ここでは、LC-MS/MSを用いてヒト血漿中で同位体標識レチノイドとネイティブレチノイドの両方を同時に定量するプロトコルを提示し、検出限界は6 fmolオンカラムです。この方法は単純なサンプル抽出手順と短い分析実行時間を備えており、高いスループットのサンプルを可能にします。
この記事について
サマリー
要約
レチノール同位体希釈法(RID)は、体内のビタミンAプールと安定した同位体希釈を組み合わせることで、人間の体内のビタミンAの総蓄量(TBS)を推定します。そのためには、質量分析法を通じて標識されたレチノールと非標識のレチノールのプラズマ同位体比を正確かつ効率的に測定することが極めて重要です。準備HPLCや誘導化などの広範かつ時間のかかる抽出および/または精製手順を避けるため、LC-MS/MSは標識済みおよび非標識型レチノイドの迅速かつ高感度かつ同時分析を行うために用いられます。この手法は2段階の検出を用いています。(i) 親イオン(前駆体)イオンの初期の質量/電荷(m/z)分離、および(ii)断片化された娘イオン(生成物)イオンの検出。これにより感度が高く、レチノール検出限界はカラム上6fmolと低くなります。タンデム質量分析の利点にもかかわらず、末端官能基がイオン化時に失われ、親イオン(m/z)と娘イオンの断片パターンが似ているため、レチノールからレチニルエステルを分離するには液体クロマトグラフィー分離が必要です。この記事は、溶媒抽出による血漿中の内因性および標識(13Cまたは 2H)レチノールの分離方法を説明し、その後大気圧化学イオン化(APCI)正イオンモードでLC-MS/MSを定量する方法を説明しています。
概要
ビタミンAは脂溶性の栄養素で、人間の健康に不可欠です。ビタミンA欠乏は重篤な感染性疾患と死亡率の感受性を高め、世界では29%の有病率と推定されており、サブサハラアフリカ(48%)および南アジア(44%)でより高い水準です2。ビタミンAの補給は、特にサブサハラアフリカのような高リスク地域で過剰な子ども死亡率を減らす効果的な戦略です。しかし、半年ごとのビタミンA補給の導入と、主食の大規模なビタミンA強化、微量栄養素粉末の配布は、しばしば公的・民間のさまざまな機関で管理されているため、過剰なビタミンA摂取にさらされる可能性があります。.したがって、ビタミンAのバイオマーカーは理想的には欠乏から毒性まで、ビタミンAの状態全体をカバーできるはずです。レチノール同位体希釈法(RID)は、現在、ヒトにおける体内のビタミンA総貯蔵量を間接的に評価する最も正確な方法です。11,12,13であり、肝臓中のビタミンA濃度に対しても検証されており、ビタミンAの状態を示す最良の生化学的マーカーと考えられています 14,15.この方法は、安定同位体標識ビタミンAの経口トレーサー投与が、標識されていないビタミンA(トレース)と交換可能な体内プールで混合する原理に基づいています。投与後特定の時間における血漿レチノール特異的活性(すなわち、標識済みレチノールトレーサーと総レチノールの比率(血漿中のトレーサー/トレース))を測定することで、RID式11,12,13を用いてビタミンAの状態を推定できます。
血漿中のレチノールトレーサーおよびトレースの正確かつ正確な濃度を決定するために、安定同位体標識ビタミンAを定量するために、ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)、同位体比質量分析法(IRMS)、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22など、さまざまな方法が適用されています。23、24、25、26。重要なのは、LC-MS/MSが高い感度、特異性、操作の簡便さを兼ね備え、複雑な行列中の天然および標識レチノールを直接測定できる能力を兼ね備えていることです。したがって、IRMS用の高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)やGC-MSの誘導化のような時間のかかる試料準備を避けるために、LC-MS/MS分析は理想的な選択肢です。この方法は抽出手順が簡潔で、安定同位体の検出限界が非常に低く、実行時間7,18,19も短いためです.ここでは、より短い実行時間、シンプルなワークフロー、そして高感度と選択性を備えた改良版LC-MS/MS法を紹介し、大規模なヒト介入および観察研究のサンプルのハイスループット解析に非常に適した方法として紹介します。これらの研究では、全身のビタミンA蓄積量の決定が求められます。
プロトコル
