方法論記事

感染性実験環境に適応可能な新生児、若年、成体のマウス肺から肺胞II型上皮細胞の単離

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DOI:

10.3791/69581

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2025年12月19日

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、新生児、幼獣、成体のマウス肺(感染者・非感染者問わず)から生存可能な肺胞タイプII上皮細胞(AECII)を分離するためのフローサイトメトリー法を提示します。このアプローチにより、AECIIの分子および/または機能的研究が下流で、肺の炎症や感染におけるその役割を特定することが可能になります。

要約

肺胞II型上皮細胞(AECII)は肺の免疫調節に重要に寄与し、肺の恒常性を左右する重要な要素です。これらの機能により、AECIIは下気道上皮を標的に肺胞の完全性を損なう呼吸器ウイルス感染の文脈で特に重要となります。前臨床マウスモデルは、肺の炎症や感染の文脈におけるAECIIの役割を明らかにする重要なツールです。本プロトコルは、新生児、幼獣、成体期のマウス肺から有効かつ高純度のAECIIを分離するための詳細かつ再現可能なパイプラインを提供します。この手法は、機械的解離、酵素的消化、そしてその後の蛍光活性化細胞選別(FACS)を組み合わせ、分子解析および機能解析に適した高濃度AECII集団を生成します。病原性ウイルスを対象とした用途では、プロトコルにはオプションのパラホルムアルデヒド(PFA)固定ステップが含まれており、低いバイオセーフティ条件下でもRNAの完全性を損なうことなく安全な取り扱いが可能です。発達段階を通じた細胞回復が最適化され、成人肺あたり最大1.0 ×10個の6 AECII細胞を獲得できるため、このプロトコルはウイルスの病因、上皮機能、再生能力などの前臨床研究を支援します。

概要

肺の発達、生理学、免疫、修復過程において多面的な役割を持つ肺胞II型上皮細胞(AECII)は、肺損傷後の恒常性維持および再確立に不可欠に寄与しています。AECIIはインフルエンザAウイルス(IAV)やSARS-CoV-2などのパンデミックウイルスの主要な細胞標的であるため、その運命と機能は感染生物学研究の注目を集めています。この文脈で、過去の研究では、内在的(例:遺伝的状態1、年齢2,3)および外因的(例:微生物刺激4)の手がかりがAECIIの表現型や空気感染病原体などの環境トリガーへの応答性に大きな影響を与えることが報告されています。特に、肺の炎症はAECII 5,6のトランスクリプトミック、プロテオーム、エピジェネティック状態に持続的な変化をもたらすことが示されています。AECIIの肺における複雑な細胞相互作用や、さまざまな生物的・非生物的要因がAECII生物学に寄与していることは、これらの細胞をより詳細に調べることを可能にする適切なin vivoモデルの重要性を強調しています。

FACSは、ヒトおよび動物組織からの一次細胞の濃縮と精製における現在のゴールドスタンダード技術であり、マルチパラメトリック選択(または除外)を同時に実装可能であり、サイズ、粒度、自己蛍光などの細胞固有の特性を選択・排除ワークフローに確実に統合できる唯一の方法を示しています。これまでにいくつかの発表済みプロトコルは、FACSに基づく一次マウスAECIIの分離方法論を提供しています。SinhaとLowellは、組織処理とフローサイトメトリーのワークフローが類似し、FACS前に非標的細胞でのビーズベースの磁気除去によるAECIIの濃縮を含む成マウスからのAECII分離法を報告しました7。別のプロトコルでは、EpCAM陽性肺細胞の磁気ビーズベースの分離や、条件付きリポーターマウスモデル8を用いてSPC陽性(GFP+)細胞の同定に基づくFACSベースのAECII単離を可能にするトランスジェニックマウスの使用を記述しています。SPC発現はマウス肺におけるAECIIを確実に同定しますが、この方法は専用マウスレポーター株と組み合わせてのみ適用可能であり、例えば野生型マウスからのAECII分離は困難です。重要なのは、AECIIの収率や純度が似ていたものの、これらのプロトコルはいずれも新生児、幼獣、感染宿主からのAECII分離のための適応を提供しなかったことです。

