HER2陽性乳がんにおけるドレーンおよび転移性リンパ節のRNAセクシープロファイリングにより、POSTNが予後マーカーとして特定されました

サマリー

HER2陽性乳がんにおけるリンパ節の寄在の基盤となる細胞外マトリックスおよびPI3K-AKT中心プログラムを明らかにし、POSTNを予後不良のマーカーとして特定し、リスク階層化および経路指向型治療戦略を支持します。

要約

HER2陽性乳がんは臨床的に攻撃的で、しばしば局所リンパ節に転移しますが、リンパ節転移に関連するトランスクリプトミクスプログラムは完全には定義されていません。本研究では、HER2陽性乳がん患者6名からRNAシーケンシング(RNA-seq)を用いて、腫瘍排出リンパ節(TDLN)および転移性腫瘍関与リンパ節(TMLN)をプロファイル化しました。微分表現解析は DESeq2を用いて行われ、ベンジャミニ・ホッホバーグ補正(FDR < 0.05)と絶対log2フォールド変化閾値(|log2FC| ≥ 1)を適用しました。237の差異発現遺伝子(TMLNとTDLNで182がアップレギュレーション、55がダウンレギュレーション)を特定しました。機能豊化解析では、細胞外マトリックス(ECM)-受容体相互作用、PI3K-AKTシグナル伝達、局所癒着、コレステロール代謝が転移性リンパ節に関連する重要な経路であることが明らかになり、リンパ節の分散における協調的なECM再構築とシグナル活性化が示唆されました。最も上位調節された遺伝子の中で、 POSTN は主要な候補として浮上し、さらに有害な臨床病理学的特徴とも関連しています。独立した検証コホート(n = 120)では、 POSTN 発現が高いほど無疾患生存率が劣ることと関連していました。これらの結果は総合的に、 POSTN を予後バイオマーカーとして挙げ、ECM中心およびPI3K-AKT関連メカニズムをHER2陽性乳がんにおけるリンパ節転移の実用的な生物学的特徴として支持しています。

概要

乳がん(BC)は女性で最も頻繁に診断されるがんであり、世界的にがん死亡率の主要な原因の一つです。中国ではその負担が大きく増加^{しています。}約15%〜20%の避妊薬がHER2陽性(HER2+)であり、ERBB2の増幅・過剰発現と、再発や死亡リスクが高い攻撃的な表現型を特徴としています^2,3。抗HER2全身療法は著しく転帰を改善しましたが、それでもなお多くの患者が再発や転移を起こしており、生物学的情報に基づくリスク階層化と新たな治療選択肢の必要性を強調しています^。

リンパ節転移(LNM)は、BCにおける病期決定、補助治療の選択、予後を決定する重要な要因です。腋窩の関与は生存率が低下し、遠方の臓器へのさらなる感染拡大を促進します^5,6。しかし、HER2+疾患におけるリンパ節転移の生物学的特徴を捉える堅牢なバイオマーカーは依然として限られており、現在の臨床病理学的要因はアウトカムの異質性を部分的にしか説明していません^。

RNA-seqの進歩により、トランスクリプトーム全体にわたる高ダイナミックレンジプロファイリングが可能となり、現在ではトランスレーショナル腫瘍学⁸で広く採用されています。しかし、HER2+ BCにおける発現研究の多くは原発腫瘍や未ペアコホートに焦点を当てており、一致した腫瘍排出リンパ節(TDLN)と腫瘍転移性リンパ節(TMLN)の比較プロファイリングは乏しく、リンパ節定着と進行の基盤となる分子プログラムへの洞察が限^{られています。}

