方法論記事

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

407 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/69562

⸱

2026年4月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

この記事について

サマリー

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内 移植および下流解析を行います。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の膵内分泌細胞は、糖尿病細胞治療および疾患モデル化の有望な供給源となっています。いくつかの分化プロトコルが確立されていますが、生理学的文脈で成熟と機能を研究するためには生 体内 での着床が一般的に必要です。ほとんどの移植方法は腎嚢や皮下空間などの部位に依存しており、技術的または生理学的な制約が生じる可能性があります。ここでは、hPSC由来の膵臓SC小島を免疫不全マウスへの筋肉内移植に関する詳細なプロトコルを提示します。この部位は手術へのアクセスが容易で、侵襲性が低く、後続解析のための信頼性の高い移植片採取を可能にします。この手技は幹細胞由来の小島の筋肉内着床を可能にし、経口血糖挑戦後のインスリン分泌の下流評価のための回復を支援します。プロトコルにはクラスターの準備と圧縮、移植手術、 生体内 グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)、組織学的解析のためのグラフト採取のステップが含まれており、前臨床マウスモデルにおける筋肉内移植の再現性のある枠組みを提供します。

概要

糖尿病は多様な代謝障害であり、過去30年間で有病率が倍増し、2050年までに13億人に影響を及ぼすと予測されています。食事や生活習慣などの環境要因が2型糖尿病(T2D)の発症に重要な役割を果たしますが、遺伝的素因も発症に大きく寄与します2。膵β細胞はインスリン合成と分泌を担い、糖尿病の病態生理に中心的な役割を果たします。遺伝的リスクがβ細胞機能障害にどのように寄与するかを理解するために、ヒト幹細胞由来のβ細胞を三次元内分泌クラスター(以下SCアイレットと呼ぶ)として組織化し、非常に有益で関連性の高いモデルシステムを提供します4,5。最近のプロトコルは、特定の阻害剤と成長因子を用いて膵臓の発生の重要な段階を再確認することで、ヒト幹細胞のインスリン産生β細胞への分化を効果的に導いています6,7。

これらのシステムは、発生モデリングを支えず供給制約を受けるドナー由来の島の制約を克服し、スケーラブルかつ再現可能な方法で確実に発達の節目を再現します。マウスモデルは膵臓の発生に関する貴重な洞察を提供してきましたが、ヒト患者で観察される表現型の発現を完全に再現できないことが多い5。したがって、幹細胞ベースのシステムの利用により、ヒト膵臓の発生やβ細胞機能障害に関与する遺伝的変異の特性解析が可能となります8。

これらの進歩にもかかわらず、in vitroで生成されたSCアイレットは、成人βのネイティブ細胞と比べて転写体的および機能的に未熟なままです。彼らは最適でないグルコース刺激インスリン分泌を示し、MAFAやG6PC2などの成熟したβ細胞マーカーの発現が欠如しています 9,10。このギャップを埋めるために、免疫不全マウスへの移植による生体内成熟がよく用いられます。これにより、インスリン分泌の動態と遺伝子発現プロファイルの両方が通常改善されます。6.

グルコース代謝は厳密に調整されており、全身の手がかりの統合が必要です。移植されたSCアイレットは複数の臓器からの信号を統合でき、ヒトβ細胞における遺伝的変異の機能的影響を評価する上で、より生理学的に関連性の高い環境を提供します11。

マウスにおけるSC膵島移植は、さまざまな解剖部位で行われてきました。従来の部位は腎臓カプセルで、ストレプトゾトシン(STZ)治療齧歯類のβ細胞成熟促進と糖尿病の逆転に効果的ですが、複雑な侵襲手術が必要であり、検査室での実施が制限されています。さらに、この方法はサイズや血管の制限により、1型糖尿病患者の臨床治療には応用できません14。筋肉内、皮下、脂肪組織などの代替移植部位も報告されており、侵襲性の低い臨床的応用路を提供します。筋内移植は腎カプセルと比較して最適なβ細胞成熟とインスリン分泌の達成に課題があるかもしれませんが、それでも効果的なインスリン分泌とグルコース恒常性の維持を実現でき、より簡単でアクセスしやすい外科的アプローチを提供します15,16。

