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研究記事

冬虫夏草多糖類がD-ガラクトース誘発性腎老化に与える影響

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DOI:

10.3791/69579

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2026年4月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1First Clinic Medical School, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Renal Division, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

マウスおよびHK-2細胞においてD-ガラクトースを用いた老化モデルが確立されました。冬虫夏草多糖類(CCP)が腎老化に与える影響は、ウェスタンブロッティング法と免疫蛍光法を用いて評価され、ミトコンドリアの変化は活性酸素種検出およびJC-1染色で評価されました。

要約

慢性腎臓病(CKD)は、世界的な健康問題として重大な問題となっています。腎管上皮細胞(RTEC)の老化は腎の再生と修復を損ない、老化関連分泌表現型(SASP)の放出を通じてCKDの進行を促進します。冬 虫夏草(コルディセプス・シネンシス)は、主要な生物活性成分として冬虫夏草多糖類(CCP)を含み、慢性腎臓病の複数の臨床製剤に組み込まれており、治療効果が示されています。CCPが腎老化に果たす役割を調べるため、マウスを対象にD-ガラクトース誘発腎老化モデルを確立し、CCPを介入として投与しました。治療結果は老化関連染色および腎機能評価を用いて評価した。さらに、HK-2細胞におけるD-ガラクトース誘発老化モデルが確立され、基礎となる細胞メカニズムの調査が行われました。JC-1染色および活性酸素種(ROS)検出を用いて、老化条件下でのCCP処理後のミトコンドリア変化を評価しました。免疫蛍光、ウェスタンブロッティング、定量PCR(RT-PCR)を用いて、CCPがMAPKリン酸化、NF-κB核転座、NLRP3インフラマソーム活性化に与える影響を評価するために実施されました。結果は、CCPが細管間質細胞老化、腎損傷、線維症を軽減しつつ、D-ガラクトース誘発老化の細胞モデルおよび動物モデルの両方でミトコンドリア機能を改善することを示しています。これらの効果はROS/MAPK/NF-κB/NLRP3シグナル伝達経路の調節に関連しています。

概要

慢性腎臓病(CKD)は最も一般的な腎臓疾患の一つであり、世界中で多くの人々に影響を及ぼしています。その発生は加齢と密接に関連しています。腎小管は腎臓の主要な機能単位であり、腎管上皮細胞(RTEC)内の細胞老化が腎機能低下の主な要因となっています2。薬物曝露やその他のストレス要因は、腎小管ストレス関連老化を引き起こし、腎機能の進行性低下や最終期腎疾患(ESKD)への進行につながります。したがって、RTECsにおける老化を標的化することは、腎老化を遅らせ、CKDの予防または治療に効果的な戦略となり得ます。

慢性炎症は3歳の加齢の特徴であり、多くの加齢関連疾患の重要な原因です。老化細胞から放出される炎症促進サイトカインは、総称して老化関連分泌表現型(SASP)4として知られています。SASPは持続的な炎症を促進し、隣接細胞の老化を誘発し、進行的な機能低下に寄与します5。D-ガラクトース(D-gal)誘発老化モデルは、最も広く使われている実験的老化モデルの一つです。過去の研究では、D-gal処理が細胞内活性酸素種(ROS)の蓄積、ミトコンドリア機能障害、酸化還元恒常性の乱、ストレス関連の細胞老化の誘導を引き起こすことが示されています6。時間がかかり個体間ばらつきが高い自然老化モデルと比べて、D-ガラクトース誘発モデルは単純さ、迅速な誘導、そして比較的低いグループ内変動という利点を提供します。このモデルはin vivoおよびin vitroの両方の研究に適用可能です。ゆっくりとした病理のない自然老化を完全に再現することはできませんが、腎臓の高い代謝活動と酸化ストレスに対する感受性を考慮すると、腎老化のモデルに適しています。機構論的観点から見ると、D-ガラクトースは主に酸化ストレスによって細胞老化を促進し、ROS生成や老化中のミトコンドリア機能障害に焦点を当てた研究と一致しています。

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)は、腎臓関連疾患の治療に広く用いられる伝統的な中国の薬用菌類です。多糖類、アデノシン、アミノ酸、コルディセピン、エルゴステロールなど複数の生物活性成分を含んでいます。コルディセプス・シネンシスの抽出物および発酵製剤は抗炎症、抗酸化、抗老化特性を示します8,9,10,11。例えば、冬虫夏草多糖類は喘息マウスモデルにおいて、TGF-β1/SMADシグナル伝達経路12を阻害することで炎症浸潤を減らすことが示されています。さらに、虫夏草多糖類はRAW264.7細胞内でMAPK経路のリン酸化を抑制し、IL-6やIL-1βなどの炎症性サイトカインの発現を抑制することができる13。過去の研究では、コルディセプス多糖類(CCP)は、コルディセプス・シネンシスの主要な生物活性成分であり、オートファジーを調節しSASP産生を抑制することで腎管上皮細胞の老化を軽減できることが示されています。しかし、CCPがROS介在の損傷を抑制する分子メカニズムは、まだ完全には解明されていません。