リンパ節転移の臨床的重要性と、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよびPI3K-AKT活性化が転^移性シーディングに関与するという既存証拠に基づき、同一患者内で腫瘍転移性リンパ節(TMLN)は、適合した腫瘍ドレンリンパ節(TDLN)と異なるトランスクリプトミームプログラムを示し、一貫して上調したECM関連遺伝子の一部が有害な臨床病理学的特徴と関連していると仮説を立てました。再発リスク。この仮説を検証するために、6人のHER2陽性患者からペアのTDLNおよびTMLNをプロファイルし、リンパ節の分散に関連する差異発現遺伝子(DEG)および経路を特定しました。次にPOSTNを優先し、独立したコホートでその予後関連性を評価し、ECMリモデリングとPI3K-AKTシグナル伝達をHER2+乳がんにおける臨床的に有用なリスク層化に結びつけました。HER2評価(現代のASCO-CAP基準に基づく)、シーケンス品質管理、DESeq2およびベンジャミニ・ホッホバーグFDRコントロールを用いたDEGコール、検証手順の詳細^{はここに記載されています。}

プロトコル

この研究は機関倫理委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言および人間の生体標本使用を規定する現地規則に従って実施されました。本研究は中山博愛病院の倫理委員会(KY-2020-012-124)によって承認されました。研究特有の処置の前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得しました。

研究コホートとサンプル
発見コホートは、HER2陽性乳がん患者6名から術中採取された腫瘍排出リンパ節(TDLN)および転移性リンパ節(TMLN)組織をペアに含んでいました。各患者について、一致したTDLNは転移の組織学的証拠がないドレンディングリンパ節と定義され、患者内対照群として機能しました。一方、TMLNは病理学的に確認された転移性組織でした。新鮮な組織は冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で短時間洗浄され、摘出後30分以内に液体窒素で吸い取って乾燥させ、-80°Cで保存して抽出しました。選択基準は、病理学的に確定した浸潤性乳がん、ASCO/CAPによるHER2陽性、ペアリンパ節の有無、および新補助療法の有無でした。除外基準は、組織またはRNA完全性数(RIN)が不十分<7.0でした。最初にスクリーニングされた1例はRIN<7.0のためQCに失敗し除外されたため、すべての発見解析では一貫してn=6が用いられています。独立した検証コホートは、臨床フォローアップ付きの120件のアーカイブFFPEリンパ節標本で構成され、qRT-PCRおよびアウトカム解析に使用されました。予後モデルのため、患者はPOSTN発現群(高・低、カットポイントはXタイルで決定)で比較され、低群が参照比較対象となりました。追跡調査欠損や不完全な共変量の症例は予後モデルから除外されました。

サンプルサイズの理由(発見と検証)
発見段階では、患者内コントラストを最大化し、個人間分散を低減しつつ、FDR = 0.05での多重性を制御するために、TDLN-TMLNペア設計が用いられました。検証コホート(n = 120)では、Xタイルで決定されたカットポイント(High/Low = 40/80)で POSTN 表現が二分化されました。48件の無病生存(DFS)事象と α = 0.05 を用いると、シェーンフェルド近似は均等配分下で臨床的に関連≥危険比約 HR ≥ 2.3 の検出確率が80%であることを示しています。これは観察された効果量(HR = 2.31、95% CI 1.41-3.77)と一致しています。

HER2陽性の定義
HER2陽性率は当時の ASCO/CAP 基準¹³に従いました。免疫組織化学(IHC)3+は腫瘍細胞の>10%における均一で強い膜染色、または SISH 増幅された HER2/CEP17 比≥2.0で平均HER2コピー数≥1細胞あたり4.0シグナル)と定義されました。IHC 2+の結果は反射性ISHを受け、≥20個の浸潤腫瘍細胞の盲検再計数により増幅状態を確認しました。

組織処理とRNA単離
すべての処置は、指定がない限り氷上で行われ、RNaseフリーの消耗品を使用していました。100 mg組織≤サンプルごとに、酸性グアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルム試薬(AGPC)で均質化し、その後200 μLのクロロホルムを加え、15秒の激しい混合と2〜3分間の室温培養を行いました。相分離は12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離することで達成されました。 水層は新しいチューブに移され、室温で10分間の培養後に500μLのイソプロパノールとともにRNAを沈殿させました。ペルト化は12,000 x g で4°Cで10分間完了しました。 ペレットは75%エタノール1mLで洗浄され、7,500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、5〜10分間空気乾燥させ、RNaseフリーの水に溶解しました。ゲノムDNAの持ち越しが疑われる場合は、オンカラムのDNase I消化が用いられました。目視チェックポイントには、クロロホルム抽出後の明確な相分離と、イソプロパノール沈殿後の完全な半透明ペレットが含まれていました。トラブルシューティングには、A260/230比率が低い場合にエタノール洗浄を繰り返し、降水時間を延長したり、ペレット生産中の冷却を確保して低収量にすることが含まれていました。