本研究はフィリピン大学マニラ校の研究倫理委員会(IRB ID: UPMREB 2016-282-01)、UCデービスの機関審査委員会(IRB ID: 903681-2)に承認され、ClinicalTrials.gov(ID: NCT03030339)に登録されました。この研究はガーナ保健サービスの倫理審査委員会(GHS-ERC 012/07/20)によって承認され、試験は https://clinicaltrials.gov 年にNCT04632771として登録されました。
1. 内部規格の作成
- 内部標準液:0.1%ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT;w/v)を含むエタノール中に1 mg/mLのレチニル酢酸塩を内部ストック溶液で準備します。ストック溶液を分割し、-80°Cで最大3ヶ月間保存します。
注意:内部標準では、標識されていないレチニル酢酸または標識済みのレチニル酢酸のいずれかを使用するのが可能である。非標識レチニル酢酸塩標準を使用する場合、レチニル酢酸塩およびレチノールピークの基準分解能を得ることが非常に重要です( 図1参照)。 - 内部標準作業液:標準標準液を1 μg/mLに希釈して内部標準作業液を準備します。まず、標準標準液60μLをエタノール300μLで希釈し、その後この溶液60μLをエタノール10,000μLに希釈します。各サンプルに対して、20 ngのレチニル酢酸を含む作動内部標準溶液20 μLが加えられます。
注:内部標準作業用溶液は-20°Cで最大1週間保存可能です。
2. 校正標準の準備
- 校正ストック標準液:トレースおよびトレーサーの両方に、0.1% BHT(w/v)を含むエタノール中に1 mg/mLのレチノール濃度で校正用ストック標準溶液を準備します。溶液を保存し、-80°Cで最大3ヶ月間保存します。凍結融解のサイクルを避けるために、各アリクオートは一度だけ使ってください。
- 校正標準作動溶液:校正標準液100μLを取り出し、10,000μLのエタノールで体積フラスコで希釈します。325nmでクォーツクベットを用いて分光光度計で希釈した校正液の濃度を測定します(詳細は 表1 参照)。
- 希釈済み校正標準のアリコートを取り、トレース用濃度を8μM、トレーサー用2μMに50%エタノールと50%アセトニトリル/dH2O(70:30(v/v))で調整します。
- 7つの異なる濃度で50%エタノールと50%アセトニトリル/dH2O(70:30(v/v))を使って、重複校正標準を準備します。200 μLのプラズマを抽出した場合、トレース校正標準は6 μMから0.03 μM、トレーサー校正標準は0.5 μMから0.004 μMの範囲であるべきです。
注:正確な定量化のため、血漿中の同位体標識されたレチノールおよびレチニルエステルは、重複した7点キャリブレーション曲線27を用いて定量化します。較正曲線の最高点(プラズマ中のトレースとトレーサーの最高期待濃度の2倍)は、元のプラズマ体積から再構成された抽出物の濃度係数を考慮します。
3. 血漿からのレチノイド抽出
- -80°Cの冷凍庫から血漿サンプルを取り出し、室温(約30分)で解凍します。
- 解凍後、各サンプルをボルテックスし、数秒間回転させて蓋に血漿が残らないことを確認します。その後、サンプルを氷に置きます。
- 冷蔵遠心分離機を起動し、4°Cまで冷ます。 15mLのガラス管に、ねじキャップ付き(被験者IDと時間点)をラベル付けし、各サンプルチューブに200μLの脱イオン水(dH2O)をピペットに入れます。
- 内部標準液から、20μLの内部標準混合物をピペットでガラス管に注入します。
- ピペットを使い、内部標準物質とdH2Oを含む管に200μLの血漿を注ぎます。
- 各サンプルチューブに400μLのエタノールをピペットに入れ、チューブを回してエタノールと血漿を混ぜます。プロテクニックがガラス壁にくっつくのを避けるために、渦を巻かないでください。
- 最初のヘキサン抽出では、各チューブに2mLのヘキサンを加え、チューブの蓋をしっかり固定します。
- チューブを軌道シェーカーに入れ、15,000rpmで30分間振る。チューブを冷蔵遠心分離機に移し、1,800 x g で4°Cで10分間回転させます。
- ガラス製パスツールピペットを使い、上清液をきれいなラベル付きガラス試験管に移します。タンパク質、沈殿物、水分を移動させないように注意してください。
- 残留物にさらに2mLのヘキサンを加え、チューブの蓋をしっかり閉じて軌道シェーカーに入れ、15分間15分間振って2回目のヘキサン抽出を行います。
- チューブを冷蔵遠心分離機に移し、1,800 x g で4°Cで10分間回転させます。 ガラス製パスツールピペットを使い、各サンプルごとに最初のヘキサン抽出(ステップ3.9)の上清液を含むガラス試験管に上澄液を移します。
- 混合ヘキサン抽出溶媒(各サンプルの第1および第2抽出上清液)を、暗いフームフード内でN2 の穏やかな流れ下で約30分間蒸発させます。加熱ブロックを35°Cに設定してください。
