Method Article

多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

DOI:

10.3791/69601

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February 6th, 2026

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1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、多孔質膜挿入を用いて軸索mRNAを単離する堅牢な方法を提示し、全ニューロンと神経突起の分離およびRNA精製を可能にします。RTddPCRと組み合わせることで、低コピー転写体の絶対定量が可能となり、mRNA輸送および局所翻訳の研究を高感度、再現性、そして広範な実験応用で可能にします。

Abstract

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ニューロン内のmRNAの局在化と翻訳の空間的動態は、神経細胞の結合性、シナプス可塑性、損傷への応答など、さまざまな神経機能機構に不可欠です。ニューロンの極性が非常に強いため、これらの多くの機能は軸索が特定の転写産物を局所的に翻訳する能力に依存しています。しかし、これらの細胞内RNA集団の定量化は技術的には依然として困難です。ここでは、培養した齧歯類ニューロンから体細胞および軸索的に富む別個の区画を得て、区画特異的mRNA発現を定量化するための再現性のあるアプローチを述べます。一次齧歯類の胚性または成体ニューロンは、サイズ1〜3μmの多孔膜を持つ挿入物で培養されました。これらの膜は軸索にのみ許容されており、体細胞区画と軸索区画の物理的分離を可能にします。その後、全ニューロンおよび軸索富集画からRNAを個別に分離し、これらは遺伝子特異的プライマーを用いた逆転写酵素ドロップレットデジタルPCR(RTddPCR)に用いられました。このシステムは細胞内区画間の絶対的な定量比較を提供し、局所的な転写産物の高感度検出を可能にします。このアプローチは定常状態のRNA存在比を測定し、神経栄養因子、ストレス、損傷モデルに応じた軸索RNAの変化を時間経過で検証することを可能にします。物理的区画化とRTddPCR解析の組み合わせにより、交差汚染を減らし、希少転写本の正確なコピー数を得ることで、高い感度、再現性、そして軸索成長と再生を制御する低コピー数mRNAの検出が可能です。この方法は、タンパク質合成の測定、RNA安定性の研究、siRNAや特定のタンパク質を遮断する薬剤を用いた摂動実験など、下流の検査にも適用されます。重要なのは、この技術が異なる神経のサブタイプ、発達段階、損傷モデルに適応できることです。一般的に、このアプローチは軸索mRNAの局在の分子基盤とそれが神経機能や疾患メカニズムに与える影響を研究するための柔軟で感度が高く再現性の高い方法です。

Introduction

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ニューロンは生物学において最も構造的に複雑で極性のある細胞の一つです。長いプロセスを持ち、時には1メートルを超える距離に達することもあります。この極性は細胞のコミュニケーションやタンパク質の恒常性を異なる形で複雑にします。これらの要件に対応するための洗練されたアプローチとして、mRNAを軸索や樹状突起などの遠隔区画に輸送し、局所的なシグナル1,2,3に応じて調整された方法で翻訳を促進する方法があります。局所翻訳により軸索は時空間的にタンパク質を合成できます。この過程は軸索の発達、シナプス可塑性、損傷後の再生、そして発生刺激および細胞外刺激への応答(4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15)への応答に極めて重要です。

軸索における局在するmRNAの機能を解析する能力は、正常な神経機能や病態生理学の文脈におけるmRNAの役割を理解する上で極めて重要です。軸索mRNAの翻訳調節障害は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)17,18,19、脊髄性筋萎縮症(SMA)20,21、アルツハイマー病(AD)22など、さまざまな神経変性疾患16と関連しています。損傷後の軸索再生は、細胞骨格タンパク質、シグナル分子、受容体の迅速かつ正確な翻訳に大きく依存します。これらの新しい概念にもかかわらず、この分野は軸索特異的mRNA集団を効果的に定量・捕捉することに依然として課題に直面しています。