この目的のために、本プロトコルには酵素分解とFACSを組み合わせてマウスから高純度かつ生存可能なAECIIを分離するための適応ワークフローセットが含まれています。この最先端の手法は、以前に開発されたFACSベースのAECII分離プロトコル9 に基づいており、さらなる同定および排除マーカーの追加によりAECIIの純度を向上させる重要な改良が含まれています。重要なのは、この更新プロトコルが「タッチ」と「タッチされなかった」ソート戦略 の両方による AECII検索を特徴としている点です。さらに、出生後の肺の発達は細胞組成や構造再編成に関する大きな変化と関連しているため、本プロトコルには新生児、若年、成人の肺からのAECII回収を最適化するための適応も含まれています。これにより、肺の成熟や感染生物学的研究など、個体発生過程におけるAECII生物学を検証することが可能になります。このアプローチは、その後の生 体外 培養およびIAV感染のための有効なAECIIを得るために用いられます。さらに、このプロトコルには化学的固定剤であるパラホルムアルデヒド(PFA)を用いた固定手順も含まれます。この段階は、肺細胞懸濁液中のさまざまな呼吸器病原体(例:SARS-CoV-2、IAV)の不活化を正当化し、これによりバイオコンテインメントの低い施設でのサンプル取り扱い(FACSベースのAECII分離を含む)が可能となります。PFAベースの固定は機能研究のためのAECIIの 生外 培養を妨げますが、AECIIのトランスクリプトムプロファイリングのために大量の全てのRNAを回収し、呼吸器感染症における生物学的役割を明らかにすることを可能にします。

プロトコル

すべての動物は、ヘルムホルツ感染研究センターの動物施設で、特定の病原体フリー(SPF)条件のもと、国家および機関のガイドラインに従って繁殖・飼育されました。その後のAECII分離のための未熟マウスの安楽死は、実験動物科学学会(GV-SOLAS、Gesellschaft für Versuchstierkunde)の国内ガイドラインに従って実施されました。C57BL/6遺伝子背景を持つ雄マウスを、生後2日(新生児期)、3週間齢(幼体)、または8〜12週齢(成体)で使用しました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. マウス肺の準備

  1. マウスを犠牲にする(機関で承認されたプロトコルに従う):
    1. 成マウスおよび幼マウスに対して:腹腔内注射による麻酔過剰投与(例:ケタミン/キシラジン)を投与します。
    2. 新生児マウスの場合は、首を切断してください。
      注意:成マウスおよび幼マウスの頸椎脱臼は気管を損傷する可能性があるため避けてください。
  2. ネズミの毛は70%(v/v)エタノールで滅菌してください。
    注意:可燃性液体。目の刺激物。熱は避けてください。容器はしっかり閉じたまま、腹側の中央に切開して内臓を露出させます。
  3. 皮膚と腹膜を慎重に取り除いてください。
  4. マウスの血を奪い、両方の頸静脈と大静脈を切断し、血液を排出させます。
  5. 心臓と肺を露出させるために、慎重に横隔膜を取り外してください。
    注意:肺を傷つけないように注意してください。肺組織の穿孔は、その後の酵素媒介による肺組織消化の効率を著しく妨げます。
  6. ハサミで肋骨を開けます。
  7. 心臓の右心室にカニューレを挿入し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血流を灌流し、肺の残留血が除去され、肺組織が白くなるまで続けます。
    1. 成マウスの場合は、26Gのカニューレを使い、肺に10mLのPBSを灌流してください。
    2. 新生児マウスには30Gのカニューレを使い、肺に1mLのPBSを灌流してください。
      注意:肺胞構造の破裂を防ぐために、 幼 マウスの肺に灌流しないでください。炎症を起こした肺では灌流の効果が薄れ、肺組織の色の変化もあまり顕著でないかもしれません。必要に応じて、成マウスおよび幼マウスの次のステップの前に気管支肺槽洗浄を行うことができます。

