方法論記事

修正された塩化鉄誘発性上矢状洞血栓症の確立

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DOI：

10.3791/69563

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2025年12月30日

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1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

この記事について

サマリー

本研究は、塩化鉄による上矢状洞血栓症の再現可能かつ低侵襲ラットモデルを確立するためのプロトコルを提示し、シルク縫合法とレーザースペックルコントラストイメージングおよび高分解能超音波を組み合わせて評価します。

要約

脳静脈血栓症(CVT)はまれですが、生命を脅かす可能性のある神経障害です。動物モデルは、その病態生理を調査し、治療法の可能性を評価する上で重要なプラットフォームを提供します。本研究では、FeCl浸漬縫合技術を用いた上矢状洞(SSS)血栓症の修正ラットモデルを提示します。オスのスプラグ・ドーリーラット(220-250g)は、頭皮の中間切開とSSS上方に1cmの頭骨窓を創設しました。従来の正中切開と比べて、この方法は切開した皮膚、骨の窓、そして下の硬膜間の癒着を防ぎます。さらに、SSS上に位置する縫合結びによる干渉を避け、超音波画像の品質を向上させます。40%FeCl3 に浸した2-0シルク縫合糸を露出した副鼻腔に2回連続で5分間の間隔で塗布しました。従来のFeCl3フィルターペーパー法と比べて、この技術は矢状皮質への直接的な化学的損傷を最小限に抑えます。FeCl3 投与前後の脳静脈灌流を評価するためにレーザースペックルコントラストイメージングを用いました。血流の著しい減少により血栓症の成功が確認されました。手術後7日間、血栓形成および血行動態の変化を高解像度超音波 で 評価し、Vevo LABソフトウェアで解析しました。このソフトウェアは血栓の体積および血行動態データを提供しました。この修正モデルは、前臨床CVT研究において再現可能で低侵襲かつ画像相性のあるアプローチを提供します。

概要

脳静脈血栓症(CVT)は、脳血管疾患の特殊なタイプであり、全脳卒中の0.5〜3%を占め、若年成人における脳卒中の重要な原因となっています。この疾患の中核的な病理学的変化は硬膜静脈洞および/または脳静脈内の血栓症であり、これにより脳静脈排液の障害が生じ、その結果、頭蓋内圧の上昇、脳浮腫、静脈梗塞、または出血を引き起こす2。その基礎となるメカニズムをより明確にし、新しい治療介入を評価するためには、信頼性が高く再現性の高い動物モデルが不可欠です。上矢状静脈洞(SSS)が最も影響を受けやすい部位であり、その浅い位置が手術を容易にするため、現在の動物実験では主に上矢状静脈洞血栓症(SSST)モデルが用いられています。

さまざまなモデリング手法の中で、塩化鉄(FeCl3)誘導法は、その操作の簡便さとコスト効率から、最も広く使われている技術の一つとなっています。このモデルでは、FeCl3 溶液の局所塗布が静脈洞内皮を直接損傷し、強い酸化特性により内皮下マトリックスを露出させます。この曝露は血小板の凝集と凝固カスケードを活性化し、最終的に静脈洞血栓症5を誘発します。しかし、他の方法と比べて、従来のFeCl3フィルター紙モデルにはいくつかの欠点もあります。最も重要な問題は、FeCl3 の常磁性特性と高い磁気感受性が磁気共鳴画像法(MRI)中に顕著なアーティファクトを生み出し、血栓評価や静脈洞再開化観察の精度を著しく損なうことです。さらに、フィルターペーパーの形状がSSSに合わず、副鼻腔を囲む脳実質を傷つけやすいです。したがって、SSS周囲の実質損傷が血栓症自体によるものなのか、FeCl3による直接的な化学的損傷によるものなのかを判断するのは困難です。

本研究の全体的な目標は、FeCl3による直接的な皮質損傷を減らし、SSS内の血流および血栓大きさの評価を可能にする修正FeCl3誘発SSSTラットモデルの確立です。本研究では、FeCl3浸潤縫合技術と中間アプローチを導入し、FeCl3による直接的な皮質化学的損傷を最小限に抑え、高解像度超音波を用いて静脈洞の血流および血栓形成をリアルタイムかつ非侵襲的かつ定量的にモニタリングすることを可能にします。

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プロトコル

このプロトコルは首都医科大学の動物実験・実験動物福祉委員会により承認され、承認番号は以下の通りです。AEEI-2025-138。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 修正FeCl3誘導ラットSSSTモデルの確立