軸索転写体学の課題の一つは、ソーマと軸索をきれいに分離させることです。ほとんどのmRNAは体体内で濃縮されているため、細胞体からのわずかな汚染でも特定のmRNAの軸索成分評価結果に影響を与えることがあります。マイクロフルイディックチャンバー29、30、31、32 やカンペノーチャンバー33などの従来型技術は、方向性のある軸索成長と両区画間の明確な分離を提供しますが、軸索収量は、バルクRNAシーケンシング(RNA-seq)、RNA共免疫沈殿後のRNAシーケンシング、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)などの生化学的研究には低すぎることがあります。バルクRNA-seqやqPCRは有益であるものの、軸索の低コピー転写体を正確に同定するために必要な感度を欠くことが多いため、生理学的に重要な種の誤った推定が生じています。

これらの課題に対処するため、私たちや他の研究者は、軸索とソーマタ34,35,36,37,38,39,40,41の物理的分離に透過性膜挿入を用いてきました。これらの挿入物は微多孔質の表面にニューロンを発達させ、軸索はそこから下部区画に伸びることができますが、体細胞には伸びません。この基本的ながら効果的な構造により、ソーマと軸索が明確に物理的に分離された大量のニューロンを培養することが可能となります。膜ベースの方法は、マイクロ流体デバイスに伴う技術的問題を回避し、分子および生化学的研究に利用できる大量の軸索材料を得られるため重要です。また、機械的損傷などにも使いやすいため、神経修復に関連するさまざまな実験環境で有用です。ここで説明する方法は、培養条件の改良、膜孔の特性調整、低収量軸索RNAサンプルの逆転写酵素ドロップレットデジタルPCR(RTddPCR)に基づく検証を組み込むことで、神経の収量と純度をさらに最適化します。

軸索分画が純粋であることも重要です。下部チャンバーから軸索を抽出するには、上部表面から残った体細胞物質を慎重に取り除いてからのみ行います。プライマー検証では軸索マーカーの強い濃縮と、体細胞マーカーの全無または無視できることが示されました。分子による確認はこの区別を強化します。軸索分画は Gap43などの認識された軸索mRNAで豊かにされ、 Actγ42の発現は低いです。これにより、インサートシステムはソーマ含有量がほとんどない軸索サンプルを作り出し、さらなる検査に適しています。

濃縮軸索分画を単離した後、次の課題は極めて低いコピー数で存在するmRNAを測定することです。軸索分画からのわずかな起発物質と軸索内の低コピー数mRNAの存在は、標準曲線を用いた従来の逆転写酵素定量PCR(RT-qPCR)の感度限界を押し広げています。さらに、RT-qPCRは特定の転写本の絶対コピー番号も提供しません。一方、RTddPCRはcDNAサンプルを数千のドロップレットに分離し、ポアソン統計を用いて正確な転写本数を得るのに役立ちます。これにより、たとえ1ナノグラムの総RNA5,6,7,43にわずかなコピーしか存在しなくても、転写本を確実に見つけることが可能になります。

本稿では、挿入物上で異なる成体または胚の齧歯類ニューロンを培養する方法、軸索濃縮区画と軸索濃縮区画からの全ニューロンからのRNA分離、軸索純度の確認、そしてmRNAコピーのRTddPCRに基づく絶対定量を含む簡潔なアプローチを提供します。これらの手法は、基底条件下で軸索に局在する特定のmRNAのレベルや、軸索切断時や成長因子刺激、神経毒性シグナルへの応答時の変化を決定するために利用できます。この手法をタンパク質共免疫沈殿と組み合わせることで、軸索中のリボ核タンパク質(RNP)複合体の動態も評価できます。例えば、私たちはこの方法を広範に用いて、軸索性のRas GTPase活性化タンパク質結合タンパク質1(G3BP1)顆粒に存在するmRNAの研究に行っています。G3BP1はストレス顆粒44のコア成分であり、過去の研究では軸索タンパク質合成を阻害し、PNSおよびCNS軸索再生の両方を阻害することが示されています。さらに、この手法はALS、SMA、ADなど様々な病態生理学的状態における軸索翻訳異常の調節の役割を調査するためにも活用可能です。