- 乾燥残渣を50μLのエタノールに再懸濁し、短時間ボルテックスし、50μLの移動相(70:30アセトニトリル/dH2O (v/v))を加えて再びボルテージします。
注意:乾燥残基の再懸濁は、レチニルエステルの定量を目的とする場合のみ、100μLのエタノールを使用して行うべきです。 - 標識付き0.5 mLマイクロ遠心分離機チューブに移します。遠心分離機で16,900 x g で5分間加熱します。
- 再構成残渣80μLを300μL挿入入りの琥珀色HPLCバイアルに移します。蒸発による溶媒損失を防ぐために、すぐに瓶の蓋を閉めてください。
- ガラスバイアルをクライオボックスに移し、研究名、抽出日、サンプルIDをラベル付けして、分析まで-80°Cの冷凍庫で保存します。
注意:保管サンプルの分析は3〜5日以内に完了しなければなりません。通常、200μLの血漿体積であれば、投与後90日までラベル付きビタミンAトレーサーを検出するのに十分です。しかし、プラズマ/水/エタノールの体積比を1:1:2に保てば、プラズマ体積は400μLまで調整可能です。
4. 内部標準制御サンプルの準備
- エタノール/移動相溶液を、120μLのエタノールをマイクロ遠心分離機管にピペッティングし、200μL(70:30)アセトニトリル/dH2O(v/v)を加えて渦巻くことで準備します。
- 3本の別々の0.6 mLチューブに、内部標準作業液20 μLをピペットに入れます。
- エタノール/移動相溶液を80μL加えてボルテックスを形成します。3つの内部標準制御サンプルを琥珀色のHPLCバイアルに300μLインサートを挿入し、蒸発による溶媒損失を防ぐために即座にキャップを閉めます。
5. プラズマハウススタンダード
- 標準サンプルを準備するために、1回の分析ランで最低3サンプルを分析できる十分なプラズマ体積を確保してください。必要なプラズマの総体積は、分析すべきサンプル数によって決まります。
- アリコートは標準プラズマを各分析ランに必要な容量の小さなクライオビアに収容し、-80°Cで保存します。
注意:ハウス標準には、未知のサンプルで使用される同位体標識されたレチノールトレーサーが含まれていることが非常に重要です。ボランティアサンプルを一つのアリクォートにまとめることで十分な材料を得ることができます。 - 未知のプラズマサンプルと同じ体積で、各分析ランごとに少なくとも3つのプラズマハウス標準サンプルを抽出します。ステップ3で行った通りです。
- プラズマハウススタンダードをサンプルラック全体に配置し、その間に少なくとも10個の未知のプラズマサンプルを配置してください。プラズマハウス標準を使って日中および日間の変動を計算してください。
6. 外部標準サンプル
- 認証された外部標準サンプルを取得し、-80°Cで保管してください。 広く使われている認証済み外部規格として、NIST標準参照資料SRM 968があります。
- ステップ3で、未知のプラズマサンプルと同じ体積で、分析ごとに少なくとも4つの外部標準プラズマサンプルを抽出します。外部の標準サンプルを使用して、得られた結果の正確性を検証します。
7. 手動複合最適化
8. 生成イオン(MS2)スキャン/CEスペクトルチェック
- スタート質量を低い質量、例えば50 Daに設定し、停止質量をQ1質量のすぐ上に設定します(例: 12Cレチノールの場合は269.1)。サイクル数を5に設定し、衝突エネルギー(CE)を10に変えます。前駆体イオンとしてQ1質量を確認してください。小さな破片が現れなければ、CEを20に上げます。
- CEが増加すると、より多くの生成イオンが生成されます。スペクトル右側の前駆体イオンが完全に消えるまでCEを増やし続けます。CEをさらに上げると、二次断片化の可能性が見られます。
9. MRMスキャン
- MS2スキャンから、最も豊富または最も適切な3つの生成イオンを選び、さらなる最適化のために進めます。
- 各生成イオンに対して、Q1(前駆体)質量とQ3(生成物)質量を入力します。Dwellタイムを200msに設定してください。各断片にそれぞれ適切な名前を付けてください(例:12C_Frag_93)。
- 衝突エネルギーを選択し、ランプ機能を使って最適なCE値を特定します。各断片ごとに最適化されたCE値でCE列を埋めます。
- 等圧干渉を最小化するためにCEを最適化した後に最適化されたクラスタリングポテンシャル(DP)を最適化します。1つの遷移ごとに衝突セル出口電位(CXP)を最適化します。
10. 源/ガス最適化
- これらのパラメータは自動的に最適化できません。信号強度を改善する必要がある場合は、手動で最適化を行うのが良いでしょう。一度に一つのパラメータを変え、信号が増加したのか、変わらないのか、減少したのかを比較します。
