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方法論記事

ラット光内MCAOモデルの標準化:品質管理措置を含む詳細なプロトコル

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DOI:

10.3791/69573

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2026年8月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ラットにおける最適化された60分間中大脳動脈閉塞(MCAO)技術を示しています。このプロトコルはマルチモーダル手法を用いて検証されており、87.5%の成功率と最小限の死亡率、脳卒中研究における梗塞および行動の再現性のあるアウトカムを得ています。

要約

ラット中脳動脈閉塞(MCAO)モデルは、虚血性脳卒中の病態生理を解明し、神経保護療法の検証を目的とした基準として依然として存在しています。しかし、微妙な手術の逸脱は、梗塞量や行動の結果を大きく変えることがあります。「可視化→体系化」の枠組みを用いて、モデル確立と検証の各ステップを再検討しました。解剖学的な向きとフィラメント配置の標準化のために、主要な外科的ランドマークや重要な手順の詳細な写真記録が行われました。2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)染色を用いて、再灌流後24時間および72時間後の梗塞の体積とトポロジーを正確にマッピングしました。神経学的欠損はZea-Longa、Bederson、修正Garciaスケールで評価されました。24匹のオスのスプラグ・ドーリーラットは60分間の一時的なMCAOを受けました。24時間および72時間で梗塞量と神経学スコアが評価されました。約87.50%の動物が脳血流遮断(Zea-Longa ≥1および明確なTTC定義梗塞)を達成し、全体の死亡率は12.50%で、モデルの高い忠実度を証明しています。この標準化されたプロトコルは、前臨床脳卒中研究の技術的に洗練され再現可能な基盤を提供し、脳卒中の病態生理学および治療的介入を調査する研究における研究室間の一貫性を促進します。

概要

脳卒中は世界で2番目に多い死因であり、世界で3番目に多い障害原因です1,2。脳卒中は低・中所得国に不均衡に影響を及ぼし、平均して高所得国より15年早く発症します。主な2つのタイプは虚血性脳卒中(85%)と脳内出血(15%)です。脳卒中の大多数を占める虚血性脳卒中は、脳血流の遮断が原因で、細胞死や脳梗塞を引き起こします。虚血カスケードは複数の生化学的イベントを含み、重要な酸化促進過程5,6。

広範な前臨床および臨床的努力にもかかわらず、効果が証明された治療法はごくわずかであり、特に組織プラスミノゲン活性剤を用いた静脈内血栓溶解術や機械的血栓切除術が挙げられます。これらの治療は治療期間が狭く、患者選択基準も厳格です。したがって、虚血性損傷、神経血管修復、脳卒中後の回復の細胞および分子メカニズムを解明することが緊急に求められています。再現性があり臨床的に関連性の高い動物モデルは、この目標を達成するために不可欠です。

中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルは、齧歯類の虚血性脳卒中を探るために広く用いられています。イントラルミナルフィラメント閉塞法は、MCAO技術の中でも最も古典的かつ広く使われているものの一つです。この技術は頭蓋切除術を必要とせずに、永久閉塞と一過性閉塞の両方をモデル化できます。血管内ワイヤーを用いた新しい経大腿骨技術は、ラットにおいて一時的なMCAOを誘発する可能性を示し、より一貫した結果をもたらすことが示されています10。このモデルは、通常、内腔内フィラメント技術11を用いて中大脳動脈を閉塞します。MCAOは局所性脳低灌流を引き起こし、虚血および再灌流損傷を引き起こします12。

MCAOは脳卒中の病態生理や治療法の研究に有用ですが、病変容積が変動することがあります7。したがって、再灌流技術の洗練、標準化された運用プロトコルの確立、統一評価基準の開発など、MCAOモデルの改善により、梗塞部位や体積の変動を減らし、虚血性脳卒中研究における有用性が高まります。