本研究は、マウスにおけるCCPの腎老化に対する保護効果を調査し、D-ガラクトース誘発モデルを用いた腎管上皮細胞老化を用いて、炎症、酸化ストレス、老化への影響を検証します。さらに、CCPがROS産生、ミトコンドリア機能、MAPKリン酸化、NF-κB核転座、NLRP3インフラマソーム活性化を含む下流シグナル伝達経路を調節するかどうかを探ります。本研究は、腎老化および加齢性腎障害の研究におけるCCP使用を支持する実験的証拠を提供することを目指しています。全体の実験ワークフローと提案されたメカニズムは 図1にまとめられています。

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プロトコル

すべての動物処置は、南京中医科大学動物倫理委員会(倫理承認番号202108A006)に基づき、機関のガイドラインに従って実施されました。細胞培養および染色作業中に発生したすべての廃棄物は、密閉容器およびバイオハザードバッグに収められ、認可を受けた医療廃棄物管理サービスによって処分されました。

動物モデルおよび治療的介入

個人間差を最小限に抑えるため、40匹のマウスを5つのグループ(n=8群)にランダムに割り当て、以下の介入を受けました:(1) 対照群: マウス1匹あたり0.2 mLの生理食塩水を胃内投与;(2) モデル群: D-ガラクトース(250 mg/kg)を毎日皮下注射を受け、マウス1匹あたり25 mg/mL溶液の0.2 mLを投与;(3) 低用量CCP群: D-ガラクトース注射と50 mg/kg(マウス1匹あたり5 mg/mL溶液の0.2 mL)を胃内投与を受けました。(4) 高用量CCP群: D-ガラクトース注射と100 mg/kg(マウス1匹あたり0.2 mL溶液)で胃内投与を組み合わせて投与;(5) ビタミンE群: D-ガラクトース注射と胃内投与を100 mg/kg(マウス1匹あたり10 mg/mL溶液の0.2 mL)で投与した。8週間の治療後、マウスは安楽死させられ、血清、尿、腎組織サンプルを採取して後続解析を行いました。

腎機能解析

腎機能は市販の検査キットを用いて、製造元の指示に従いクレアチニン、尿酸、尿タンパクを測定しました。吸収度値は、多機能マイクロプレートリーダーを用いてクレアチニンで505 nm、尿酸が510 nm、尿タンパクで585 nmで測定しました。

組織切片染色

パラフィン埋め込み腎組織は厚さ4μmで切片されました。切片は脱脂され、ヘマトキシリンで5分間培養され、流水で洗浄され、1%酸性アルコールで5秒分化し、再度洗浄されました。1分間のリン酸塩緩衝生塩水(PBS)洗浄後、切片をエオシンで3分間カウンターステインし、脱水してマウントしました。マッソンのトリクロム染色では、切片を脱脂し、上記のようにヘマトキシリンで染色し、その後ポンソーSを5分間、アニリンブルーを5分間施しました。その後、セクションは脱水処理され、取り付けられました。

細胞生存率アッセイ

HK-2セルは12ウェルプレートに1ウェルあたり10⁵セル×シードされました。D-ガラクトースおよび冬虫夏草多糖体に24時間曝露した後、各井戸14に10%のCCK-8溶液を加えました。37°Cで30分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸収を記録しました。虫夏草の品質管理文書およびHK-2細胞のSTR認証は補 足ファイル1に記載されています。

逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応

細胞培養24時間後、培養培地を取り出し、抽出試薬を用いて全RNAを抽出しました。RNA濃度はマイクロプレート分光光度計を用いて測定され、RNAの完全性は2%のアガロースゲル電気泳動で検証されました。ゲノムDNAは除去され、逆転写によってcDNAが合成されました。プライマー配列は 材料表に記載されています。

細胞内ROSレベルの測定

HK-2セルは12ウェルプレートに1ウェルあたり10⁵セル×シードされました。60〜70%の合流に達すると、細胞は12時間にわたりD-ガラクトースによる前処理を受けました。薬物曝露24時間後、培地は廃棄され、細胞はPBSで一度洗浄されました。細胞内ROSは、ROS感応蛍光プローブを37°Cで20分間インキュベーションすることで検出され、488/525 nm15の励起・発光波長で蛍光画像が撮影されました。

ウェスタン・ブロット

細胞タンパク質はRIPAバッファーを用いて溶解し、13,000 × gで遠心分離し、4°Cで15分間清算しました。 タンパク質は10分間沸騰させて変性させ、同量のタンパク質(サンプルあたり20μg)を電気泳動分離させてPVDF膜に移しました。1時間ブロッキング後、膜を一次抗体とともに一晩インキュベートしました。その後のPBST洗浄に続き、HRP結合二次抗体を用いたインキュベーションが行われ、検出は増強化学発光(ECL)基質16を用いて行われました。抗体の詳細および試薬識別子は 材料表に記載されています。