11. 液体クロマトグラフィー条件
- クロマトグラフィーでは、dH2O(A)に0.1%(v/v)の蟻酸、アセトニトリル(B)に0.1%(v/v)の二重移動相勾配を使用します。
- 適用するLCシステムによっては、100mm x 2.1mm(3μm)のABZ PLUSカラムに4mm×2mmのC18カートリッジを装着(HPLC用)、またはRP18 FITカラムを装着した100mm x 2.1mm(1.7μm)のPremier BEHシールド(超高圧クロマトグラフィー(UPLC)用)を用い、レチノール分析に用いられます。カラムはそれぞれ40°Cまたは50°Cの温度に保ちます。
- 血漿抽出物を10μLカラムに注入します。溶出物は0.4 mL/minの流量で分析されます。HPLCシステムの場合、線形勾配は6.0分で60%Bから95%B、6.1分から13.0分まで100%B;13.1分から14.0分まで100%Bから60%Bへ;14.0分から17.0分の間にBが60%を占めています。UPLCシステムでは、線形勾配は研究課題によって異なります。レチノールのみを求める場合、勾配は次の通りです:1.0分で40%Bから60%B;1.0分から6.0分まで60%Bから95%B;6.5分から7.5分まで100%B;7.5分から7.6分の間に100%Bから40%Bへ;7.6分から8.5分の間に40%のBが割り当てられました。レチノールと並行してレチニルエステルを分析する場合、線勾配は次の通りです:3.0分で60%Bから95%B;3.5分から6.5分まで100%B;6.5分から7.0分まで100%Bから60%Bまで;7.0分から8.5分の間には60%のBが加わりました。
12. MS/MSの状態
- 大気圧化学イオン化(APCI)下で正イオンモードでMS/MS分析を行います。APCIは、より高い信号強度、広い線形範囲、低い背景雑音を提供するため、電気噴霧イオン化よりも選ばれます。
- [12C]レチノール、[13C10]レチノール、[2H6]レチノールおよびそれぞれのエステル/アセテートの質量遷移については、API4000およびQTRAP 5500質量分析計の選択反応モニタリング(SRM)パラメータを用いて、表2、表3、 図2を参照してください。
注:レチノール、レチニルエステル、レチニル酢酸イオンの選択モニタリングは、APCI定量においてm/z 269の同じ断片イオンであり、このイオンはプロトン化分子からの水、脂肪酸、酢酸の損失に対応します。LC-MS/MSはレチノールピークをエステルから分離できるため、単一の注入で1つのサンプル内のレチノールおよびレチニル-エステル分画の同位体濃縮を決定できます。
13. レチノールの定量化
- [12C]レチノール、[2H6]レチノール、[13C10]の試料濃度をそれぞれの校正基準に対して定量化します。
- 各試料の内部標準濃度と内部標準対照試料の回収を用いて抽出損失を算出します。
- 国立標準技術研究所(NIST)標準参照物質(SRM)968を用いて血漿レチノール濃度の確認を行います。
結果
異なるクロマトグラフィー系で安定同位体標識レチノールを分析する分析法の有効性を示すために、2つの異なる研究の結果を紹介します。
API4000を初期HPLCで使用する場合、12か月から18か月のフィリピン人子ども111人の血漿サンプルを分析し、彼らは0日目に400μg(1.17μmol)[13C10]レチニル酢酸経口投与を受け、その後投与4日後に6 mLの血液サンプルを採取しました。平均血漿中の総レチノール濃度は1.1 μmol/L、平均[13C10]は0.007 μmol/Lでした。m/z 279から100への遷移内の背景雑音レベルは平均ピーク高さ~50 cps(図1)であったため、[13C10]レチノールの検出レベル(LOD)および定量レベル(LOQ)はそれぞれ150 cpsと500 cpsに設定され、これはカラム上で6 fmolと19 fmolに相当します。[12C]レチノールと適用された内部標準レチニル酢酸の間で良好な基準分解能が得られたため、安定同位体標識されたレチニル酢酸塩を使用する必要はありませんでした。
UPLCとQTRAP 5500を組み合わせることで、より高速なクロマトグラフィー分離を実現でき、運転時間は10分未満です。研究課題に応じて、2つの異なる分離方法が適用されます。(i) 非標識の内部標準レチニル酢酸塩を塗布した天然および同位体標識レチノールを決定する場合、レチノール間の保持時間(4.37分)からレチニル酢酸塩(5.33分)までの保持時間は良好な基準分離をもたらします(図3);(ii)天然および同位体標識レチノールを、自然および標識されたレチニルエステルと並べて分離することを目的とする場合、8.5分のランで良好な分離が可能です(図4)。しかし、レチノール(2.10分)とレチニル酢酸(2.43分)間の保持時間が近いため、代わりに同位体標識されたレチニル酢酸([2H4]レチニル酢酸)を使用することが推奨されます。この例では、生殖年齢のガーナ女性80名から血清サンプルを分析し、投与後21日で血液サンプルを採取しました。平均血清総レチノール濃度は1.89μmol/Lで、平均[2H6]は0.027 μmol/L、平均[13C10]は0.025 μmol/Lでした。
