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方法論記事

マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

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DOI：

10.3791/69589

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2025年12月30日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、マウスの前足の皮膚における低閾値機械受容体(LTMR)軸索末端の構造を可視化するための 生体内 二光子イメージング手法を提示します。個々の軸索を繰り返し高解像度でイメージングすることで、この方法は発生過程および成人における皮膚感覚回路の構造と機能を研究する新たなプラットフォームを提供します。

要約

低閾メカノレセプター(LTMR)は、振動、毛髪のたわみ、圧力などの無害な軽い触覚刺激を検出する体性感覚ニューロンです。これらは末梢に亜型特異的な軸索末端を形成し、軸索を脊髄の中心に投射して触覚情報を伝達します。LTMRの発達と組織に関する現在の理解は、軸索配線や再構築の動的かつ時間的なプロセスを明らかにできない固定組織から得られています。ここでは、発生過程および成体におけるマウス前足のLTMR軸索形態を可視化するための二光子イメージング法を提示します。二光子顕微鏡は、無傷の皮膚内で高解像度イメージングを実現でき、同じ軸索末端を出生後の時間点にわたって繰り返し撮影することが可能です。二光子イメージングは新しいマウス遺伝学ツールと組み合わせることで、サブタイプ特異性を持つ軸索の発生を明らかにできます。LTMRの慢性画像診断は、損傷後の回路の組み立てや修復の研究を可能にします。これらのアプローチは、体性感覚軸索の発達と再生を調節する細胞メカニズムについて新たな知見をもたらす 生体内 システムを提供します。

概要

触覚は最も早く発達する感覚であり、生物が物理的世界を体験し反応する上で中心的な役割を果たします。触覚は低閾値機械受容体(LTMR)によって検出されます。これらは背根神経節(DRG)ニューロンの亜型で、凹み、振動、毛髪の偏向などの無害な機械的刺激を検出します。LTMRは擬二極性であり、末梢軸索を末梢組織に伸ばして亜型特異的な末端を形成します。彼らの中心軸索は脊髄ニューロンとのシナプス接続を形成することで、触覚情報を中枢神経系に伝達します。3.しかし、タッチ回路がどのように確立され維持されるのかは十分に理解されていません。

1960年代から1970年代にかけての猫の基礎研究では、これらの機能的に異なる機械受容体と、毛深い皮膚における反応特性が初めて特定されました。LTMRのサブタイプは、その独自の形態、伝導速度、応答特性によって分類されます。主なLTMRサブタイプは、Aβ急速適応型(RA)および緩徐適応型(SA)型LTMR、Aδ-LTMRs、およびC-LTMR2,6,7です。Aβ RA-LTMR、Aδ-LTMR、C-LTMRは毛包の周りに縦向きの披針状複合体を形成します2。Aδ-LTMRは尾側の毛包の周りに偏極した披針状末端を形成し、これは毛髪の偏向に対する方向選択的応答に不可欠な特徴です。披針状複合体の軸索末端は毛幹と密接に整列し、末端シュワン細胞からの指状突起に包まれており、栄養支持を提供し軸索形態形成に影響を与えます8,9,10。無毛皮膚では、Aβ RA-LTMRの軸索はマイスナー小球で終わっており、これは皮膚乳頭内に位置し、皮膚を移動するように調整された卵形構造です2,11。

LTMR軸索末端の組織は、発生中の内在プログラムと皮膚依存的な手がかりの両方によって調節されます12,13。損傷すると、LTMR機能障害は機械的異痛(アロディニア)などの病理的状態と関連しています12,14。しかし、LTMRの発生と維持のメカニズムは依然として明確ではありません。彼らの発生に関する多くの知知は固定組織に由来しており、生体内で起こる動的な過程を捉えることができません。例えば、Aβ RA-LTMRsおよびAδ-LTMRsは、出生後初期の発生中に毛包周辺の活発な神経支配や軸索剪定を示します19。毛包の神経支配と維持がどのように体内で行われるのかは、まだ不明です。