このプロトコルは、一貫した結果を得るために約10〜15回の手術を学習する必要があります。13。成功率はオペレーターの経験やラット株によって異なる場合があります。このモデルは急性虚血性脳卒中の研究に適していますが、高血圧や糖尿病などのヒトの併存症を完全に再現できるとは限りません。それに伴い、標準化された手順と厳格な品質管理措置を通じて実験の変動を減らすことを目的とした最適化されたMCAOプロトコルを考案し、厳密に検証することを目指しました。標準化とデータ信頼性の二重向上を達成するために、4つの補完的な革新が統合されました。(1) 二重時間点の縦断評価—Zea-Longa、Bederson、Modified Garciaスケールの神経学スコアを、再灌流後24時間および72時間後に2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)由来の梗塞体積と並行して取得し、浮腫の解消と機能回復の時間的関係を明確にした;(2) 三重スケールクロスバリデーション—盲検二重調査者スコアリングと統合トライスケール比較により、行動評価の感度と精度が大幅に向上した;(3) 全過程低温速断面法—「90秒氷浴抽出後、事前冷却型での単一段階2mmコロナスライシング」という標準操作手順(SOP)が確立され、オートリシスや人的ミスを最小限に抑え、高精度な体積測定を実現しました。(4) 統合品質管理フレームワーク—術前断食、麻酔深度管理、術前体温調節、交差汚染防止を含む包括的な標準作業手順(SOP)を構築し、再現可能かつ容易に移転可能なMCAO標準作業手順を提供し、実験室間の一貫性と試験間比較可能性の確かな基盤を築きました。

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プロトコル

この実験は首都医科大学の施設動物実験・実験動物福祉委員会によって承認・監督されました。すべてのプロトコルはNIHの実験動物ケア・使用ガイド(NIH出版物80-23、1996年改訂版)に準拠しており、滅菌機器および無菌技術が求められています。

1. 動物選択

  1. 認定実験動物提供者(ライセンス番号)から入手した、生後6〜8週、体重240〜270gのオスのスプラグ・ドーリーラットを使用してください。SCXK(北京)2021-0011)でMCAOのモデルを確立するために。
  2. 動物は自由に食事と水を用意して慣習的に飼育し、すべての手続きは国際倫理規定に従って行われました。
  3. フィラメントサイズの選択には、動物の体重に基づく以下の基準を用いて、一貫した閉塞を確保しましょう。
    - 220–250 g:直径0.33–0.35 mm
    - 250–280 g:直径0.35–0.38 mm
    - 280–310 g:直径0.38–0.40 mm
    注:これらの仕様は、加齢に伴う血管径の増加を考慮し、SAHや不完全閉塞の発生率を低減します。

2. サンプルサイズ

  1. サンプルサイズ計算ソフトを使ってサンプルサイズを計算してください。MCAO群で予想梗塞量が35%±10%(平均±標準標準差)であるのに対し、SHAM群では0%±2%であることを示す予備データに基づき、効果量(コーエンズd)を推定します。2尾のマン・ホイットニーU検定(t検定のノンパラメトリック代替)を用い、α=0.05、べき乗(1-β)=0.80の場合、最小サンプルサイズを計算します。
    注:効果量は3.5と推定され、最小サンプル数は1グループあたり6頭でした。
  2. 予想死亡率(12.5%)および除外率(5–10%)を考慮し、MCAO群に24頭、SHAM群に6頭のラットを含め、主要評価項目(24時間時の梗塞容積)に対して十分な検密度(>0.90)を提供しました。