2. 肺組織の酵素的消化

  1. 成マウスおよび幼マウス:
    1. 唾液腺や周囲の筋肉を切除して気管を露出させます。
    2. 22Gの留置カニューレを気管に挿入し、その針を抜き、プラスチックカテーテルを肺の方へ移動させます。
    3. 気管とカテーテルの両方に糸をしっかりと巻きつけて固定します。
    4. 散らしを注入して肺組織を準備します。
      注意:吸入するとアレルギーや喘息の症状、呼吸困難を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込むのは避けましょう。呼吸器を着用してください。内容物や容器は認可された廃棄物処理施設に処分してください。)気管に挿入されたカテーテルを通じて:
      1. 成マウスには2mLの分散液を挿入します。
      2. 幼マウスには500μLの分散液を挿入します。
        注意:ステップ2.1.4と2.1.5の間に注射器の交換を容易にするために、ルアースリップ接続付きの注射器を使用してください。肺組織の効率的な酵素的消化を確保するためには、気管支肺胞の空間が完全に酵素充填されることが不可欠です。
    5. シリンジを交換し、低溶度のアガロース(1%(w/v)、45°C)で繰り返し処理中の構造を維持します。
      1. 成マウスには、低溶け度のアガロース500μLを使用します。
      2. 幼マウスには、低溶融度のアガロースを200μL使用してください。
        注意:液体の逆流を防ぐために、注射器はそのままにしてください。
        注意:使用前に、低溶融アガロースを熱(95°C)で溶解し、アガロース溶液を45°Cまで冷却します。例えばサーモブロック内で。
    6. 肺を実験室用のティッシュペーパーで覆い、氷を加えてアガロースが2分間固まるのを待ちます。
    7. 氷、ティッシュペーパー、注射器、カテーテルを取り除きます。
    8. 糸を結んで気管を閉じ、酵素を下気道に留めます。
    9. 心臓と胸腺を取り除く。
    10. 毛糸の上を気管を切り、胸から無傷の肺を取り除きます。
    11. 肺を15mLのチューブに移し、事前に温めた分散体(37°C)を含み、室温(20-25°C)で45分間分散した肺組織を培養します。
      1. 成マウスの場合は、肺を2 mL分散液で培養します。
      2. 幼マウスの場合は、肺を1.5 mL分散液で培養します。
  2. 新生マウス
    1. 2mLチューブの蓋に細かいハサミで単片肺葉を採取し、刻み砕きます。
    2. 500μLの分散剤を加え、蓋を閉じてチューブを逆さにして組織全体が分散液で覆われるようにします。
    3. 肺組織を室温で分散させて45分間培養します。

3. 肺組織の準備

  1. 成マウスおよび幼マウスについて:
    1. 肺を離脱から切り離し、肺葉を気管支幹から切り離します。
    2. 肺葉を7 mL DMEM + HEPES、1 μg/mL(最終濃度)抗CD16/32遮断抗体、100 μL DNAase(最終濃度~600 Kunitz単位)を含むペトリ皿(直径:8.5 cm)に入れます。
      注意:吸入するとアレルギーや喘息の症状、呼吸困難を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込むのは避けましょう。呼吸器を着用してください。内容物や容器は認可された廃棄物処理施設に処分してください。
    3. 鉗子を使って肺組織を分解する。
      注意:肺組織の酵素的消化を効率的にするためには、徹底的な機械的組織分解が不可欠です。
    4. 室温で10分間孵化し、200rpmで優しく揺らします。
      注:必要に応じて、セル懸濁液は次の工程まで4°Cで保存可能です。
  2. 新生マウスの場合:
    1. 分散したものを消化組織を含むペトリ皿(直径:5.4 cm)に移し、そこに3 mL DMEM + HEPES、1 μg/mL(最終濃度)抗CD16/32遮断抗体、100 μL DNAase(最終濃度 ~ 600 Kunitz 単位)を含みます。
    2. 室温で10分間孵化し、200rpmで優しく揺らします。
      注:必要に応じて、セル懸濁液は次の工程まで4°Cで保存可能です。
  3. 全年齢層で続きます:
    1. 細胞懸濁液を、孔径が小さくなるナイロンセルストレーナー(100 μm - 70 μm - 40 μm)でろ過し、ゴミや大きな集合体を除去します。
    2. 細胞の損失を最小限に抑えるために、慎重にストレーナーやチューブを洗い流してください。サンプルがプールされている場合、同じグループのマウスの細胞懸濁液を同じ細胞ストレーナーに通すことができます。
      注意:詰まりの場合はセルストレーナーを交換してください。
    3. 体積に応じて、ろ過した細胞懸濁液を1本以上の15 mLチューブに移し、140 x g 、4°Cで12分間遠心分離します。
    4. 上清液を廃棄し、細胞ペレットを赤血球溶解バッファー(ACKバッファー)に再懸浮させます。
      1. 成マウス および幼 マウスには、赤血球溶解バッファー2mLを使用し、2分間インキュベートします。
      2. 新生マウスの場合:赤血球溶解バッファー3 mLを使用し、3分間インキュベートします。
    5. 赤血球溶解を止めるために、15 mLチューブにDMEM + HEPES + 10%(v/v)FBSを充填し、再び遠心分離機で140 x g 、4°Cで12分間処理します。