SA-βガル老化染色

HK-2セルは12ウェルプレートに1ウェルあたり1×10⁵セルの密度でプレートされていました。細胞が60〜70%の合流度に達した時点で、12時間D-ガラクトースで前処理されました。SA-βガル染色は製造元のプロトコルに従い行われ、染色された細胞は光学顕微鏡17で観察されました。

ミトコンドリア膜電位の測定

ミトコンドリア膜電位は、供給元の指示に従いJC-1蛍光プローブを用いて評価されました。JC-1モノマーは励起/放出波長490/530 nmで検出され、JC-1集合体は525/590 nmで検出されました。透明な赤色または緑色蛍光信号が観測された際に画像を取得しました。

統計解析

データは棒グラフまたは点グラフとして提示され、参照されたソフトウェアで分析されました。ウェスタンブロットバンドの強度はImageJを用いて定量化されました。データは分散分析(ANOVA)とその後の t検定によるグループ間比較で解析されました。統計的有意性はP値<0.05として定義されました。記号は対照群(*)またはD-gal群(#)との比較を示します(*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001)。

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結果

D-ガラクトースはマウス老化モデルを用い、ビタミンEが一般的に用いられる抗老化陽性対照群として用いられました。老化マウスには異なる用量のコルディセプス多糖類(CCP)が投与されました。高齢マウスでは尿タンパク、血清尿酸、クレアチニンレベルの増加により、顕著な腎機能障害が認められました(図2B-D)。ビタミンEとCCPの補給はこれらの異常を軽減しました。SA-βガル染色はCCP処理マウスで腎細胞老化の減少を示し、ビタミンE群と同様の効果を示しました(図2E)。

腎組織のH&E染色により、対照マウスにおいて管状構造と正常な細胞形態が保存されていたことが明らかになりました(図3A,D)。比較すると、D-ガラクトース群は管状拡張、細胞の腫脹、炎症細胞の浸潤を示しました。このグルー...

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ディスカッション

本研究は、冬虫夏草多糖類が腎管上皮細胞に対する保護効果を示し、ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3シグナル伝達経路を調節することでHK-2細胞の炎症性老化を緩和する証拠を提供します。これらの発見は、急性および慢性腎疾患治療におけるコルディセプス・シネンシス由来化合物の効果の潜在的メカニズムをさらに明らかにし、今後の抗老化治療戦略の研究に参考文献を提供します。

細胞老化は複雑な生物学的プロセスであり、複数の臓器に影響を与える変性疾患の主要な要因です。腎臓は特に老化に伴う損傷を受けやすく、進行的な機能低下や特徴的な組織学的変化を伴います。腎老化(RS)は慢性腎疾患(CKD)と密接に関連しており、慢性腎疾患の異なる段階で加速老化が観察されており、その結果腎組織に老化細胞が蓄積します19<...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(No.8217150545, 82575032)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Casepase1/Cleaved Rabbit pAbWL03450中国、瀋陽市万雷
CCK-8キットC0037バイヨタイム、上海、中国
CCPB21296袁業生物、中国・昇陽
クレアチニン検査キットC011-2-1建城、南京、中国
D-ガル HY-N0210MCE、アメリカ
ERKウサギpAb4695CST、アメリカAB_390779
ガップ・ラビット pAbAC033アブクローナル、武漢、中国
H&E染色キットG1120ソーラービオ、北京、中国
JC-1キット C2003S。バイヨタイム、上海、中国
マッソンの染色キットG1340ソーラービオ、北京、中国
NLRP3 ラビットpAbWLH3383中国、瀋陽市万雷
P21 ラビット pAb64016sCST、アメリカAB_2892063
p38 ウサギpab9212CST、アメリカAB_330713
p50 ウサギ用pAB3035CST、アメリカAB_330564
p65 ウサギpab8242CST、アメリカAB_10859369
p-ERK ウサギ pB4370CST、アメリカAB_2315112
リンSAPK/JNKm抗体4668CST、アメリカAB_823588
p-p38 ウサギpAb4511CST、アメリカAB_2139682
ROSステインキットS0033Sバイヨタイム、上海、中国
SAPK/JNK抗体9256CST、アメリカAB_2250373
サ・アンド・ベータ・ガル・キットC0602バイヨタイム、上海、中国
尿酸検査キットC012-2-1建城、南京、中国
尿路タンパク質検出キットC035-2-1建城、南京、中国
ビタミンES27812袁業生物、中国・昇陽
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遺伝子名フォワードプライマーリバースプライマー
カスパーゼ15'-TACAGACAAGGGTGTGTGAACAA-3'5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
ガプド5'-AGAAGGTGTGAAGCAGGCGTC-3'5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3'
NLRP35'-GATCTTCGCTGGATCAACAG-3'5'-CGTGCATTATCTGAACCACCAC-3'

参考文献

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