3. 参加基準および除外基準

  1. 以下の条件を満たす動物を含めてください:(1) オスのスプラグ・ドーリーラット、体重240〜270g、生後6〜8週;(2) 既存の神経学的欠損がない(術前神経学スコア=0);(3) 合併症なしの麻酔誘導の成功。
  2. 以下を示す動物は分析から除外します:(1) 検死時に認められたくも膜下出血(SAH);(2) 再灌流後<24時間以内の早期死亡で、実験的介入とは無関係;(3) 閉塞失敗(神経学的スコア=0かつTTCによる梗塞の欠如);(4) 技術的な外科的失敗(例:CCA破裂)。
    注:これらの基準は選択バイアスを最小限に抑えるため、研究開始前に事前に指定されました。
  3. 動物の置換方針:統計的検出力を維持するため、技術的外科的失敗または術中死亡により除外された動物のみを置き換えます。不成功なモデル化(閉塞失敗)で動物を置き換えるのではなく、成功率計算の一部として報告して変動を人工的に減らさないようにしましょう。

4. 術前準備

  1. オートクレーブされた道具、滅菌フィラメント、そしてドレープされたフィールドを用意してください。
  2. 定期的な断食は必要ありません。必要に応じて断食時間を2〜4時間に制限してください。イソフルラン(3–4%)で麻酔を誘導し、手術中は30–40%のO₂で1.5–2%を維持します。矯正反射とつまみの喪失で麻酔の深さを確認してください。
  3. 直腸温度モニタリング付きのフィードバック制御温±で体温を370.5°Cに保ちます。
  4. 首と頭皮を剃り、その後ポビドンヨウ素で洗浄し、その後70%エタノールを塗ります。
  5. 手術の30分前から術後12時間ごとに、ブプレノルフィン(0.05 mg/kg、皮下投与)を48時間投与、またはメロキシカム(1 mg/kg、皮下投与)を1日1回、3日間16日間投与します。グルーミング行動、姿勢、自発的な活動をモニタリングして痛みを評価し、不快感が続く場合は追加の鎮痛剤を投与してください。

5. MCAの閉塞

  1. ラットを背中横たわりにし、頭を優しく伸ばして腹側の首を露出させます。
  2. 虹彩ハサミを使って頸椎の中央線(1.5〜2.0cm)切開を行います。
  3. 曲がった鉗子を使って胸骨丸突起筋と対面舌骨筋を鈍く分離し、左頸動脈総分岐部(CCA)を露出させます。
  4. 外頸動脈(ECA)は遠位に永久的な4-0シルク縫合糸で結紮し、近位には仮結紮で固定します。2つのECA結紮の間に微細なハサミを使って小さな切開を開けます。
  5. 微小血管クランプ(60g圧)で一時的にCCAおよび内頸動脈(ICA)を閉塞します。
  6. ECA切開部に直径0.35〜0.40mmの4-0シリコーンコーティング単線フィラメントを挿入します。逆行的にCCAに進め、CCA分岐点を越えてICAに再誘導します。
    注意:フィラメントが翼口蓋動脈(PPA)ではなく、外側に分岐する翼口蓋動脈(PPA)ではなく、頭蓋基部に向かってICAに入ることを確認してください。<10mmで抵抗が発生した場合は、フィラメントを引っ込め、動物の頭部を反対側に30°回転させ、PPA原点を越えて再進します。
  7. フィラメントをCCA分岐部から18〜20 mm進め、わずかな抵抗がMCA原点の閉塞を示すまで進めます。フィラメントのあらかじめマークされた基準線(シリコーンストッパーから2mm近位に位置)を用いて深さを確認し、ECA切り株挿入点からキャリパーで測定します。フィラメントが所定の位置に入ったらCCAクランプを外します。

6. 再灌流

  1. 閉塞が60分経ったら、切開部を再び開け、一時的なECA結紮を緩めます。
  2. フィラメントの先端がECA断崖を越えるまで優しく引き抜き、血流を回復させます。背中出血を防ぐために、切断部の近位部に速やかに永久結紮をしてください。傷を何層にも分けて閉じてください。
  3. ラットを温められた回復ケージに移し、継続的なモニタリングを行います。