4. 蛍光活性化細胞選別のための抗体染色

  1. 細胞を抗F4/80、抗CD93、抗CD11c、抗CD19、抗CD31、抗CD11b、抗CD16/32、抗CD45、抗CD24、抗CD326のフルオロクロム結合抗体をDMEM + HEPES + 10% (v/v) FBSで調製した抗体染色溶液に再懸濁します。
    注意:最適な染色効果を得るためには、あらかじめ滴定された抗体のみを使用してください。細胞選別のためにAECIIを手つかずでなければならない場合、抗体染色液に抗CD326は含めないでください。
    1. 成マウスの場合:肺につき600μLの抗体溶液を使用してください。
    2. 幼マウスの場合:肺につき400μLの抗体溶液を使用。
    3. 新生児マウスには、肺につき200μLの抗体液を使用。
  2. 抗体とともに細胞懸浮液を暗闇で4°Cで10分間インキュベートします。
  3. 培養後、DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBSをチューブに充填して細胞を洗浄します。
  4. 遠心分離機で140 x g 、4°Cで12分間。
  5. 細胞を再懸浮させるDMEM + HEPES + 10%(v/v) FBS:
    1. 成マウスの場合:肺あたり300μLで再懸濁します。
    2. 幼マウスの場合:肺あたり200μLで再懸濁します。
    3. 新生児マウスの場合:肺100μLで再懸浮します。

5. AECIIの分類

注:計測器準備:FACS装置を使用してAECIIを選別するための100μmノズルを設置してください。

  1. 選別直前に、50μmのセルストレーナーでろ過します。細胞ストレーナーはDMEMで洗い流し、HEPESと10%(v/v)FBSを補足して過剰な細胞損失を防ぎます:
    1. 成マウス: 細胞ストレーナーを肺に300μLずつ洗い流します。
    2. 幼マウス :細胞ストレーナーを肺に200μLで洗い流します。
    3. 新生マウス :細胞ストレーナーを肺100μLで洗い流します。
  2. ソート直前に渦巻きでセルを再懸浮させてください。
  3. AECIIのゲートは、I) 側散乱が高(SSC高)、II) 系統フルオロクロームが陰性、III) CD326フルオロクロムと抗CD326抗体が結合したことが陽性であることを特定することで判定します。
    注意:非AECIIとAECIIの区別を容易にするために、高輝度指数から非常に高い蛍光色素(APC、PE、BV785など)を使用してください。染色溶液中の抗CD326を除外する未加工の選別法では、AECIIは系統陰性、SSC高細胞、 自己蛍光陽性/高 細胞として同定されます。AECIIの自己蛍光は、FITCやGFP検出器などのグリーンライト検出器で識別できます。
  4. 前方散 乱高と比べて、ダブレットやアグリゲートを除外します。面積(FSC-H 対FSC-A)および横方向散 乱の高さ面積(SSC-H 対SSC-A)。
  5. 選別した細胞を、HEPESと10%(v/v)FBSを補足したDMEMチューブに集め、遠心分離機でさらなる解析または培養を行います。

6. PFA固定AECIIからのRNA分離(任意)

注:AECIIを呼吸器ウイルス病原体などに感染したマウスから分離する場合、病原体に応じてBSL2またはBSL3の条件でAECII分離を行う必要があります。実験者が適切な安全条件下で細胞選別にアクセスできない場合、上記のプロトコルで分離されたAECIIは抗体染色後にPFAで固定できます。このステップは病原体10,11を不活化し、その後のフローサイトメトリーAECII選別がBSL1条件下で行われることがあります。細胞は固定プロセスのため機能的アッセイには使用できませんが、分子分析には適しています。