RNA品質管理
定量化では分光光度法を用いてA260/280およびA260/230を1.8〜2.1のターゲットで監視し、精度を高めるために蛍光測定を補完しました。完全性はマイクロ流体電気泳動システムで評価され、RIN ≥ 7.0が必要でした。18S/28S rRNAの異なるピークとゲノムDNAスメアの欠如が受容基準として用いられました。閾値に満たないサンプルは再抽出または除外されました。

図書館の準備
鎖状mRNAライブラリーは、完全なRNAに対してpoly(A)選択で構築され、部分的に分解された入力にはrRNAの枯渇が認められました。典型的な入力はライブラリーあたり≥1μgのRNAでした。断片化は94°C付近で8分間行われました。50°Cで50分間、第一鎖cDNA合成を行います。16°Cで60分間の第二鎖合成;アダプター接続は20°Cで15分間行われます。PCR増幅は過剰増幅を避けるために10〜12サイクルを調整しました。クリーンアップではビーズ比が0.8x〜1.0x付近で、ライブラリサイズ分布はアダプターを含め300 bpでした。ライブラリの品質はマイクロ流体電気泳動によって検証されました。アダプターとダイマーの汚染により、より厳格なクリーンアップが行われ、過度に広範囲の分布は断片化をわずかに短縮することで修正されました。

シーケンス
インデックスライブラリはペアエンド150 bp(PE150)モードでシーケンスされ、1ライブラリあたり3,000万のリードペアを目標としていました。ランレベルの品質にはQ30≥90%と安定したクラスター密度、最小限のレーンバイアスが求められました。バッチ効果を軽減するためにライブラリはレーンごとにランダム化され、記録されたレーン割り当てや交差汚染監視用のセンチネルコントロールも記録されました。

計算解析と微分表現
解析はLinux上のR(v4.3.2)で行われました。生の読み取り品質はFastQC(v0.11.9)で評価されました。adaptおよび品質トリミングはfastp(v0.23.4)で、自動アダプター検出、スライディングウィンドウトリミング(ウィンドウサイズ4 bp;平均Phred Q ≥ 20)、最小読み取り長50 bp、および関連する化学反応が検出された際のポリ-Gトリミングを用いて実施されました。リードはHISAT2(v2.2.1)を用いてGRCh37/hg19参照ゲノムにアラインメントされ、ライブラリに適した鎖性パラメータと既知のスプライスサイトインデックスを用いました。遺伝子レベルのカウントは、paired-end counting、chimeric-readハンドリング、マルチマッパー認識設定、正しい鎖フラグを用いてGENCODE v19に対して、featureCounts(Subread v2.0.3)で生成されました。低カウント遺伝子は、少なくとも3つのサンプルで10≥カウントを要求することでフィルタリングされました。DESeq2(v1.40.2)を用いてペアデザイン(design = ~ pair + condition)を用いて、TMLNとTDLNを比較し、apeglmを用いたデフォルトサイズファクター正規化とlog2折り変化縮小を用いて差分表現(DE)解析を行いました。潜在的な外れ値はクックの距離を用いて評価されました。トランスクリプトーム全体の多重度はベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率(FDR)を用いて制御されました。有意性はFDR<0.05と絶対log2フォールド変化閾値(|log2FC|)≥1と定義されました。DESeq2の負の二項フレームワークは、カウントデータに対して適切な平均分散モデリングを提供し、小規模から中規模のコホートにおける折りたたみ変化推定値を安定化させます。感度解析として、同じフィルタリング基準とFDR閾値を用いてedgeRとlimma-voomを用いたDE検定を再実施し、整合した上位評価の信号が得られ、主要な解析選択の堅牢性を支持しました。

