廃棄します。反応溶液をカラムに装填し、カラムを適合する収集バイアルに取り付け、1,100 × g で遠心分離機をかけて5分間、フィブリノーゲン-Alexa Fluor 405を収穫します。
   6. 分光光度計を使って、280 nm(A₂₈₀; タンパク質信号)および405 nm(A₄₀₅; 染料信号)波長の吸光度を測定します。タンパク質濃度とF/P比(蛍光:タンパク質モル比)を計算します。
      注意:F/P比率は8〜10の範囲に置くべきです。
   7. フィブリノーゲン-Alexaフルオ405は暗闇で4°Cで保存してください。
2. Alexa Fluor 555と2.2.9抗体およびMBC 370.2抗体の共役抗体:
   1. 新たに0.1Mの重炭酸ナトリウムバッファー、pH8.5を作ります。
   2. 抗体ストックをアミンフリーバッファーで1 mg/mLに希釈します。
   3. 抗体溶液に炭酸水素ナトリウムバッファーを1/10の体積に加えます。
   4. 100μL抗体とAlexa Fluor 555 NHS-エステル1バイアル(100μg)を混合し、室温でローテーター上で1時間培養します。光から守る。
   5. 1,100 × g で2分間遠心分離して、精製カラムから貯蔵バッファを取り出し、フロースルーを廃棄します。反応溶液をカラムに搭載し、カラムを対応する収集バイアルに取り付け、1,100 × g で5分間遠心分離して2.2.9またはMBC 370.2-Alexa Fluor 555を収穫します。
   6. 分光光度計を使って、280 nm(A₂₈₀、タンパク質信号)および555 nm(A₅₅₅:染料信号)波長での吸収を測定します。抗体濃度とF/P比(蛍光:抗体モル比)を計算します。
      注意:F/P比率は1〜1.5の範囲であるべきです。
   7. 2.2.9とMBC 370.2-Alexa Fluor 555を暗闇で4°Cの温度で保存してください。
      注意:過剰表示は避けてください。高いF/P比は生物学的機能を損なう可能性があります。

3. ヒト被験者からの血液採取

注意:この処置は資格を持つ医療従事者(例:有資格看護師、認定採血技師)によって実施されなければなりません。また、研究参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得してください。

1. 注射器を準備するには、10 mLの血液10 mLあたり0.32 U/mLヘパリンを含む500 μLのタイロド緩衝液(12 mM NaHCO₃、10 mM Hepes、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、5.5 mM D-グルコース、0.5%牛血清アルブミン、pH 7.4)を吸引します。
2. 静脈穿刺 で 血液を集める。空の注射器を使って最初の2mLの血液を採取し、捨てます。その後、ヘパリン入りの注射器に切り替えて血液サンプルを採取します。注射器をゆっくり引き抜いて血小板の活性化を最小限にしてください。
3. 採取した血液を15mLの遠心分離機チューブに移し、37°C以下に保ちます。
   注意:血液サンプルは採血後6時間以内に実験に使用してください。

4. 血栓プロファイリングアッセイ

注意:血液の取り扱いに関するすべての処置は、可能な限りバイオセーフティキャビネット内で行うことが推奨されており、被験者への血液のこぼれを防ぐためです。それが難しい場合は、ベンチトップのスプラッシュシールドを使いましょう。