7. 偽手術

  1. 上記の手順(断食、麻酔、温度管理、無菌ドレープ)に従って動物を準備します。
  2. 上記のように頸椎切開およびCCA分岐露出を行います。
  3. 血管を解剖して露出させろ。フィラメントは挿入しないでください。
  4. 動脈は開通したままにしておく。脳虚血を誘発しないでください。
  5. 10分間曝露した後、切開部を層状に閉じます。動物を温めたリカバリーケージに移し、モニタリングを行います。

8. 術後神経学スコア

  1. 再灌流後24時間および72時間後に、梗塞容積測定の犠牲直前に評価してください。
  2. 静かな部屋で、25°Cで30分間慣れさせてください。
  3. グループ割り当てを盲目にした独立した調査員2名を配置します。各研究者に相談せずに別々の用紙にスコアを記録しさせること;評価者間≥1ポイントの差があれば再評価が行われます。
  4. スケール(投与順):Zea-Longa17(表1)、Bederson18 (表2)、修正Garcia19 (表3)のスコアリングを行い、最新の公開プロトコルに従い一貫した基準を確保します。
  5. 統計分析には2人の観測者の平均を用います。平均スコアが>10%差がある場合は、動物のデータを除外し、新しい被験者に置き換えます。

9. 脳梗塞量の測定

  1. 再灌流後24時間と72時間後に、5%イソフルランでラットを深く麻酔します。復位反射と足のつまみ反応の喪失、呼吸の安定による深麻酔の確認を行ってから進めてください。
  2. 深麻酔確認後90秒以内に脳を素早く摘出し、氷のように冷たいPBSで洗い流し、冷えたラット脳マトリックスで2mmの冠状スライスに切ります。スライス作業中は以下の注意点を守ってください
    1. 全ての処置は0〜4°Cの氷に保管してください。90秒以内に脳を採取し、冷えたマトリックスに平らに置きます。
    2. 鋭い刃を使って、正確な2mmの冠状断片を単一できれいに切り、各断片を前尾順に氷のように冷たいPBSに集めます。
    3. 交差汚染を防ぐため、動物間で75%エタノールでマトリックスと刃をすぐに清掃してください。
  3. 2%のTTCを37°Cに予温めた後、スライスを完全に浸し、暗闇で20分間孵育し、20分ごとに5分ごとに優しく回します。
  4. 反応をすぐに止めるために、4°C PBSで3回洗い流します。その後、4%パラホルマルデヒドを4°Cで一晩固定します。
  5. 300dpiで、すべてのスライスの両面を一度ずつ撮影します。
    1. 白い背景に固定照明を使い、影や反射を除去しましょう。
    2. スライスを重なりつかずに平らに敷き、各フレームにスケールバーとIDラベルを入れます。カメラをセクションに垂直に持って、焦点距離とホワイトバランスを常に一定に保ちましょう。
  6. ImageJを使って梗塞量を定量化します。
    1. 300 dpi画像(RGBフォーマット)をインポートし、8ビットグレースケール(画像>タイプ>8ビット)に変換します。
    2. Otsuの自動閾値調整(画像> 自動閾値を 調整>>Otsuを選択してください)。これにより、梗塞(白)と生存可能な組織(赤)を分離します。
    3. Freehand選択ツールを使って同側の半球境界を輪郭付けしてください。
    4. 面積を測定(分析 > 測定)し、ピクセル数を記録します。
    5. 梗塞容積を計算します:Σ(梗塞面積×スライス厚さ[2 mm])×(対側半球体積/同側半球容積)、対側半球の割合で表します。

10. 統計解析

  1. 適切であれば、平均±標準偏差(SD)または中央値[四分位差範囲]として提示してください。
  2. 非正規分布データに対して、ペアなしのStudent氏t検定またはMann-Whitney U検定を用いてグループ間比較を行います。
  3. 統計的有意性をP < 0.05に設定します。すべての分析は適切な統計分析ソフトウェアを使用して実施してください。