機能的濃縮(GOおよびKEGG)
機能的注釈はclusterProfiler(v4.8.3)を用いてRで実行されました。アップレギュレーションDEGとダウンレギュレーションDEGは別々に解析されました。遺伝子識別子はエントレズ遺伝子ID(生物:ホモ・サピエンス)にマッピングされ、リッチメントが行われました。遺伝子オントロジー(GO)の濃縮はenrichGO(OrgDb: org.Hs.eg.db;ONT = BP/CC/MF;pAdjustMethod = "BH";pvalueCutoff = 0.05;qvalueCutoff = 0.05)を用いてKEGG経路の濃縮はenrichKEGGを用いて行われました(生物 = 「has」; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0.05; qvalueCutoff = 0.05)。背景宇宙は、DE解析で低カウントフィルタリング後に保持されたすべての発現遺伝子と定義されました。さらに、10〜500個の注釈付き遺伝子(minGSSize = 10、maxGSSize = 500)を含む遺伝子セットを保持するために、濃縮項をフィルタリングしました。可視化はggplot2(v3.5.1)およびComplexHeatmap(v2.16.1)を用いて生成され、遺伝子比率と-log10(調整済みP値)のドットプロットも含まれます。「免疫応答経路」という用語は、抗原処理と提示、インターフェロンシグナル伝達、リンパ球活性化をカバーする厳選されたGOモジュールを指します。

外部データベース照会
候補遺伝子は外部リソースで調査され、直交する文脈が提供されました。腫瘍と正常mRNAの発現を、TCGA浸潤がん(TCGA-BRCA)腫瘍サンプルと正常な乳腺組織(利用可能なGTEx/TCGA正常)と比較して、腫瘍と正常mRNA発現を照会しました。GEPIA2で報告された発現値(log2[TPM+1])およびその標準統計的比較枠組みを用いて、各調査遺伝子のボックスプロットとP値を作成しました。ヒトプロテインアトラス(HPA)を用いて、ヒトプロテインアトラスを用いて、組織アトラスおよび病理アトラスの免疫組織化学画像や注釈をレビューし、利用可能な場合は報告された染色強度および細胞区画(例:間質面か上皮か)を記録しました。

qRT-PCR検証
独立したリンパ節組織を前述のように処理して全RNAを抽出し、1 μg RNAから20 μL逆転写反応でcDNAを合成しました。定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)はSYBRベースの化学を用いて行われ、各反応には1つのマスターミックスと各プライマーの0.2〜0.4μMが含まれていました。プライマー特異性はシングルピークメルトカーブプロファイルで確認され、希釈系列標準曲線を用いて増幅効率は90%〜110%と定義されました。各サンプルは技術的三重に分析されました。複製株はサイクル閾値(Ct)の標準差0.3≤を満たす必要がありました。遺伝子発現はGAPDH(または該当する場合は他の検証済み参照遺伝子)に正規化され、相対発現は2^-ΔΔCt法を用いて計算されました。正常性はシャピロ・ウィルク検定を用いて評価されました。群間比較では、ほぼ正規データに対して両側t検定を用い、それ以外の場合はマン・ホイットニーU検定を用いました。

検証コホートにおける予後解析
無病症生存期間(DFS)が主要評価項目であり、手術日から最初に再発が記録された事象または最後の追跡(検閲)まで計算されました。一次解析では、Xタイルで決定されたカットポイント(高対低=40/80)で POSTN の発現を二分化しました。感度解析では三重形などの代替カットポイントが用いられました。一変数比較にはカプラン・マイヤー曲線と対数ランク検定が用いられました。多変数Cox比例ハザードモデルは、年齢、腫瘍の大きさ、結節の状態、組織学的グレード、受容体の状態を事前に調整し、ハザード比(HR)および95%信頼区間を推定するために適合されました。比例的ハザード仮定はシェーンフェルド残差を用いて評価され、共線性は分散インフレーション係数を用いて検証され、影響力のある観察値はdfbetaを用いて評価されました。上記のように、追跡調査欠損や不完全な共変量を持つ症例を除外した後に完全な症例解析が実施されました。