  1. ウイルスの不活化には、抗体標識された単一細胞懸濁液を4%(w/v)PFAの500μLに固定します。
    注意:可燃性固体。飲み込んだり吸い込んだりすると有害です。皮膚の刺激や深刻な目の損傷を引き起こします。アレルギー性皮膚反応、呼吸器の刺激、がんを引き起こす可能性があります。遺伝的欠陥の原因と疑われている。熱は避けてください。もし飲み込んだ場合:体調が悪い場合は毒物センターや医師に連絡してください。吸い込む場合:新鮮な空気に移し、呼吸を快適にしてください。体調が悪い場合は毒物センターや医師に連絡してください。目に入れた場合は、数分間慎重に水ですすぎます。コンタクトレンズがあれば外してください。簡単に外せます。洗い流しを続けてください。もし曝露や心配があれば、医療機関の助言や対応を受けてください。
    注:3Rガイドラインに従い、本研究では感染していないマウスのAECIIを使用しました。AECIIは室温で10分間固定されていました。固定の持続時間は、人間や環境に潜在的なリスクをもたらす各病原体ごとに個別に検査されなければなりません。S1条件下での後続の選別では、PFA固定後に複製可能なウイルスが存在しないことをBSL2またはBSL3の実験室で事前検証する必要があります。
  2. 固定後、DMEMと遠心分離機で細胞を140 x gで15分間洗浄します。
  3. 細胞を300μLのDMEM + HEPES + 10%(v/v)FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を100μmの細胞ストレーナーに通します。
  4. 過剰な細胞損失を防ぐために、追加の300μL DMEM + HEPES + 10%(v/v)FBS培地で細胞ストレーナーを洗い流します。
  5. ステップ5で説明した通りにセルをソートします。「AECIIの分類」。
    注:ウイルスが4%(w/v)PFA処理によって不活化されたことが必須の実験的検証を受けた後、AECIIはBSL1条件で分類可能です。
  6. PFA固定細胞からのRNA分離にはRNeasy FFPEキットを使用します。
    注意:このキットには有害な化学物質が含まれています。メーカーの指示に従ってください。以下の調整点を含む安全データシートにご注意ください。
    1. 選別後、細胞を140 x g 、4°Cで15分間遠心分離します。
    2. 細胞を150μLバッファーPKDに再懸濁し、1.5mLチューブに移します。
    3. 10μLのプロテイナーゼKを加え、56°Cで15分間インキュベートし、その後80°Cで最大15分間インキュベートします(表 1参照)。
  7. プロトコルに従い、DNase処理、洗浄工程、最終30μLのRNaseフリー水での洗脱を含むRNA分離プロセスを継続してください。

結果

ここで述べたプロトコルは、新生児から幼体および成体マウスに至るさまざまな発生段階のマウス肺組織からAECIIを分離・解析するための最適化かつ詳細な方法を示しています。この方法論は、機械的および酵素的肺解離と最適化されたフローサイトメトリクス細胞選別ワークフローを組み合わせ、BSL1条件下での感染動物のサンプル処理に適したカスタムプロトコルを用います。

実験データは、この分離手法(図1にまとめ)が、実用的かつ高度に純度の高い(>95%)AECII集団の生成において高い有効性を示しました。フローソーティングにより純粋なAECII集団が生成され、ソート後の解析により確立された細胞マーカーの特異性がほぼ100%検証されました(図2)。選別後の細胞サンプルの定量では、新生児肺からは0.15 ×10 6個の有効なAECIIに対し、成人サンプルからは1.0 × 106個細胞の高収量が示されました(図3A)。分離されたAECIIは、分離過程を通じて典型的な形態(図3B)と細胞の完全性を維持しました(図3C)。さらに、マウス適応型IAV(H1N1、株A/プエルトリコ/8/34)を用いたmCherryレポータータンパク質(IAV-mCherry12)を発現させた生外感染により、機能的研究への適用性が確認され、細胞がウイルス複製を支える能力が示されました(図4)。

サンプル固定を必要とする実験ワークフローをサポートするため、プロトコルにはPFA固定を用いた特殊なRNA抽出アプローチが含まれています。PFA固定AECIIによるRNA品質の詳細な検証は、異なる処理時点で、下流の分子解析に適した高品質RNAを固定サンプルから確実に抽出できることを示しました(表1)。抽出されたRNAの品質は、抽出手順中の80°Cでの熱処理時間と直接的な関係を示し、特定の実験ニーズに基づく明確な最適化ガイドラインを示しました(表1、 図5)。定量逆転写PCR(qRT-PCR)解析による検証では、PFA固定サンプルと新鮮な対照製剤を用いて、ハウスキーピング遺伝子(リボソームタンパク質S9、 Rps9)およびAECII特異的マーカー(界面活性剤C、 Sftpc)の両方の増幅に成功したことが示されました(図6)。