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結果

末期TTC染色のために、動物は再灌流後24時間(n = 10)または72時間(n = 10)の生存群にランダムに割り当てられました。さらに4頭のラットがMCAOを受けましたが、予定された終末点(死亡率12.5%)前に死亡しました。SHAM群はn=6で構成されていました。したがって、使用された動物の総数は30頭(24頭のMCAO + 6頭のSHAM)でした。

ラットは脳虚血を誘発するために60分間のMCAOを受けました(図1)。再灌流は、腔内フィラメントを除去し、ECAで近位結紮を解放することで開始されました。24匹のMCAOラットのうち、3匹は72時間以内に死亡しました。1人は死後の妊活による24時間以内に広範な梗塞が認められ、もう1人は72時間以内に原因不明で死亡しました。さらに2頭のラットは、モデリングに失敗したため除外しました(神経学的スコアは基準を満たさず、妊活採血による染色では梗塞なし)。したがって、72時間の死亡率は12.50%でした。モデル確...

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ディスカッション

本研究の主な目的は生物学的発見ではなく方法論的標準化であったことを明確にすることが重要です。標準化されたMCAOプロトコルの開発は、虚血性脳卒中研究における研究室間変動を減らし再現性を高めるために不可欠です。このプロトコルは厳格な品質管理措置を通じて手続きの透明性を高め、標準化されたフィラメント挿入、温度調節、組織学的処理などMCAOモデリングにおける一般的な技術的欠陥に対応します。

一過性MCAOにおける梗塞容積の減少と部分的な神経学的回復は、一過性MCAOにおける予想される病態生理現象を示していますが、本研究の貢献は厳密に標準化された手法を用いてこれらのエンドポイントの時間的信頼性を確立することにあります。詳細で段階的な技術的枠組みを提供することで、このプロトコルは、神経炎症カスケード、アポトーシス経路、治療的介入のいずれの調査においても、将来の機構的研究が再現可能で比較可能なベースラインデータに基づいて構築されることを保証します。私たちはこの研究を、JoVEの範囲に沿った技術資源として明確に位置づけ、機構的洞...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は北京自然科学基金(番号7232269)および北京伝統中医科学技術開発基金プロジェクト(番号:1000年)の支援を受けました。JJ-2023-93)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2% TTC染色液北京索莱宝科技有限公司T817025 g/瓶、純度≥98 %
4% PFA北京索莱宝科技有限公司P1110500 mL 即用型
吸収性縫合糸山東威高集団医療ポリマー有限公司VCP345H5-0 Vicryl
Adson鉗子上海金中外科器械有限公司JD-110101×2歯、12 cm
Dumont湾曲鉗子上海金中外科器械有限公司JD-11052長さ11 cm、0.05 mmの細い先端
フィードバック加熱パッド深圳リワードライフサイエンス& テクノロジー有限公司6900137± 0.3°Cクローズドループ
ImageJ米国国立衛生研究所バージョン1.53k
虹彩はさみ上海金中外科器械有限公司JD-14060湾曲した先端、10 cm
マイクロ血管クリップ深圳ルイヴォードリフトテクノロジー有限公司JD-160101.5 cm湾曲クリップ
非吸収性絹上海浦東金煥医療製品有限公司S-23046-0黒絹糸
PASSソフトウェア NCSS, LLC、Kaysville、UT、米国バージョン15.0 サンプルサイズ計算ソフトウェア 
ラット脳マトリックス深圳ルイヴォードリフトテクノロジー有限公司686102 mm冠状スロット
シリコンコーティングされたナイロンフィラメント深圳ルイヴォードリフトテクノロジー有限公司60-12500.35 mm OD、30 mmシリコンチップ、EO-無菌
小動物麻酔機深圳ルイヴォードリフトテクノロジー有限公司R500IEイソフルラン気化器、誘導チャンバー&マスク付き
SPSSIBM Corp.、Armonk、NY、米国バージョン26.0 統計解析ソフトウェア
Vannasマイクロはさみ上海金中外科器械有限公司JD-14058湾曲した先端、8 cm

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