したがって、本プロトコルでは、他の移植プロトコルのいくつかの制限に対応する筋肉内移植アプローチを提示します。この方法は低侵襲であり、成熟したSCアイレットの成熟やβ細胞機能障害に関連する遺伝的変異の調査において信頼性の高い in vivo 戦略を提供します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

多能性幹細胞(hPSC)および実験動物を用いたすべての実験は、機関、地域、国家の倫理委員会によって承認されました。ここで使用されたhPSCラインは、もともとソース機関で適切な倫理的承認およびインフォームドコンセント手続きに従って導出・配布されました。 図1 は、hPSC維持から指向性膵系統分化、移植に適したSC小島への成熟までの全体のワークフローを示しています。

1. 膵臓前身へのhPSCの分化

注:本プロトコルは、1) hPSCの維持と増殖、2) 内分泌膵臓系統への誘導的な分化、という2つの重要な準備ステップに基づいています。両ステップは詳細に記述されています7,17。hPSCはLyria-Leyteら17の推奨に従い、B8培地を用いた被覆プレート内で維持されています。指数関数的成長中に分化のために、合流する前にhPSCを収穫してください。推奨される播種密度で、翌日には90〜100%の合流率に達し、分化を始める準備が整います。内分泌膵臓系統への分化は、Barsbyらが述べた手順に従って行われます。メディアの詳細は表1に記載されています。

  1. 分化プレートを基底膜由来の細胞外マトリックスで新たにコーティングします。
  2. 0日目に0.16〜0.19百万セル/cm2 のシード(6ウェルプレートから170万細胞を1つのウェルに)。栄養素の枯渇を防ぐために、B8 + CEPTの体積を1.5〜2倍使ってください(6ウェルプレートでは1ウェルあたり3〜4mL)。
    注:hPSCのパソコンや分化実験のシーディングを行う際、従来のROCK阻害剤Y-27632よりも、hPSC生存率を高めることが証明されているため、クロマン1、エムカサン、ポリアミン、トランスISRIBのカクテルであるCEPTを優先的に補います。それでも、Y27632はこのプロトコルの有効な代替手段として有効です。
  3. 以下のスケジュールに従って、S1からS4までの差別化メディアを用いてメディアチェンジを行います:S1(1日目〜4日目)、S2(4日目〜7日目)、S3(7〜9日目)、S4(9〜11日目)です。
    注:完全なメディア構成については表1を参照してください。追加の手続きの詳細はBarsbyらによって説明されています。

2. 3次元クラスターの生成とインスリン産生細胞への分化

注:11日目には分化細胞が膵臓の前駆細胞に進化しているはずです。この段階で内分泌分化を促進するために、細胞は平面培養から3D培養へと移行します。

  1. 逆ピラミッド型マイクロウェル(直径400μm)を含む24ウェルマイクロウェルプレートの底面に、5%(w/v)のアンチアシデント溶液0.5mLを加えます(詳細は表1参照)。1,300gの遠心分離機で室温(RT)で10分間加熱します。
    注:アンチアタッチメントソリューションは、細胞がプラスチックにくっつくのを防ぎ、均一な集まりを促進するアンチアフトメント表面を作り出します。
  2. 顕微鏡でマイクロウェルの気泡を調べ、必要に応じて再遠心分離機で閉じ込められた空気を除去してください(図2A)。粘着防止液を吸引し、0.5mLのPBSで2回洗浄します。使用準備が整うまで、ウェルはPBSで覆ったままにしてください。
  3. 細胞をPBS-0.5 mM EDTA1 mLで洗浄し、PBS-EDTAを吸引し、ウェルをトリプシンで覆います(6ウェルプレートのウェルは1 mL)。37ºCで8〜12分間孵育します(叩くと明らかな剥離が出るまで)。
  4. トリプシンは除去しないでください。代わりに、DMEM-F12またはPBSの2倍の容量で希釈し、ピペッティングで優しく再懸濁します。サスペンションを円錐形のチューブに入れ、すぐに次のステップに進みます。
    注:厳しい機械的研磨を行うよりも、トリプシンで長時間潜伏する方が良いです。
  5. 懸濁液を200gで3分間RTで遠心分離します。上清液を慎重に吸引し、ペレットを予温されたS4培地(24ウェルのマイクロウェル各ウェルごとに1.25 mL)に優しく再懸浮させます。
  6. マイクロウェル皿からPBSを吸引します。微小な層の各ウェルに、浮遊セルを1.25mL優しく加えます。
    注:24マイクロウェルプレートの各ウェルには1,200個のマイクロウェルが含まれています。適切なサイズのクラスターを得るために必要なシーディング密度は1マイクロウェルあたり1,500セル、つまり1ウェルあたり180万セルに相当します。または、6ウェルマイクロウェルを使用し、体積や細胞数(ステージ4培地5mLで約885万細胞)を調整します。
  7. 100gで3分間離心分離し、マイクロウェル内で細胞を均等に分布させます。マイクロウェルプレートを慎重に加湿インキュベーターに移してください。
  8. 分化メディアS5(D14-D18)、S6(D18-D25)、S7(D25-D46)を用いてメディアチェンジを行います。
    注:詳細な構成詳細は表1に記載されており、追加の手続きの詳細はBarsbyらによって説明されています。
    CEPTカクテルは、オルガノイド形成中の細胞生存を促進することが証明されているため、ROCK阻害剤Y-27632の代わりにこのステップで使用可能です。成功した集合は、24〜48時間以内にコンパクトな球状クラスターが形成されることで示されます( 図2B参照)。