1. VWFモノマーをPBS中で2 μg/mLに希釈します。マイクロ流体デバイスにVWFモノマーをプリコーティングし、室温で1時間インキュベーションします。
2. 蛍光センサーセット1または2を室温で10分間培養します:
   1. セット1:SZ22-FITC(0.5 μg/mL)、フィブリノゲン-Alexa フルオリ405(60 μg/mL)、2.2.9-Alexa フルオリウム555(1 μg/mL)、AK4-Alexa フルオナ647(1 μg/mL)。
   2. セット2:SZ22-FITC(0.5 μg/mL)、Annexin V-Pacific Blue(1 μg/mL)、MBC 370.2-Alexa フルオナ55(1 μg/mL)、PAC-1-Alexa Fluor 647(1 μg/mL)。
      注:2つのセンサーセットを別々に使用する必要があるため、各血液サンプルは少なくとも2回(センサーセット1とセンサーセット2で1回)検査し、完全なデータセットを取得する必要があります。
3. マイクロ流体装置をインレットとアウトレットのコネクターとチューブで接続します。インレットコネクターのもう一方の端にはPBSが入ったチューブを、もう一方の端を注射器で接続します。注射器を注射器ポンプに取り付けます。マイクロ流体装置を倒立顕微鏡に取り付け、手動でステージを操作して顕微鏡下の狭窄部位を見つけます(図3A)。
4. マイクロフルイディックチャネルとチューブにPBSをシリンジポンプで0.5 mL/minの流量で充填します。狭窄部位の周囲に気泡がないか確認してください。
5. 入口チューブと血液サンプルを接続し、シリンジポンプを使ってマイクロ流体チャネルに血液サンプルを0.018 mL/minの流量で灌流します(図3A)。
6. 各蛍光チャネルの露光時間とゲインを設定します。4つのチャネルを交互に切り替え、1種類の蛍光分子を励起させることでリアルタイムの多色蛍光イメージングを行います。その間に血栓の焦点面を見つけ、狭窄部位で通常15〜30分の信号を記録します(図4)。
   注意:各チャンネルの露光時間を調整し、蛍光信号を容易に識別しつつ飽和を避ける必要があります(図4)。現在のシステムでは、健康な被験者の血液サンプルは通常、形成された血栓内で以下の信号強度範囲を示します:SZ22-FITC、70-110;線維原-アレクサ・フルオリウム 405, 60-100;2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110;AK4-Alexa フルア 647, 45-75;付属書V-パシフィックブルー、35-65;MBC 370.2-Alexa フルー 555, 45-85;PAC-1-アレクサ・フルー647、10-30。しかし注目すべきは、健康な被験者のごく一部が非典型的な数値を出すことです。したがって、各チャネルの曝露時間が適切に選ばれるかを確認するために、少なくとも5人の健康な被験者の血液サンプルを検査することが推奨されます。

5. データ分析

1. ImageJ 1.53(フィジー国立衛生研究所)を使ってデータファイルを開きます。
   注意:各ファイルには4つの異なるチャンネルから合計4本の動画が含まれている必要があります。以下の手順は、ユーザーが分析したい任意の時間点に一般的に適用されます。
2. SZ22-FITCチャネルを使って血栓の輪郭を特定し、「ポリゴン選択」を使って血栓の大まかな領域を選びます(図5A,B)。
3. 各チャンネルでは、 画像-> 調整->閾値 を使って背景を除去し(図5C)、次に 「分析->測定 」を使って血栓内の信号の面積と平均強度を測定します。
   注:SZ22-FITは血小板を染色するため、血栓の大きさを反映します。セット1では、フィブリノーゲン-Alexaフルオ405はフィブリノーゲン濃縮レベルを反映し、2.2.9-Alexaフルオフル555はフォン・ヴィレブランド因子(VWF)濃縮レベルを、AK4-Alexaフルオフル647はP選択発現を反映しています。セット2では、アネクシンV-Pacific Blueはホスファチジルセリン(PS)曝露を反映し、MBC 370.2-Alexa Fluor 555は拡張構造(E⁺ α_IIbβ₃)へのインテグリンα_IIbβ₃の活性化を反映し、PAC-1-Alexa Fluor 647はインテグリンα_IIbβ₃の完全活性化を反映します(Act. α_IIbβ₃)²¹。

Results

血栓プロファイリングアッセイは、狭窄チャネルを通じて血液を灌流し、せん断駆動の血栓形成を可能にし、形成された血栓に関する多次元情報をリアルタイムで多色蛍光画像で収集します。セット1とセット2の両方のセンサーを用いて実験を行うことで、血栓の大きさ、架橋タンパク質の濃縮(フォン・ヴィレブランド因子、フィブリノーゲン)、さらに血小板活性化レベル(P選択発現、PS曝露、インテグリンα_IIbβ₃ 活性化に反映)などの側面で血栓を特徴付けることができるはずです²¹。

各実験から収集されたデータは、信号と「信号 」をレンダリングするために徹底的に分析できます。時間曲線(図 6参照)。しかし、これは時間がかかります。あるいは、単一の時間点、つまり各チャンネルに1枚の画像を選んでデータ解析を行うこともできます。例えば、血栓発生から7.5分後は通常、健康な血液の血栓が...