本研究の目的は、感度が高く再現性があり、拡張性のある軸索mRNA測定法を創出・検証することです。区画化された挿入培養とRTddPCRベースの定量を組み合わせることで、軸索転写学の長年の課題に対するこの分野の解決策を提供します。この手法は局所翻訳に関する重要な発見を可能にするだけでなく、神経修復や神経変性における治療的介入に焦点を当てた翻訳的研究の基盤を築くことになります。

Protocol

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1. 細胞シーディング用の挿入物の準備

  1. 適切な孔径のインサートを6ウェルプレートに配置します。
    注意:軸索をソーマから分離するには1μmの孔径を使い、すべての神経突起(軸索と樹状突起)を体細胞から分離するには3μmの孔径を使用してください。
  2. 6ウェルプレートに100 μg/mLのポリL-リジン(PLL)を加え、インサートの底部と上部(2 mL/ウェルおよび1 mL/インサート)に接触させます。
  3. 37°Cで一晩抱卵します。
  4. 井戸(インサートの底)と上部を無菌超純水で洗い、5分×4回洗います。
  5. 背根神経節(DRG)ニューロンのみに対して、5 μg/mLのラミニン(2 mL/ウェル、1 mL/インサート)を加え、37°Cで少なくとも1時間培養します。 インサートの上下両方が均等にコーティングされていることを確認してください。
  6. 無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.4)で100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを含む洗浄液を2回、5分×洗浄します。
  7. 胚性皮質5、海馬45、基底前脳コリン作動ニューロン31,32の6細胞/挿入物を1×10個左右にシードして進行します。成体ラットのDRGについては、プレート6-8 DRG/挿入5,7(図1)を行います。

2. 6ウェル挿入から神経細胞下画分の収集

  1. 1回の挿入物と6ウェルプレートの1ウェル/インサートに、1.5mLのマイクロ遠心分離管にそれぞれ250μLのトリゾールを割り当てます。脇に置いておけ。
  2. 別の6ウェルプレートに、1ウェルあたり2mLの滅菌PBSを加えます。ウェルやプレートの数はインサートの数に比例すべきです。
  3. インサートの上下から吸引培養培地を抽出し、PBSを含む6ウェルプレートに挿入液を移します。
  4. 鉗子を使ってインサートを優しく置き、その上にPBSを2mL加えます。インサートの上下から媒体を吸引し、これを繰り返します。合計でPBSで2回洗い、新しいPBSのままにしておきましょう(インサートの上部と下部にそれぞれ1 mLと2 mL)。
  5. ニューロン全体の分離
    1. 滅菌細胞スクレーパーを使って、インサートの上部であるニューロン全体をこすり取ってください。細胞が剥がれ始めますが、膜が破れないように十分な圧力をかけます(図1)。
    2. インサートからニューロン全体を採取し、1.5mLのマイクロ遠心分離管に移します。
    3. チューブを10000〜15000gで2分間遠心分離します。
    4. 上澄液を廃棄し、溶解液を250μLのトリゾールに再懸濁します。
    5. このチューブをニューロン全体の部分としてラベル付けしてください。
    6. 神経突起の分画採取を続けてください。
  6. 神経突起分の分離
    1. 滅菌綿棒を取り、片方の端でニューロン側を上から下へゆっくりとジグザグに動かします。インサートを90度回転させ、綿棒の反対側で同じことを繰り返します(両面綿棒を使う場合、または片面の綿棒なら新しいものを使いましょう)。この綿棒は廃棄します(図1)。
    2. 新しい綿棒を使い、インサートの中央から外側に向かって同心円状に動かします。壁の周囲も必ず掃除してください。
    3. 膜インサートを逆さ(ニューライト側が上向きに)し、新しい滅菌メスの刃で膜を切断しつつ、鉗子で保持します。周囲に約2〜3mmの距離を残しておきましょう。
    4. 切断膜をトリゾールを含む6ウェルプレートにニューライト側を下向きに置きます。必ず水没させてください。
    5. 6ウェルプレートからニューライト解離液を含むTRIzolを採取し、1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。
  7. 全ニューロン溶融体と神経突起溶融体の両方については、RNA分離を行うか、解裂液を-80°Cで保存して後で処理します。