3. 免疫不全マウスの硬い筋肉へのSCアイレット移植

注:SC小島は分化のさまざまな段階(ステージ4からステージ7)で移植されています。分化したS7 SCアイレットの移植がグルコース応答性を評価する最適な戦略である6ですが、早期段階の前駆細胞(S4-S5)や未成熟のSCアイレット(S6)の移植は、定義された培養条件を用いることでビ ビトロ で隠されていた分化や成熟の違いを明らかにするのに役立つ可能性があります。しかし、分化度の低い前駆細胞を移植すると、主に未分化細胞集団が残留するため、奇形腫形成のリスクが高まります。

  1. クラスタのコンパクト化
    1. 適切な量のクラスターを1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します(注参照)。
      注意:細胞量は実験目的によって異なります。組織学では、1マウスあたり0.50万〜100万細胞で信頼できるグラフト採取が可能ですが、STZ治療マウスの機能的アッセイや糖尿病逆転は通常、200万〜500万細胞の高用量を必要とします。圧縮前、SCアイレットは均一な球形で、目標直径は~150-250μm(許容範囲:100-300μm)であるべきです。このサイズ範囲は、クラスターあたり約10³〜4〜10³×細胞数に相当し、過大な集合体(>300〜400μm)は中心性壊死にかかりやすいため避けるべきです。クラスターの大きさと均一性は、代表的な井戸の明視野または立体顕微鏡イメージングで圧縮される前に検証され、その後標準画像解析ソフトウェアを用いた直径測定が行われます。
    2. 注射器を針チューブの組み立てに繋ぎ、S7メディウムを充填します。
    3. クラスターをマイクロ遠心分離機チューブから直接チューブ内に吸引してください。チューブを半分に折り、折りたたんだ部分を200μLのピペットチップに挿入します。先端チューブの針アセンブリを15mLの円錐形チューブに挿入し、テープでチューブの縁に端を固定します。
    4. チューブを100gで4°Cで2分間遠心分離してクラスターを圧縮します。すぐにチューブを氷の上に置いてください。
  2. クラスタのマウス移植
    注意:すべての手術は適切な個人用保護具を使用し、施設のバイオセーフティおよび動物福祉規則を遵守しなければなりません。麻酔薬や鋭利器は、承認された安全手順に従って取り扱い、廃棄されるべきです。
    1. NOD-scid-gammaマウスに3-5%イソフルランを用いて麻酔を誘導します。
    2. 右脚の後ろ側の膝下を剃り、70%エタノールで消毒してください。
    3. ピペットの先端からチューブを外し、注射器に接続します。チューブを圧縮したクラスターの近くに切り、針の鈍い端に取り付けます。生理食塩水を最初の塊が針の先端に到達するまで押し続けます。
    4. マウスをうつ伏せにして右側に傾け、右脚を伸ばします。針を右太ももの内側区画、内転筋と手筋の間の領域に4〜5mm深く刺します。
    5. 針を~3mm引っ込めたままクラスターを注入します。注射器を回転させて針を引き抜く。
    6. 麻酔から完全に回復するまでマウスを監視してください。
      注:機能的特徴付け(すなわち生 体内 GSIS第4節)には、マウスごとに単一の遺伝子型を持つSCアイレットを使用する必要があります。移植は一度だけで十分です。しかし、着床後の成熟の組織学的またはトランスクリプトミー的特徴付けには、両脚を用いることがあります(例:一方の脚は疾患関連遺伝的変異を含むhPSC由来のSCクラスターを持ち、もう一方の脚にはその変異を修正しています)。注射直後に生 体内 で正しい筋肉内投与を直接確認することはできません。移植の成功は、採集時の移植片の巨視的同定(図3)および組織学的解析(図4)によって後ろから確認されます。