Discussion

マイクロ流体狭窄アッセイと多色蛍光イメージングを組み合わせることで、血栓プロファイリングアッセイは生体力学的な血栓形成および血小板メカノバイオロジーの研究に便利かつ強力なアプローチを提供します。一方で、このアッセイは幅広い用途で有用です。例えば、生体力学的血小板凝集を特異的に阻害する抗血栓薬のスクリーニングに用いられ、分子標的と作用機序は効果バーコード²¹から推測できます。また、特定の集団における血栓促進傾向を研究し、心血管疾患のリスク因子の影響を特定し特徴づけ、個人の血栓促進傾向を評価するためにも利用できます。血栓プロファイリングアッセイは、個人の血栓促進傾向を評価し、患者に対する個別化抗血栓治療レジメンの開発を支援する臨床翻訳において有望であると考えています。

血栓プロファイリングアッセイは多用途です。分子センサーはカスタマイズに応じて自由に変更・取り外し可能です。例えば、実験者が血栓の大きさとE⁺ α_IIbβ_...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mLシリンジ	ヘンケ・サス・ウルフ	5100-X00V0	血液サンプルの採取
15mLファルコンチューブ	ジェネシー・サイエンティフィック	28-101	血液サンプルの保管
1mL ガス密閉ガラスシリンジ	ハミルトン	81331	ハードウェアアセンブリ
2.2.9	MERU VasImmune		血栓染色
20本×1/2プローブ針	マクマスター・カー	M919	PDMSデバイスの製作
20mLシリンジ	ヘンケ・サス・ウルフ	5200-X00V0	血液サンプルの採取
70%エタノール	シグマ・オルドリッチ	EX0281-1	ガス密閉注射器の消毒とガラススライドの洗浄
AK4-アレクサ・フルー 647	バイオレジェンド	304918	血栓染色
アレクサ・フルア・フルー 405 NHS エステル	インビトロジェン	A30000	フィブリノーゲン標識
Alexa fluor 555抗体標識キット	インビトロジェン	A88065	MBC 370.2および2.2.9のラベル表示
アネクシンV-パシフィックブルー	インビトロジェン	501121505	血栓染色
クリーニングダスター	オフィスデポ	911245	PDMSデバイスの製作
木箱付きクラフトホビーナイフセット	エクセルブレード	44282	PDMSデバイスの製作
脱イオン水とnbsp;	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	751-628	気密注射器の洗浄
乾燥器	ベルアート	F420270000	PDMSの脱ガス
使い捨て多目的実験用スパチュラ	LevGo	17211	シリコーンエラストマーベースと硬化剤の混合
染料・ビオチン除去スピンカラム	ゼバ	A44296S	フィブリノーゲン標識
フィブリノーゲン	革新的な研究	IHUFBG25MG	血栓染色
フュージョン200-Xシリンジポンプ	ケミックス社	0720X	ハードウェアアセンブリ
ヘパリン	シグマ・オルドリッチ	H3149	血液検査の抗凝固
高周波発生器	エレクトロテクニック製品株式会社	BD-20	PDMSデバイスの製作
ヒトVWFモノマー	シノバイオカル株式会社	10973-H08C	マイクロフュイディックデバイスコーティング
Image J v1.53ソフトウェア	フィジー国立衛生研究所		データ分析
逆立顕微鏡	ライカ	DM ILがリードし、フィルターキューブ:ライカDFT51010;灯台:LED5	ハードウェアアセンブリ
キムワイプズ	キンバリー - クラーク・プロフェッショナル	34120	ガラススライドの清掃
ルアーロックキャップ	インターナショナル・メディカル・インダストリーズ社	57100B	血液サンプルの採取
MBC 370.2	ケラファスト	EBW104	血栓染色
顕微鏡カバーグラス	ポール・マリエンフェルト有限会社 &KG中隊	ES0107222	PDMSデバイスの製作
ミニカミソリブレードスクレーパー	スタンリー	28-100	PDMSデバイスの製作
NanoDrop 2000 UV-Vis分光光度計	サーモ・サイエンティフィック	ND-2000	タンパク質濃度とF/P比の測定
オーブン	ラボライン・インストゥルメンツ	3512	PDMSデバイスの製作
PAC-1-アレクサ・フルー647	バイオレジェンド	362806	血栓染色
プラスチックカップ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	S04589	シリコーンエラストマーベースと硬化剤の混合
SU-8フォトレジストマスター カビ	UCサンディエゴ ナノ3ナノファブリケーションクリーンルーム施設		PDMSデバイスの製作
シルガード184シリコーンエラストマーキット	クレイデン・ダウ	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	ベックマン・カウルター	IM 1756U	血栓染色
チュービング	コール - パーマー・インストゥルメント社	06422-01	ハードウェアアセンブリ