一般統計と報告
特に記載がない限り、データは平均標準差または中央値(IQR)±要括し、両側検定が用いられ、p < 0.05は統計的に有意とみなされます。トランスクリプトーム全体解析および濃縮については、多重性をBH-FDRで制御し、効果量には可能な限り95%信頼区間が付随します。

安全性と廃棄物処理
フェノール・グアニジニウム試薬および有機溶媒は、認証済みの煙幕フードで取り扱い、実験室用コート、ニトリル手袋、スプラッシュ防止装置を装着しました。有機廃棄物およびハロゲン化廃棄物は、ラベル付き容器に分類され、機関の方針に従って処分されました。生物廃棄物は処分前にオートクレーブまたは化学消毒され、表面や道具はRNase不活化溶液で除染されました。腐食性や毒性などの試薬特異的危険は、実験室の標準作業手順(SOP)に記録され、すべての手順で観察されました。

結果

コホートと臨床病理学的特徴
発見コホートは6つのペアTDLN/TMLNサンプルで構成され、検証コホートは縦断的追跡調査を含む120個のアーカイブリンパ節標本で構成されました。両コホートの基礎臨床病理学的特徴(年齢、腫瘍大きさ、グレード、受容体の状態、結節の状態など)は表 1にまとめられています。

シーケンス品質とグローバルデータ構造
12の発見ライブラリすべてがサンプルあたり約3,000万リードペアの中央値を記録し、Q30は90%≥、マッピング率>85%に達しました。分散安定化カウントの主成分解析では外れ値は見られず、ノードの状態による分離が期待されており、TDLNとTMLNは明確なクラスターを形成しました。ゲノム全体の差異発現の概要は図1A-Bに示されており、リード深さ、重複率、割り当て率などのランレベルおよびサンプルレベルの品質指標は、表2

ディスカッション

HER2陽性乳がんは、侵襲性の強化、リンパ節転移(LNM)の頻繁性、そして現代の全身療法にもかかわらず劣悪な予帰を特徴とします¹⁵。従来の臨床病理学的要因はこのサブタイプにおける予後を部分的にしか説明できず、リンパ節転播リスクを捉える生物学的根拠のあるマーカーには空白が生じます¹⁶。腫瘍排出リンパ節(TDLN)および腫瘍転移リンパ節(TMLN)をRNA-seqで比較プロファイリングすることで、細胞外マトリックス(ECM)リモデリング、免疫および抗原提示プログラム、転移能力およびリンパ節ニッチ適応に関与する脂質代謝経路軸に収束する237の差異発現遺伝子(DEGs)を特定しました¹⁷。

遺伝子オントロジーのカテゴリーは、インターフェロン介在シグナル伝達、抗原処理および提示、小胞輸送、MHC複合体構成要素を強調し、コロ^{ナイゼー...}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バイオアナライザー	2100-BA	アジレント、アメリカ	RNAの完全性および品質管理を評価するための装置。
DESeq2	該当なし	Rバイオコンダクター	RNA-seqデータ用の差別発現解析ソフトウェア。
FastQCソフトウェア	該当なし	バブラハム・バイオインフォマティクス	RNA-seqデータによる配列品質評価のための品質管理ソフトウェア。
HEK293細胞株	ATCC-CRL-1573	ATCC、アメリカ	トランスフェクション実験に使用されたヒト胚性腎細胞株。
qRT-PCRキット	4385616	サーモフィッシャー、アメリカ	遺伝子発現の検証のための定量PCRキット。
RNA抽出キット	74204	ドイツ、キアゲン	組織サンプルから高品質なRNAを分離するために使用されたRNA抽出キット。
RNAシーケンシングキット	RS-122-2001	イルミナ、アメリカ	RNAサンプルのシーケンス用RNAライブラリー調製キット。
シーケンスプラットフォーム	ノヴァセク6000	イルミナ、アメリカ	RNAライブラリのシーケンシングのためのハイスループットRNAシーケンシングプラットフォーム。
組織凍結装置	TFE-300	サーモフィッシャー、アメリカ	液体窒素で組織サンプルを凍結する装置。
鼓膜温度計	55678-TT	ThermoScience、日本	体温測定に使われる正確な体温計。