4. 生体内 グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)

注:経口グルコースチャレンジを用いた 生体内 GSISは、生理的刺激に反応した機能的インスリン分泌を評価します。すべての処置は、施設での動物ケアおよび使用ガイドラインに従わなければなりません。移植されたβ細胞の機能的応答は生 体内 成熟とともに改善します。ヒトCペプチドは移植後2週間で検出可能であり、強健なグルコース応答性分泌は通常4週間で達成されます。これらのタイムラインは移植時のSCアイレットの発生段階によって異なる場合があります

  1. グルコース投与前に4〜6時間断食し、水分へのアクセスを確保しましょう。
  2. 水に20%(w/v) D-(+)-グルコース溶液を準備します。使用前に0.22μmのフィルターを通し、室温まで温めて滅菌してください。
  3. マウスそれぞれの体重を測り、体重3g/kgの血糖値を計算します。
  4. 適切な量のグルコース溶液を20Gの曲がったガベージ針に1mLの注射器に装填します。
  5. マウスを優しく拘束し、経口ガベージを行い、気管誤嚥を防ぐためにガベージ針の滑らかな挿入を確保します。
  6. 下顎下静脈または尾部静脈穿刺で、下顎下静脈または尾静脈穿刺を用い、毛細血管管と1.5 mLのマイクロ遠心分離機管を用いて採取します。血液を室温で約15分間凝固させた後、チューブを氷で保存します。
  7. サンプルを1,000gで4°Cで15分間遠心分離し、血清を新しいチューブに移します。ELISAによる分析まで−80°Cで保存します。
    注意:時間点は実験モデルによって調整可能です。異種移植モデルにおいて、移植片由来インスリン分泌を評価するには、ヒトとマウスのインスリンまたはCペプチドを区別できるアッセイを使用することが重要です。

5. 接ぎ木クラスタの回収

  1. 動物倫理ガイドラインに従ってネズミを安楽死させてください。
  2. 毛皮による組織汚染を最小限に抑えるために、エタノールを70%(v/v)のエタノールを全身に散布します。
  3. 皮膚を剥がして下肢の筋肉を露出させ、虫眼鏡を使って移植した塊を見つけます。はさみと鉗子を使った移植片を含む組織を切除します。
  4. 組織をPBSで一度洗い流し、氷の上で4%(w/v)パラホルマルデヒド(PFA)に移します。組織を4%PFAで4°Cで4時間、優しく振って固定します。
  5. サンプルをPBSで1時間、優しく振って洗います。組織をPBSで30%(w/v)のショ糖に移し、4°Cで一晩培養します。
    注:生物組織、血液サンプル、化学廃棄物(固定剤や麻酔残留物を含む)は、機関のバイオセーフティおよび化学廃棄物管理ガイドラインに従って処分しなければなりません。