  1. 実験には6〜7週齢のオスのスプラグ・ドーリー(SD)ラットを使用し、体重220〜250gです。手術前に、ラットを1週間慣らし、12時間食事を控えさせてください。
  2. 以下の試薬、器具、機器を準備してください:2%ペントバルビタール溶液、40%FeCl3 溶液、5%ポビドンヨウ素、生理食塩水、眼軟膏、使い捨てカミソリ刃、メス、外科用はさみ、鉗子、2-0および4-0シルク縫合糸、逆切断針、針ホルダー、1-mLおよび5-mL注射器、医療用テープ、齧歯類手術台、直腸温度プローブ付き温熱パッド、マイクロハンドヘルド頭蓋ドリル。
  3. 体重測定後、2%ペントバルビタール(50 mg/kg)を腹膜内注射(機関承認プロトコルに従い)で麻酔します。その後、後肢の皮膚を鉗子でつまみ、離脱や痛みの反応がないことを確認します。
  4. 眼科軟膏を塗り、使い捨てのカミソリで頭皮の毛を剃ります。
  5. 医療用テープでネズミを齧歯類の手術台に伏せに固定し、温熱パッドで体温を37 ± 0.2°Cに保ち、直腸プローブで中心体温を継続的に監視します。
  6. 頭皮を5%のポビドンヨウ素で消毒してください。
  7. 頭皮に15mmの正中間皮膚切開を入れ、その後、下の筋膜と骨膜を鈍く剥離して頭蓋骨を完全に露出させます。
  8. 頭蓋骨を頭蓋骨の薄くしてSSSを明確に露出させ、ラムダから始まり矢状縫合線に沿って前方10mmまで伸ばします。下部の硬膜やSSSを損傷させないためには断続的なドリル技術を用い、皮質への熱損傷を防ぐためにドリルビットを定期的に生理食塩水で洗浄してください。
  9. 露出したSSS表面に40%FeCl3 溶液で浸した2-0シルク縫合糸10mmのセグメントを5分間塗布し、その後新たに浸したセグメントに交換して再度5分間塗布します。
  10. 残留FeCl3を除去するために、0.5 mLの生理食塩水で手術フィールドを3回洗い流します。
  11. 4-0シルク縫合糸で中断縫合で皮膚を閉じ、その後ポビドンヨウ素消毒を行います。
  12. 完全に目覚めるまでネズミを観察し、その後ケージに戻します。

2. モデル確立の成功評価

注:手術中、LSCIは頭蓋窓作成後、FeCl3投与前、FeCl3投与および手術領域洗浄後、皮膚閉鎖前にSSS内の静脈血流を測定しました。このモデルは、SSS内の静脈血流が有意に減少した時点で確立されたとみなされます。

  1. LSCIと対応するソフトウェア(RFLSI v5.0)をオンにし、 オンラインモード ボタンを押します。
  2. 計測器の高さと位置を調整し、インジケーターレーザーが視野の中心に収まるまで調整します。
  3. ネズミをフォームプラットフォームに置き、SSSがインジケーターレーザーに合うまで位置を調整します。
  4. 画像がはっきり見えるまで倍率とピントを調整してください。擬似色の閾値の下限と上限を10と200に設定し、擬似カラー画像の視覚的外観を最適化します。
  5. ROIの設定ボタンを押し、円形ツールを選択してSSS領域を区画してください。
  6. 録画ボタンを押すと静脈血流を得て、オリジナルと擬似カラーの両方の画像を撮影できます。