提示された方法は検出レベルが低い(LOD = 6 fmol;LOQ = 19 fmol on cul)を検出し、安定同位体標識レチノールを検出する際の高い感度と特異性を示し、天然レチノールと内部標準との間に明確な基準線分離を示しました。さらに、保持時間の違いはあったものの、HPLCとUPLCの両方のセットアップで効果的に機能しました。同位体標識された内部標準([2H4]酢酸レチニル)を使用することで、レチニルエステルの特定が必要な場合、より高速なUPLC条件下で正確な定量が可能となりました。NIST認定基準との検証により正確性が確認され、日中および日間の変動係数(それぞれ2.3%と4.4%)は優れた精度と再現性を示しました。異なる投与プロトコルを用いた2つの異なる集団(フィリピンの子どもとガーナの女性)の血漿/血清サンプルの成功した分析は、多様な栄養研究において堅牢性と実用的な有用性を示しました。
図1:API4000質量分析計を用いたLC-MS/MSクロマトグラム。 血清レチノールのクロマトグラムは、0.4 mgの[13C10]レチニル酢酸を経口摂取後4日後に取得しました。m/z 269から93の選択反応モニタリング(SRM)では、[12C]レチノール(RT = 5.06分)と[12C]レチニルアセテート(RT = 5.83分)が内部標準(IS)として分離していることが示されています。m/z 279から100の[13C10]レチノール信号は検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)の両方を十分に超えています。クロマトグラフィー条件:(A) dH2O中の0.1%(v/v)蟻酸の二元移動相勾配、(B)アセトニトリル中の0.1%(v/v)蟻酸;流量は0.4 mL/minで、線形勾配は6.0分で60% Bから95% Bまで;6.1分から13.0分まで100%B;13.1分から14.0分まで100%Bから60%Bへ;14.0分から17.0分まで60%がB;100 mm x 2.1 mm(3 μm)ABZ PLUSカラムで、4 mm x 2 mm C18カートリッジを40°Cで維持しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図2:APCI-MS/MSの生成イオン質量スペクトル。 フローインジェクションAPCI-MS/MSの生成イオン質量スペクトルは、(A)m/z 269[12C]レチノール、(B)m/z 273 [2H4]レチノール、(C)m/z 275 [2H6]レチノール、(D)m/z 279 [13C10]レチノールの正イオンモード。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:QTRAP 5500質量分析計を用いたLC-MS/MSクロマトグラム。血漿ハウス標準からの典型的な抽出物のLC-MS/MSクロマトグラムは、[2H6]レチニル酢酸1.0mgを経口摂取後21日、1.0 mg [13C10]レチニル酢酸塩を経口摂取後90日後にサンプリングしました。m/z 269→93の選択反応モニタリング(SRM)では、[12°C]レチノールピーク(RT = 4.37分)およびレチニル酢酸塩(RT = 5.33分)が内部標準(IS)として示されています。[2H6]レチノール(RT = 4.36分)はm/z 275→96で、およびm/z 279→100の[13°C10]レチノールピーク(RT = 4.38)です。クロマトグラフィー条件:(A) dH2O中の0.1%(v/v)二元移動相勾配、(B)アセトニトリル中で0.1%(v/v)の蟻酸;流量は0.4 ml/minで線形勾配は40% Bから60% B(1.0分)です。1.0分から6.0分まで60%Bから95%B;6.5分から7.5分まで100%B;7.5分から7.6分の間に100%Bから40%Bへ;7.6分から8.5分の間は40%のB、100 mm x 2.1 mm(1.7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT カラム、50°Cで維持。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図4:QTRAP 5500質量分析計を用いたレチノールおよびレチニルエステルのLC-MS/MSクロマトグラム。