6. エクスプラントの染色

  1. OCT埋め込み
    1. 組織を最適切削温度(OCT)化合物で満たした型に埋め込みます。
    2. 型をドライアイスとイソプロパノールのバスに入れて、サンプルを急凍します。冷凍解剖まで-80°Cで保存してください。
    3. クライオスタットを使い、5〜7μmの断片を切断し、スライドを-80°Cで保存します。
  2. 免疫染色
    1. 結露を防ぐために、RTで15分間容器内でスライドを平衡させます。
    2. スライドをPBSで3回×5分洗い流します。
    3. 各切片を100μLのブロッキング/透過化溶液で30分間RTで培養します(PBS中に0.1%の非イオン性界面活性剤、二次抗体が生成された種の血清5%)。
    4. 各切片に50μLの一次抗体を4°Cで一晩、ブロッキング/透過溶液で希釈して培養します。
    5. スライドをPBSで3回×5分洗い流します。
    6. 各切片を50μLの二次抗体をブロッキング/透過化溶液で希釈して1時間RTでインキュベートします。
    7. スライドをPBSで3回×5分洗い流します。
    8. スライドをDAPIで15μLの取り付け液で取り付け、カバースリップを貼ります。暗闇で4°Cの温度で保存し、画像処理をします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

示された結果は、免疫不全マウスへのステージ7SC小島の筋肉内移植に対応し、移植後6週間後に解析が行われました。代表的なグラフトを持つ少数の動物を分析し、この手法の実現可能性を示しました。本研究では、筋内移植片の巨視的回収と、移植されたSCアイレットの生存および内分泌同様の組織学的確認が成功した結果と定義されています。 図1 は、hPSC維持から指向性膵系統分化、移植に適したSC小島への成熟までの全体的な分化ワークフローを示しています。

サイズ制御された3D集合体を生成するために、ステージ4膵前身の単細胞懸濁液をマイクロウェルプレートにシードしました(図2A)。24〜48時間以内に、コンパクトな球状のクラスターが形成されます(図...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本プロトコルでは、筋内SCアイレットの移植を、生 体内 成熟のための簡易で再現性が高く、低侵襲的なアプローチとして説明し、機能的評価の可能性も示しています。腎嚢下の移植は、齧歯類における膵島またはSC膵島移植の「ゴールドスタンダード」と広く認識されていますが、より高い技術的専門知識と長期の手術が必要です。対照的に、筋肉内部位は手術の複雑さや周術期ストレスを軽減することで、3Rsフレームワークの精緻化原則に沿った、手技の簡潔さと迅速な実行を提供します。これらの特性により、実装の容易さが優先されるSCアイレットにおける遺伝子改変の結果評価を目指す研究室にとって特に魅力的です。

骨格筋を用いて内分泌組織の移植を行うという概念は、臨床内分泌学において長く先例があり、特に副甲状腺自己移植で顕著であり、現在も日常的に使用されています。これは筋肉組織が長期的な内分泌機能を維持できる能力を強調しています。しかし、筋組織は比較的血管が弱く、血管新生ポテ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

本研究で使用されたhPSCラインを寛大に提供してくださったダンウェイ・ホアンフー博士(ニューヨーク・ニューヨーク)に感謝いたします。この研究は、スペイン科学・イノベーション・大学省MICIU/AEI/10.13039/501100011033およびNext GenerationEU/PRTR(A.B.)からの助成金PID2021-122284NA-I00およびCNS2023-145179、さらにCIBER-ネットワーク生物医学研究コンソーシアムCB07/08/0029およびPID2023 M.V.(M.V.)、カルロス3世救済研究所(ISCIII))によって支援されました。糖尿病および関連代謝疾患生物医学研究センター(CIBERDEM)はISCIIIのイニシアチブであり、欧州地域開発基金(FEDER)の一部支援を受けています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPTカクテル
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)Syncomカスタム製品ガンマセクレターゼ阻害剤
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPTカクテル
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptカスタム製品
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich821845% (w/v)で使用
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPTカクテル
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 インヒビター
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MG細胞透過性T3アナログ
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPTカクテル
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCKインヒビター
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
抗体
ラット抗ヒトCペプチド（インスリン）DSHBGN-ID4-s150 ng/mLで使用
マウス抗グルカゴンProteintech67286-1-Ig1:2000
ウサギ抗ソマトスタチンMilliporeAB54941:500
ヤギ抗ラットAF488InvitrogenA-110061:500
ウマ抗マウスAF488InvitrogenA-212021:500
ウマ抗ウサギAF488InvitrogenA-212061:500

参考文献

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事