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図1:酵素組織消化とフローサイトメトリー細胞選別を用いた新生児、若年、成マウスのマウス肺からのAECII分離の概略ワークフロー。 図は異なる年齢層のマウス肺の体系的な処理を示しています。マウスの安楽死と肺の摘出の後、組織分解のための分散を経て多段階の酵素消化が行われます。機械的破壊の後、細胞は孔径を小さくする一連のろ過工程を経て精製されます。その後、赤血球を溶解します。AECIIの特異的増強は、造血マーカー(CD45、CD11b、CD11c、F4/80、CD19、CD16/32)、内皮マーカーCD31、血小板マーカーCD93、気管支上皮細胞マーカーCD24に対する抗体標識を用いた陰性選択、そして特徴的なSSC高値 に基づくフローサイトメトリー選別によって達成されます詳細なAECIIのプロファイル。このプロトコルにより、≥95%の高純度で実用的な一次AECIIの分離が可能となり、機能的および分子分析が行われます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:成マウスからAECIIを分離するために用いられた代表的なゲーティング戦略。 (A) 肺の単一細胞懸濁液は、以下の抗原に対する抗体で染色されました:F4/80、CD93、CD11c(APCと結合)、およびCD19、CD31、CD11b、CD16/32、CD45、CD24(PEと結合)、CD326(BV785と結合)。(B) 再解析 (A) 純度分析のための選別されたAECIIは再解析され、AECIIの純度97.2%が確認されました。(C) 選別後のAECIIの代表的な蛍光顕微鏡画像。核はDAPI(青)で染色されました。細胞内染色は一次抗SPC抗体(ウサギ種)を用いて行われ、二次染色はAlexa 594(赤)に結合したヤギ抗ウサギIgGを用いた。AECIIはDAPIおよび二次抗体のみで染色され、一次抗体および二次抗体で染色された脾細胞は関連対照群として機能し、抗SPCおよび抗ラビットAlexa594の特異的結合を示しました。スケールバー:20μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図3:蛍光活性化細胞選別後のAECIIの収量、形態、活力。 (A) 新生児、幼年、成マウスから得られた肺あたりの生存可能なAECIIの総数。(B) 仕分け後のAECIIの光学顕微鏡画像。スケールバー:75μm。(C) 選別後のトリパンブルー染色によりAECIIの生存可能性が観察されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:IAV-mCherryを用いた選別AECIIのExvivo 感染。 成マウスから分離したAECII細胞は、マトリジェル被覆組織培養 プレートで一 晩培養し、付着を可能にしました。その後、細胞はIAV-mCherry(感染多重度2)に8時間感染しました。mCherry信号強度は時間依存的に増加することが観察されました。スケールバー:200μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図5:4% PFA固定AECIIからのRNA完全性。 Qiagen FFPE RNeasyキットを用いてRNA分離後に固定・選別されたPFAの代表的なRNAプロファイル。18Sおよび28S rRNAの特定のピーク、およびRNA品質数値(RQN)は、PFA固定AECIIからの完全な単離RNAのRNAの完全性と品質を表しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図6: Rps9 ハウスキーピング遺伝子およびAECII特異的遺伝子 Sftpc の増幅曲線(未処理)および4% PFA固定AECIIからの増幅曲線。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

サンプル80°Cでの潜伏時間28S/18SRQNRNA濃度 [ng/μ]
Control 0,5x106-2105.8
コントロール 1x106-1.91012.3
PFA固定 0,5x106526.45.5
PFA固定 0,5x106101.98.13.7
PFA固定 0,5x106151.88.22.76
PFA固定 1 x106528.26.26
PFA固定 1 x106101.18.45.12
PFA固定 1 x106150.98.55

表1:4% PFA固定AECIIから分離されたRNAの品質 - 異なる固定時間の影響。 AECIIからのRNAは製造元のプロトコル(FFPE RNeasy Kit)に従って分離され、ステップ6で修正されました。固定された細胞は80°Cで5分、10分、または15分のインキュベートされ、サンプルからRNAを洗い出しました。RNAの完全性はAgilentのフラグメントアナライザーを用いて測定されました

ディスカッション

ここで述べた最適化プロトコルは、新生児、若年、成人期におけるマウス肺組織からのAECIIの分離および解析において信頼性が高く再現性の高いアプローチを提供します。さらに、選別前にオプションでPFA固定ステップを設けており、呼吸器病原体に感染したマウスであってもBSL1条件下でAECIIを選別することを可能にします。慎重に実施された肺への曝露と灌流、その後酵素の気管内注入と低融解アガロースの肺への注入を組み合わせることで、組織構造が維持され、高品質な単細胞懸濁液の回収が可能となり、下流解析が可能となります。サイド散乱特性に関するフローサイトメトリーソーティング、系統陰性ゲーティング、CD326陽性細胞の正選択を加えることで、非常に純粋なAECII集団が得られました。このような純度は、分子および機能的アッセイがAECIIの本質的な生物学を代表し、汚染細胞タイプによって混同されないようにするために特に重要です。これにより、遺伝子発現やウイルス-宿主相互作用研究の解釈性が向上します。