二光子レーザー走査顕微鏡は、生体組織内の蛍光標識構造を可視化できる高度なイメージング技術であり、動的な生理過程の高分解能の生体内イメージングを可能にしました20,21。二光子イメージング中、近赤外線の短いパルスは焦点面でのみ蛍光分子を励起し、信号を小さな体積に限定し、ピントの合わない蛍光を最小限に抑えます。この閉じ込めにより光毒性が大幅に低減され、構造20、23、24の三次元空間分解イメージングが可能になります。さらに、二光子顕微鏡で用いられる長い励起波長は組織内の散乱が少なく、複雑な環境下でのより深い浸透と低いノイズを可能にします(20,25,26)。例えば、2光子イメージングにより脊髄背側角ニューロンの構造的シナプス可塑性とニューロン活動が明らかになりました(27,28,29)。さらに、マウスの耳の皮膚における毛包の恒常性に関する知見を生体内で行う2光子画像により、したがって、二光子顕微鏡は特に発生や慢性的な変化を追跡するために繰り返し長期画像が必要な場合、体内で皮膚のLTMR構造を研究するのに適しています。

蛍光リポーターを発現する遺伝子組み換えマウス系統と組み合わせることで、二光子顕微鏡法で皮膚の神経形態を明らかにできます。体性感覚系では、thy1プロモーター(Thy1-YFP)30の制御下で発現する黄色蛍光タンパク質(YFP)が、毛のある皮膚のAβ-LTMR披針状複合体や無毛皮膚のマイスナー小球を選択的に標識します30,31。Thy1-YFPマウスでは、標識軸索がミエリン塩基性タンパク質および神経フィラメントを検出しており、これらはミエリン化されたAβ軸索のマーカーです30,31。さらに、TrkBCreERは、TrkB(トロポミオシン受容体キナーゼB)遺伝子の発現によって誘導されるタモキシフェン誘導性Cre再組換え酵素(CreER)が、発生中にAδ-LTMRを選択的に標識します。皮膚では、麻酔マウスのLTMRのイメージングには二光子顕微鏡が最も効果的です。マウスの動きが高解像度の画像取得に影響を及ぼすためです。 CreER誘導発現後、軸索末端で蛍光タンパク質を可視化するには時間がかかり、各トランスジェニック系統の最小待ち時間を決定する必要があります。一般的に、この手法はすべての発生段階のマウスおよび成体におけるLTMRの可視化に適用可能です。

このプロトコルは、発生中および成体マウスの毛のある無毛皮膚におけるLTMR軸索の形態を高解像度で調査するための二光子顕微鏡法の手順を説明します。プロトコルには、最適な高解像度かつ慢性的な画像診断のためのいくつかのヒントが含まれています。この統合的アプローチにより、 生体内での触覚感覚軸索の組み立てと可塑性を駆動する細胞メカニズムの研究が可能となります。

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プロトコル

すべての実験手順は施設動物ケア規則に準拠して実施され、ヴァンダービルト大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。実験者の安全のため、すべての処置は白衣、滅菌手袋、マスクを着用して行われました。すべての器具は使用前に徹底的に滅菌され、実験の表面は実験の前後に70%エタノールで清掃されました。本研究で使用されたマウスは、男女両方の思春期および成獣であり、Thy1-YFP、TrkBCreER、Ai140の系統から派生しました。試薬および使用機器は材料表に記載されています。

1. 楽器の準備

  1. レーザーをつけて。レーザーが温まるのに十分な時間を確保してください。この研究では、パルス持続時間100フェムト秒(fs)、反復率80±0.5メガヘルツ(MHz)を持つカメレオン・ディスカバリーNXレーザーが使用されました。
  2. 二光子顕微鏡を起動し、コンピューターの制御・取得ソフトウェアを開きます。
  3. 麻酔中の低体温症を防ぐために、温熱パッドを37°Cに設定してください。