1.0 mg [2H6] レチニル酢酸塩経口摂取後6時間後および1.0 mg [13C10] レチニル酢酸経口摂取後90日後に採取した血漿ハウス標準物の典型的な抽出物のLC-MS/MSクロマトグラム。m/z 269→93の選択反応モニタリング(SRM)では[12C]レチノールピーク(RT = 2.10分)が示されます。内部標準(IS)としてm/z 273→94(RT = 2.43分)の[2H4]レチニル酢酸イオンを用い、[2H6]レチノール(RT = 2.09分)と[2H6]レチニルパルミテート(RT = 5.11分)の分離はm/z 275→96でピークを迎えます。およびm/z 279→100の[13C10]レチノールピーク(RT = 2.10)です。クロマトグラフィー条件:(A) dH2O中の0.1%(v/v)二元移動相勾配、(B)アセトニトリル中で0.1%(v/v)の蟻酸;流量は0.4 ml/minで線形勾配は3.0分で60% Bから95% B;3.5分から6.5分まで100%B;6.5分から7.0分まで100%Bから60%Bまで;7.0分から8.5分の間は60%のB、100 mm x 2.1 mm(1.7 μm)AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITカラム、50°Cで維持。この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。
| パラメータ | |
| エタノール中のレチノールのモル吸着率(ɛ): | 52,770 M-1 cm-1 |
| 希釈係数: | 100(100μLの標準校正標準を10mLのエタノールに含む) |
| 測定された平均吸水率: | 0.575 |
| 計算方法 | |
| エタノール中の[12C]レチノールの濃度(mol): | 濃度(モル)=吸収率 / ɛ × キュベットの長さ |
| = 0.575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1.09 x 10-5 M | |
| 希釈の補正: | 1.09 × 10-5 M × 100 = 1.09 × 10-3 M または 1.09 mM |
表1:校正標準レチノールストック濃度の決定。
| 分析物 | MRMトランジション(m/z) | クラスタリングポテンシャル(V) | 入口ポテンシャル(V) | 衝突エネルギー(eV) | 衝突出口電位(V) |
| [12C]-レチノール/エステル | 269→93 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H4]レチニル酢酸 | 273→94 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H6]レチノール/エステル | 275→96 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [13C10]-レチノール/エステル | 279→100 | 41 | 10 | 27 | 6 |
表2:選択反応モニタリング(SRM)パラメータ。API4000を用いた[12C]レチノール、[13C10]レチノールおよびそれぞれのエステルのパラメータ
| 分析物 | MRMトランジション(m/z) | クラスタリングポテンシャル(V) | 入口ポテンシャル(V) | 衝突エネルギー(eV) | 衝突出口電位(V) |
| [12C]-レチノール/エステル | 269→93 | 94 | 10 | 33 | 8 |
| [2H4]レチニル酢酸 | 273→94 | 54 | 10 | 20 | 11 |
| [2H6]レチノール/エステル | 275→96 | 69 | 10 | 25 | 3 |
| [13C10]-レチノール/エステル | 279→100 | 102 | 10 | 35 | 9 |
表3:選択反応モニタリング(SRM)パラメータ。 QTRAP 5500を用いた[12C]レチノール、[13C10]レチノールおよびそれぞれのエステルのパラメータ
ディスカッション
提示されたLC-MS/MS法は非常に高い感度を持ち、検出限界は6 fmol/Lと低く、研究者は100〜200 μLのプラズマ19を最小限で使用可能です。この標的タンデムMS法は、量化子イオンと選正生成物イオンの両方を用いる場合、レチノイド同位同性の確認に特に効果的です。しかし、同位体標識レチノイドは生理学的な非標識レチノイドよりもはるかに低い濃度で存在するため、標識されたレチノールおよびレチニルエステルを含む血漿サンプルには追加の濃度ステップが必要になることがあります。この必要性は、投与後の血液サンプルのタイミング、経口トレーサーの濃度、LC-MS/MSシステムの感度などの要因に依存します。歴史的には、従来の質量分析計の感度低下を補うために高線量の適用が用いられてきましたが、近年の進歩により低線量の使用が可能になりました。提示された例では、経口用量が高いほど、安定同位体標識レチノールのレベルは21日経過時点でも増加します。