上記のプロトコルでは、白血球および非白血球抗原に対する蛍光標識抗体を多数用いて非AECIIを排除し、その後側面散乱特性と上皮細胞特異的分子CD326の発現 を通じて AECIIを正選択する形を特徴としています。この方法論は、SPCというAECIIの特徴マーカーを用いて非常に純度の高いAECII集団を得たことが示されましたが、得られた集団の純度はこれまでのところ、選別後の細胞内染色によってのみ確認できています。このプロトコルは、主にウイルスの標的となり、異なる細胞適応を示すSARS-CoV-2およびインフルエンザウイルス感染肺からAECIIを分離するために適用可能です。しかし、この方法は肺がん生物学の文脈でマウスAECIIを単離するには適切でない場合があります。なぜなら、EpCAM(CD326)はマウスやヒトの肺がん細胞でも発現するためです13。これらの研究においては、 Spc プロモーターの転写制御下で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス株の使用が、一次AECIIの信頼性の高い分離により適したアプローチを提供する可能性があります。

新生児肺あたり0.15 × 106 個の有効なAECII、成人肺あたり最大1.0 × 10個6細胞の 収量は、このプロトコルの効率性と拡張性を示しています。大量のAECIIの分離成功を妨げる大きな障害は、非効率的な酵素的消化と肺組織の機械的分解です。したがって、ステップ2.1.4で気管支の歯槽腔を完全に充填し、ステップ3.1.3で機械的な組織分解を慎重に行うことが重要です。効果的な酵素的消化により、可視化した集合体の割合が最小限の濁った細胞懸濁液が得られ、通常はプランジャーで以下のフィルター工程で分解できます。細胞ストレーナーを通過できない大きな集合体は通常、酵素による消化不足の結果として発生します。酵素による消化時間を延長することは推奨されません。なぜなら、これは後の免疫染色14 に悪影響を及ぼし、FACSベースのAECII分離の精度に影響を与える可能性があるからです。

酵素的および機械的組織分解の効率に加え、遺伝的背景もAECIIの収量に影響を与える可能性があります。このプロトコルでは、C57BL/6背景のマウスを使用しました。報告された発生15、免疫16、生理学的17、18、19の株特異的差異に沿って、他の実験用マウス株(例:BALB/c、DBA)の使用によって異なるAECII収量が生じる可能性があります。さらに、炎症肺(感染性・非感染性・非感染性)によるAECII収量は大幅に減少する可能性があります。これは、IAV20,21やSARS-CoV-2 22,23,24の主要な標的となるAECIIの間接的(炎症性)または直接的(病原体介在)細胞死の結果である場合があります。

機械的解離、酵素的消化、フロー選別の際に細胞の完全性を維持することは、下流の分子および/または機能解析においてさらに重要です。したがって、AECIIの生存可能性および細胞機能は選別後に評価されました。AECIIはマトリゲルに付着し、特徴的なラメラ状の体リッチ形態を少なくとも24時間維持でき、これは分離後の機能的機能性と生 外 培養(感染モデルを含む)の適合性を示しています。

選別されたAECIIをIAV-mCherryリポーターウイルス12で効率的に感染させ、強いウイルス複製の観察により、このシステムは上皮細胞内在性抗ウイルス応答を解明する堅牢なプラットフォームとして有効であることが裏付けられました。AECIIは界面活性剤の生合成、肺胞再生、自然免疫に関わる主要なプロセスを調節するため、精製されたAECII集団におけるIAV複製動態や宿主転写応答を調べる能力は、混合細胞製剤では得られない洞察を提供します。

このプロトコルの重要な革新は、固定手順の導入であり、新鮮なサンプルと不活化サンプルを並べて分析できるようになっています。PFA固定および適応されたFFPE RNA抽出プロセスは、定量的逆転写PCR(qPCR)に成功したように、下流のトランスクリプトム解析と互換性のあるレベルでRNAの完全性を維持しています。

PFAの固定時間は染色の質に影響を与え、それに伴いFACSによるAECIIの回復に影響を与える可能性があります。さらに、RNAの収率や品質は一般的に固定プロセスによって影響を受けます。使用される 生体内 感染モデルによっては、これらの側面を実験設計に考慮する必要があります。長時間の固定期間を避け、PFA治療の期間を最適化し、必要な最小限の時間を使うことが実験的に証明されており、これはウイルスの完全な不活化を保証することが実証されています。