2. 麻酔および前足の画像検査準備

  1. 麻酔を誘発するには、マウスを誘導室に入れ、システムを3.5%イソフルランに設定し、マウスの正直反射を失い、スムーズで規則的な呼吸(機関で承認されたプロトコルに従う)まで設定します。室内空気はキャリアとして使われ、1.0リットル毎分(L/min)に設定されるべきです。
  2. マウスを画像プラットフォームの温熱パッドに置き、イソフルランを1.5%、酸素を0.5 L/minに減らします。イソフルランは鼻のコーンを通して投与すべきです。出生後20日未満のマウスでは、麻酔を維持するためにイソフルランを2〜4%に設定します。麻酔深度を10分ごとにモニタリングし、足や触覚反射の喪失、呼吸数と深さ、全体的な筋緊張度を評価してください。
  3. 画像撮影中の動きアーティファクト(呼吸関連の動きを含む)を最小限に抑えるため、マウスは足とは別のステージに置くべきです。このプロトコルでは、マウスの本体は、足が取り付けられているイメージングプラットフォームに直接隣接するが、接触しないプラットフォームに置かれます。
  4. 画像検査中の乾燥を防ぐために眼科軟膏を塗布してください。
  5. 綿棒で足に脱毛クリームを優しく塗り、毛を除去します。皮膚に1分ほど置いた後、クリームを落とし、70%エタノールと水でネズミの足をきれいにします。
  6. 皮膚を優しく伸ばして皮膚表面を安定させます。滅菌された30G針と黒インクを使い、意図した画像の両側に隣接する2つの点で優しく皮膚とタトゥーを刺します。点は約2ミリメートル(mm)間隔で配置してください。タトゥーが終わったら、針をシャープな容器に適切に捨ててください。
  7. ガラス顕微鏡スライドの角に真空グリースの点を4点置き、スライド中央に厚さ約1mmの粘土(例:DASエアハードニングモデリングクレイ)を置きます。スライドを対物レンズの下に置き、マウスの足を粘土の片の上に直接中央に置きます(図1A,B)。ネズミの足を優しく転がしてスライドを平らにし、粘土に押し付けます。足の上に22mm×60mmのカバースリップを慎重に置いてスライドを固定します。マウスの皮膚の角度を調整し、カバースリップの各角に軽い圧力をかけて、表面と皮膚がイメージング面と平行になるまで調整します。画像診断時に優しい力を使うことで、皮膚の損傷を防ぐことができます。
  8. 無毛皮膚の撮影には、スライドを対物レンズの下に置き、ステップ2.7で説明した通りマウスの足をスライドの中央に置きます。ピンセットを使って前足を回転させ、無毛な皮膚が上向きになるようにします。ピンセットの平らな端で、前足を優しく粘土に押し付けます。前足が平らになったら、カバースリップを上に置き、ステップ2.7で説明した通りに押し下げます。

3. LTMR形態の二光子顕微鏡イメージング

注意:以下のパラメータは特定の実験に応じて調整可能です。この実験では、数値絞り1、作業距離2.00mmの20倍水浸式対物レンズが使用されました。ステップ3.1-3.6では、 Thy1-YFP マウスの右前足に用いられる特定のパラメータを説明しており、参考ガイドとして利用できます。