レチニルエステルの末端官能基はイオン化時に失われるため、レチノールとレチニルエステルの両方で、同じ親m/zのm/zおよび類似の娘イオン断片化パターンが観察されます。したがって、それぞれの濃度を決定するためにはクロマトグラフィー分離が極めて重要です。さらに、内因性レチノール同位素素に自然に存在する13C安定同位体が高いため、ヒト血漿中の自然な13C濃縮を補正する必要を避けるために、レチノールトレーサーに3個以上の13C原子を含めることが推奨されています。
血漿サンプルは同位体分析前に2段階の処理が必要です。まず血漿サンプルを脱タンパク質化し、その後非極性溶媒を用いてレチノールおよびレチニルエステルを抽出し、二相性系18,19,20を形成します。上記のプロトコルで明確な相分離が得られますが、二相系の間相が攪乱されたり集められたりしないことが極めて重要です。これにより乾燥時間が長くなり、解析の精度が低下します。また、私たちのグループはレチノイド20に対する単相抽出法の応用も検討しています。そのため、200μLのプラズマサンプルを2mLのプラスチック製マイクロ遠心分離機チューブにピペット化し、レチノイドはエタノールと酢酸エチルの組み合わせで抽出されます。この抽出プロトコルを適用することで、レチノールおよびレチノイン酸異性体などのより極性の強いレチノイドを、二相抽出と同等の回収率で分析でき、またKaneやNapoli30のワンステップアセトニトリル抽出法とも比較可能です。
レチノイドは紫外線や熱にさらされると酸化や異性化に敏感であるため、分析をできるだけ迅速に行うことが重要であり、プラズマ30の採取、取り扱い、保管の際には一般的な注意が必要です。安定同位体標識レチノイドの解析には、時間のかかる分離や誘導化が用いられます。GC-MS解析では、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてヒト血清からレチノール分画を分離し、その後レチノール22の誘導化を行う必要があります。GC-C-IRMSでは誘導化は必要ありませんが、2つのHPLC精製工程によるレチノールの事前分離が推奨されています(17,25,31)、またサンプル集団におけるヒト血漿中のレチノールの自然な13C濃縮の基準値の決定も必要です(17,32)。.これに対し、提示されたLC-MS/MS法にはいくつかの利点があります。広範囲かつ時間のかかる抽出および/または精製作業を回避し、レチニルエステルおよび遊離レチノール16,18,26,32の迅速かつ感度の高い同時分析を可能にします。さらに、この方法は高精度で低変動性を提供し、異なるLC-MS/MSシステムに適応できるため効果的です。
開示事項
著者たちには宣言するものは何もない。
謝辞
この研究の支援はビル&メリンダ・ゲイツ財団(プロジェクト番号:OPP1115464)およびウィーンの国際原子力機関(IAEA、プロジェクト番号E4.30.30)によって提供されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <強>溶剤<強さ> | |||
| 絶対エタノールHPLCグレード | フィッシャー | 10428671 | |
| アセトニトリルHPLCグレード | フィッシャー | 10660131 | |
| HPLC認証済みHPLC用ヘキサン95% n-ヘキサン | フィッシャー | H/0406/17 | |
| イソプロパノールHPLCグレード | VWR | 20880.32 | |
| イソプロパノールHPLCグレード | VWR | 20880.32 | |
| メタノール 99% 2.5L | サーモ・サイエンティフィック | 11367996 | |
| <ストロング>標準/同位体 | |||
| オールトランスレチノール | バイオエクストラ | 95144 | |
| アセテートレチニル | シグマ | PHR1236 | |
| レチノール標識された安定同位体: | ReseaChem/Buchem BV | ||
| レチニル酢酸塩標識された安定同位体: | ReseaChem/Buchem BV | 該当なし | RID法にはさまざまな安定同位体が用いられます。市販されているさまざまな同位体の一覧は表1に示されています。 |
| ビタミンA (19,19,19,20,20,20-D6) | |||