3. 血栓面積/容積および血行動態の変化の評価

注意:処置後数日から数週間後は、高解像度超音波を使って血栓の変化や血管再開化の評価を行います。

  1. 以下の薬剤、器具、機器を準備してください:イソフルラン、超音波ジェル、使い捨てカミソリの刃、医療用テープ、小動物麻酔装置、高解像度小動物超音波・光音響イメージングシステム、70MHz超高周波UHF57xリニアアレイトランスデューサー、3D取得モーター。
  2. 3D捕捉モーターとUHF57xトランスデューサーを取り付けてください。次にモーターを初期化します。
  3. 誘導チャンバーで3%イソフルランと1L/minの酸素を混ぜて麻酔します。
  4. ラットを37°Cのサーモスタットイメージングプレートに伏せ、頭部と四肢は医療用テープで優しく固定し、鼻のコーンを通して1.5%-2%イソフルランで麻酔を維持します。
  5. 使い捨てのカミソリで頭皮の毛を剃り、検出部位を露出させ、その後超音波ジェルを塗布します。
  6. ラットの位置と向きを調整し、SSSと腔内血栓が明確に見えるまで調整します。
  7. 3Dイメージング(Bモード、ステップサイズ0.04mm)を用いて、矢状面および冠状面の両方のSSSの逐次トモグラフィー画像を取得します。
  8. SSS内の血流をカラードップラーモードで観察し、その後パルス波(PW)ドップラーモードで血流速度を測定します。
  9. 完全に目覚めてから麻酔を中止し、ケージに戻してください。
  10. 画像をエクスポートし、Vevo LABソフトウェアで解析します。SSSにおける最大矢状面および冠状断面積、血栓の容積、洞の最大血流速度を記録します。

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結果

修正FeCl3誘導SSSTモデルの回路図は 図1に示されています。実験結果により、FeCl3飽和シルク縫合糸をSSSに適用した後、LSCIは局所血流の著しい減少を検出し、静脈洞の閉塞に成功したことを示し、動的灌流変化の検出におけるLSCIの感度を確認しました(図2)。術後7日目に小動物の超音波検査により、SSSに部分的な腔内再開化を伴う血栓形成が確認されました(図3)。Vevo LABソフトウェアは超音波画像の解析に用いられ、矢状面および冠状面の断面積や血栓の体積、残留腔内の血流速度を取得しました(図3 および 図4)。

これらの結果は、FeCl3浸潤縫合...

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ディスカッション

CVTはまれですが、生命を脅かす可能性のある特定の脳血管疾患です。病理学的メカニズムをさらに調査し効果的な介入戦略を開発するために、研究者たちはSSSTの動物モデルを確立しており、主にSSS結紮または閉塞7,8,9、血栓前注射10、自己血栓注入11、光化学誘導12、FeCl₃誘導4が含まれます.これらの中でも、SSSの結紮または閉塞モデルは血栓の自然溶解過程をシミュレートできず、治療効果評価には適していません。血栓前注射は薬物が全身循環に拡散し、非標的部位血栓症を引き起こすリスクがあります

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(82401527)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL シリンジ深圳華洋バイオテクノロジー有限公司21-3020
2-0シルク縫合線上海浦東金環医療製品有限公司A224
3D取得モーターフジフイルム・ビジュアルソニックスhttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
4-0シルク縫合上海浦東金環医療製品有限公司A222
5%ポビドンヨウ素山東リルコン医療技術有限公司https://www.lircon.cn/products_details/100.html
5mLシリンジ深圳華洋バイオテクノロジー有限公司21-3023
使い捨てカミソリの刃東陽進民貿易有限公司ST300
FeCl3マックリンI811935
ヒートパッド深圳華洋バイオテクノロジー有限公司36-0001
イソフルランRWDライフサイエンスR510-22-10
レーザースペックルイメージングシステムRWDライフサイエンスRFLSI III
リニアアレイトランスデューサーフジフイルム・ビジュアルソニックスUHF57x
医療用テープ蘇州コンリダ医療用品有限公司B02
マイクロハンドヘルド頭蓋ドリルRWDライフサイエンス78001
ニードルホルダーRWDライフサイエンスF31025-13
生理食塩水上海ビヨタイムバイオテクノロジー有限公司ST341-500ml
眼科軟膏深圳華洋バイオテクノロジー有限公司19-7223
逆切断針上海浦東金環医療製品有限公司TJ-3-514
齧歯類の操作プラットフォーム上海玉岩科学機器有限公司30150
メスブレードRWDライフサイエンスS31015-01
メス柄RWDライフサイエンスS32003-12
小動物麻酔装置RWDライフサイエンスR500
小動物超音波および光音響イメージングシステムフジフイルム・ビジュアルソニックスヴェーヴォF2
滑らかな鉗子RWDライフサイエンスF12013-10
ナトリウムペントバルビタールシグマ・オルドリッチ(上海)トレーディング株式会社P3761
外科用ハサミRWDライフサイエンスS14014-10
鉗子付き鉗子RWDライフサイエンスF12011-13
超音波ジェル山東リルコン医療技術有限公司https://www.lircon.cn/products_details/230.html

参考文献

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