  1. スリップの上に蒸留水を一滴垂らし、マウスの足の真上に当てます。
  2. 対物レンズを下げて水柱が形成されます。
  3. 対物レンズがマウスの足の上に中央に収まったら、顕微鏡の箱を閉じ、X、Y、Zコントローラー で LEDスクリーンを使って試料にピントを合わせます。LEDスクリーンは顕微鏡内蔵LEDによって照らされたライブ映像を表示します。
    注意:LEDモードは、対物レンズが関心のある視野の中心にあることを確認するために使用され、その後二光子モードに切り替わります。LED画像は血管や毛包などの表面特徴を示し、アライメントやターゲット設定の視覚的なガイドとなります。マウスの足のタトゥーはLED画面に黒いスポットとして表示されます。これらのランドマークを使って、黒い斑点の間のエリアを見つけて注目してください。これにより、マウスの足の同じ部分を繰り返し画像化することが可能になります。
  4. サンプルが見つかったら、LEDスクリーンを消してください。組織から二光子イメージングを行うには、顕微鏡右上のレバーをひねって鏡設定から二色性設定に切り替えます。
  5. 遮光カーテンを閉めて探知器をオンにしてYFPを視覚化してください。
  6. Prairie Viewを使って シャッターを開き、 ソフトウェアをイメージングモードに切り替えます。 Thy1-YFPの撮影には、960ナノメートル(nm)に設定した可変レーザーを700-800の利得でオンにします。GFPを撮る際は、調整可能なレーザーを920nmに設定してください。
    1. 出生後10日目以下のマウスでは、初期レーザー出力を50に設定し、望ましい信号強度が得られるまで徐々に増やしていきます。この初期レーザー出力が低いため、光の透過や光損傷のリスクを最小限に抑えます。レーザーの波長、利得、出力が設定されたら、走査を開始します。
      注:高解像度の1.00倍の視野画像や無毛指先でマイスナー小球の画像を撮影する場合、画像サイズは1024 x 1024、イメージングフィールドは601.9 μm x 601.9 μm、ピクセルサイズは0.588 μm x 0.588 μmの使用が推奨されます。毛包周辺の披針状端を撮像するには、8.00倍ズームで1024×1024、イメージングフィニクス75.2μm×75.2μm、ピクセルサイズ0.147μm×0.147μmが推奨されます。ズーム設定によって画像視野やピクセルサイズが変化することが重要です。
  7. X、Y、Zコントローラーを使ってイメージングフィールドを見つけ、必要に応じてズームを調整し、画像取得を開始します。最適な画像は通常、皮膚表面から約10〜20μm下の開始位置で取得されます。
    注:毛深い皮膚の高解像度画像は通常、ステップサイズが1μmまたは2μmで、約40〜120枚のスライスが描かれています。一方、無毛皮膚の高解像度画像は通常、ステップサイズが2μmから4μmで、約80〜100枚のスライスが描かれています。これにより、典型的なzレンジは100〜250μmとなり、全体の最大イメージング深度は約300μmとなります。
  8. 画像診断は、イソフルラン曝露時間を最小限にし、動物への麻酔関連の副作用リスクを減らすため、25分に制限されます。余分なイソフルランは麻酔活性炭フィルター缶で吸収され、通常のゴミとして処分できます。

4. 術後ケア

  1. マウスの足をガラススライドから外し、リカバリーケージに戻します。
  2. ネズミが完全に回復するまで、温熱パッドでマウスケージを温めておく。
  3. ネズミを元のケージに戻し、さらに30分間観察してケージの仲間と馴染むか確認します。

5. LTMR形態の in vivo 慢性画像診断

  1. マウスを2光子顕微鏡の下に置き、手順2.4-3.3に従ってください。
  2. LEDスクリーンを使って、前回の撮影で得たインクの点を見つけてください。画面を点の間に配置して、目的の領域が確実に捉えられるようにします。顕微鏡の走査モードでは、大きな神経や毛包パターンなどのランドマークを確認し、同じ領域を特定しています。
  3. 画像領域が見つかったら、手順3.4-3.6に従って撮影を続けます。
  4. 皮膚領域の二光子励起によって得られる画像の質や強度、ならびに主要軸索の形態も確認してください。画像フィールドが前回の撮影時に撮影されたものと一致していることを確認しましょう。

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結果

本研究では、発生過程および成人における皮膚のAβ、RA-LTMR、Aδ-LTMR軸索構造を観察するために二光子顕微鏡を用いました。成熟した披針状末端は、出生後20日目以降のマウスで完全に発達しています19,32。成マウスの有毛皮膚における軸索末端の全体的な組織が画像化されており、最大強度投影図(図2A)に示されています。これらの軸索末端の深さと形状は、AβフィールドLTMR、Aβ RA-LTMR、そして未確認のAβサブタイプ軸索を含む三次元再構成で確認できます(映画1)。このイメージング領域において、毛包は自己蛍光によって識別できます(図2A)。針状の毛根は、ガードおよびアウル/オーケネ毛包の周囲に15.8本の毛毛密度で視覚化でき、さらに高解像度で画像化できます(図2B,D)。個々のAβ ...