マイクロ流体装置を用いたリボソームRNA(rRNA)の存在量評価は、生物学的サンプル中のmRNA品質を推定する代理として機能します。示されたAECII固定/RNA分離プロトコルは、28S/18S rRNA比>1およびRNA品質数(RQN)値>8に見られるように、下流のトランスクリプトミック解析に十分な品質を持つ完全なRNAの単離を可能にします。80°Cの培養段階はRNAの収量と品質を著しく低下させることに注意が必要です。熱処理時間の適応は、下流用途でRNA収量と品質を向上させるためにオプションで適用可能です。

これらの方法論的改良は、健康、感染症、発達(新生児から成人)の文脈でAECII生物学を研究するための広範なツールキットを提供します。このアプローチで分離されたAECIIの高い収率と純度により、トランスクリプトミック、プロテオーム、クロマチンアクセスアッセイを含むマルチオミックプロファイリングや、生 体 外感染などの機能的アッセイも含めて、AECIIの関連機構をin vivoでさらに解明することが可能です。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

著者らは、専門的な技術支援をしてくれたタティヤナ・ヒルシュ氏とフリーデリケ・クルーゼ氏、有益な議論をしてくださったリサ・ヘニッケ氏とジャスティン・スマウト氏、そしてIAV-mCherry記者ウイルスを提供してくださった川岡義弘氏に感謝いたします。この研究は、ドイツ研究財団(DFG)のTRR 359 - プロジェクト番号491676693(D.B.およびJ.H.へ)、COVIPAイニシアティブ(KA1-Co-02、ヘルムホルツ協会;D.B.へ)、およびドイツ研究財団からの助成金(BO 7036/1-1;J.D.B.へ)によって資金提供されました。オットー・フォン・ゲーリケ大学マクデブルク医学部のオープンアクセス出版基金からの支援に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ACKバッファ--8.29 g NH4Cl、1 g KHCO3 3、200 & micro;Lは0。5 M EDTA、1000 mL Milli-Qを追加し、pHを7.2から7.4に調整します
アンチマウスCD11beバイオサイエンス12-0112-83クローンM1/70;PE結合
抗マウスCD11cバイオレジェンド117310クローンN418;APC連結
アンチマウスCD16/32BDバイオサイエンス553141クローン93;精製された
アンチマウスCD16/32BDバイオサイエンス561727クローン2.4G2;PE結合
アンチマウスCD19バイオレジェンド115508クローン6D5;PE結合
アンチマウスCD24バイオレジェンド101808クローンM1/69;PE結合
アンチマウスCD31バイオレジェンド102408クローン390;PE結合
アンチマウスCD326バイオレジェンド118245クローンG8.8;BV785連結
アンチマウスCD45BDバイオサイエンス553081クローン30-F11;PE結合
アンチマウスCD93eバイオサイエンス17-5892-82AA4-1のクローン;APC連結
アンチマウスF4/80バイオレジェンド123116クローンBM8;APC連結
対マウスSPC アブカムAB211326宿主種:ウサギ;クローン:EPR19839;精製された
アリア・フュージョンBDバイオサイエンスセルソーター
アリアII SORPBDバイオサイエンスセルソーター
バイオザムプラーク・アガロースバイオジム840101H<>2Oで1%(w/v)
セルストレーナー(100 & micro;m、70、micro;m、40、micro;m)BDファルコン352360, 352350, 352340
CellTrics(50 & micro;m)シスメックス04-004-2327
牛膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼI、2000クニッツ単位/バイアルシグマ・オルドリッチD4263330および微量に1バイアルの新溶解成分;L DMEM
分散剤、100 mL(5000カゼノリティック単位)コーニング354235無菌ろ過(孔径0.22 & micro;15 mLのチューブに4 mLのアリコートを準備し、-20 & 度で保存します。C
DMEMギブコ31885-049低グルコースにピルビン酸を加え、HEPES(最終濃度25 mM)を加えます。
FACSディーバBDバイオサイエンスソーティングソフトウェア
フロージョFACSデータ評価ソフトウェア
ヤギ反ウサギAlexa 594 カップリング
留置カニュラ イントロカン 22Gブラウン4252098B
RNeasy FFPEキットキアゲン73504
シンフォニーS6 SEBDバイオサイエンスセルソーター

参考文献

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