| ビタミンA (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| ビタミンA酢酸塩(10,19,19,19-D4) | |||
| ビタミンA酢酸(19,19,19,20,20,20-D6) | |||
| ビタミンA酢酸塩(8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| <ストロング>装備 | |||
| 5ml調節可能な溶剤ディスペンサー | シグマ・オルドリッチ | Z627607-1EA | |
| ABI 4000 LC-MS/MS。 | ABサイエックス | ||
| 分析的体重計など; | フィッシャー | 13592970 | |
| 毛細血管ピストン(ピペットチップ) CP100 10x96 TIPACK | ギルソン | FD148314 | |
| 毛細血管ピストン CP250ST 6x96 | ギルソン | F148714 | |
| 排気キャビネット | |||
| Microman E M100E ピペット(正置換式) | ギルソン | FD10004 | |
| Microman E M250E ピペット(正置換式) | ギルソン | FD10005 | |
| Pipetman P100、10-100ul、金属エジェクター | ギルソン | F114057M | |
| Pipetman P1000、100-1000ul、金属エジェクター | ギルソン | F114059M | |
| Pipetman P20、2-20ul、金属エジェクター | ギルソン | F144056M | |
| QTRAP 5500 LC-MS/MS | ABサイエックス | ||
| 冷蔵遠心分離機 5810 R | エッペンドルフ | ||
| 音響処理水浴 | VWR | USC100T | |
| 分光光度計 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | A51119600C | |
| テクネサンプル濃縮器とヒートブロック。 | VWR | ||
| Vibrax VXR ベーシックシェーカー | イカ | 0002819002 | |
| ボルテックスミキサー;MS3 ベーシックIKA | フィッシャー | MPR-555-050L | |
| VX2試験管アタッチメント - VX2型 | イカ | 0000568900 | |
| <強力>消耗品<強力> | |||
| 1.5mlマイクロ遠心分離機チューブ | フィッシャー | FB74323 | |
| 100 mm x 2.1 mm(1.7 & mu;m) アクイティTM プレミアBEHシールド RP18 ヴァンガード FITコラム | 水域 | 186009498 | |
| 100 mm x 2.1 mm(3 & micro;m) Supelcosil ABZ PLUSカラム | スペルコ | 57917 | |
| 1000ulピペットチップ | スターラブ | S1122-1830 | |
| 100mlのボリュームフラスコ | フィッシャー | 11323644 | パイレックス ホウケイ酸ガラス クラスA認定ボリューメトリックフラスコ |
| 200ulピペットチップ | スターラブ | S1120-8810 | |
| 4mm x 2mm セキュリティガードC18カートリッジ | 現象 | AJ0-4286 | |
| 50mlのボリュームフラスコ | フィッシャー | 11313644 | パイレックス ホウケイ酸ガラス クラスA認定ボリューメトリックフラスコ |
| 9mmの琥珀色ガラスバイアル(インサート付き) | フィッシャー | 11583680 | |
| 9mmバイアルねじ山キャップ | フィッシャー | 13206419 | |
| 段ボール製のクライオボックス | スターラブ | A9623-8181 | |
| ヘルマ・キュベット UV水晶 | SLS | CEL1600 | |
| 窒素ガス(最高純度で酸素を含まない) | BOC | ||
| パスツール・ピペット | フィッシャー | 11546963 | |
| パイレックス培養チューブ 100×16mm | コーニング | CLS9944916 | |
| スクリューキャップ PTFE ライナー 16mm | コーニング | CLS999815 | |
| バイアルガラスアンバー 2ml PTFE コンデンス | フィッシャー | 11573542 | |
| バイアルスクリューキャップ 9mm シリコーンホワイト/PTFEレッド | サーモ | 13206419 |
参考文献
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