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ディスカッション

本研究は、新生児および成マウスの完全な皮膚におけるLTMR形態を二光子顕微鏡を用いて調査していることを示しています。この縦断的イメージング手法は、組織固定の限界を克服し、完全な組織における軸索構造のリアルタイム観察を可能にします。2光子イメージングで可視化されたAβ RA-LTMRおよびAδ-LTMR軸索形態は、過去のPFA固定組織2,6,7,19,33,34の観察と一致しています。慢性画像検査中に炎症や形態変化が目に見えなかったため、レーザー出力による局所的な皮膚加熱や損傷の証拠は観察できませんでした。この生命体内イメージング法を合わせると、異なる機械受容体集団が発達過程および...

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開示事項

著者らは関連する開示は報告していません。

謝辞

この研究を通じて、ハンナ・エラム博士、スニグダ・ムケルジー博士、ラシェル・ラリヴィー博士、テギー・J・ヴァダッカン博士の皆様に感謝申し上げます。イソフルランシステムの設置に協力してくれたライアン・マイケル・ヌエラに感謝します。この研究はハワード・ヒューズ医学研究所ハンナ・グレイ・フェローシップ(助成金#GT17518)によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
対物レンズ20倍およびスーパーNA 1.0オリンポス1-U2B965二光子顕微鏡装置
22x60 カバースリップVWR16004-330二光子顕微鏡装置
空気硬化モデリングクレイDAS二光子顕微鏡装置
麻酔用エアポンプ(HF)、110VRWDライフサイエンス社R510-30イソフルラン系
麻酔同心マスクRWDライフサイエンス社R510-Mイソフルラン系
麻酔誘導室およびndash;マウスとラットRWDライフサイエンス社V105イソフルラン系
Bruker Ultima Investigator Plus レーザー走査顕微鏡ブルーカー・ナノ社およびnbsp;二光子顕微鏡装置
バタフライニードルズフィッシャー・サイエンティフィック1484041二光子顕微鏡装置
カメレオン・ディスカバリーNXとTPC:デュアル一貫性1385777二光子顕微鏡装置
新生児マウス用のチューブ付きコーンマスクRWDライフサイエンス社68680イソフルラン系
デュアルエミッションフィルター(et525/70mおよびet595/50m)およびt565lpxr 二色性ビームスプリッターニコンINVP-01二光子顕微鏡装置
エピ蛍光フィルターセットET-GFP ET470/40xおよびET252/50m;二色性T495LPXR ニコン518065二光子顕微鏡装置
エタノールデコン・ラボラトリーズ社二光子顕微鏡装置
遠赤外線ウォーミングパッドとコントローラー(交流電源)ケント・サイエンティフィックRT-0515二光子顕微鏡装置
GaAsp 検出器(2) 浜松フォトニクス HED-UP-2 二光子顕微鏡装置
ガスフィルターキャニスターRWDライフサイエンス社R510-31-6イソフルラン系
高真空グリースシグマ・オルドリッチZ273554イメージングシステム
イソフルラン、USP(250 mL)ピラマル集中治療6679-017-25イソフルラン系
レーザーカバーボックス テコ・テクノロジーイメージングシステム
マウス:B6.129S6(cg)-ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/Jジャックス27214
マウス:B6。Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/Jジャックス30220
マウス:B6。Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/Jチャールズ川3709
ナイア ヘアリムーバークリームアマゾン28001二光子顕微鏡装置
生データファイルゼノド10.5281/zenodo.17370834
大型の長方形インサートホルダーを備えたリジッドスタンドソーラブMP15M二光子顕微鏡装置
小動物麻酔手術プラットフォームRWDライフサイエンス社R510-PGLイソフルラン系
ソーズ潤滑眼軟膏バウシュ+ロンブ二光子顕微鏡装置
スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィッシャー・サイエンティフィック12-550-15二光子顕微鏡装置

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