3. RNAの単離と定量

  1. RNA単離
    注意:この部分は、必ずRNaseを使わない環境で、専用の滅菌プラスチック器具と手袋を着用してください。
    1. クロロホルム1 mL 1 mL TRIzolを加え、激しく振って15秒、室温で2〜3分間培養します。12,000 g × 4°Cで15分間遠心分離し、有機層、間相層、水層(RNA含有)に分離します。
    2. 上部水相を新しい管に移し、間相を避けます。RNAを沈殿させるには、イソプロパノール1巻を加えて優しく混ぜます。室温で10分間(または-20°Cでより長く収量を上げる)培養し、RNAを沈殿させます。12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、RNAをペレット化します。
    3. 上澄液を捨て、75%エタノール1mLでペレットを洗浄します。短時間ボルテックスを行い、7,500 × g で4°Cで5分間遠心分離機を行います。
    4. RNAの溶解:エタノールウォッシュを慎重に取り除き、ペレットを5〜10分間自然乾燥させ、完全に乾燥させないようにしてください。ペレットをRNaseフリー水またはTris-EDTA(TE)バッファー1個に再懸浮させ、55〜60°Cで培養して完全溶解させます。精製したRNAは-80°Cで保存します。
  2. リボグリーンアッセイを用いたRNA定量
    注:RiboGreenアッセイ(下記)は核酸特異的な蛍光染料を使用しており、UV吸収法よりも感度、特異度、そして完全なRNA検出能力が高いです。DNA汚染が問題の場合はDNase処理を検討してください。
    1. TEバッファー1個を準備し、提供された20個のTEバッファーをRNaseフリー水で20倍に薄めます。リボグリーンの作業用溶液を準備し、光に敏感な染料をホイルで保護します。高範囲アッセイ(10 ng/mL-1 μg/mL)では濃縮染料を1:200に希釈し、低距離アッセイ(2.5 ng/mL-50 ng/mL)では1×TEで1:2000を希釈します。キットのRNA標準を1x TEで連続希釈してRNA標準を準備し、予想されるサンプル範囲をカバーします。標準は三重にして実行してください。
    2. アッセイのダイナミックレンジに合わせて1倍TEでRNAサンプルを希釈して試料を準備します。サンプルを三重にして検査してください。
    3. リボグリーン作業液とRNA標準またはサンプルを等量(例:各100μL)を加えます。室温で2〜5分間、光を遮ってキュベーションします。適切な設定(励起~500 nm、発光~525 nm)で蛍光を測定します。試薬の空白値を測定し、減算します(1x TE + リボグリーン染料)。
    4. 分析と定量:標準の蛍光値と濃度を用いて標準曲線をプロットします。この曲線を使ってサンプル中のRNA濃度を決定します(図2)。

4. cDNA合成

  1. すべての部品を氷の上で解凍してください。各チューブを軽く弾いて混ぜ、使用前に短く回転させてください。氷上のPCRチューブでは、各反応ごとに以下の成分を組み合わせます。
    RTマスターミックス(5倍):4 μL
    RNAサンプル:可変(最大1μgの総RNA)
    ヌクレアーゼフリー水:総体積20μLまで
    注:ノーテンプレート対照群(NTC)の場合、RNAサンプルをヌクレアーゼフリーの水に置き換えてください。
  2. チューブを優しく混ぜて回し、底の内容物を集めてサーモサイクラープログラムを実行してください。
    プライマー焼きなまし:25°Cで2分間
    cDNA合成:55°Cで10分間
    加熱不活化:95°Cで1分間

5. プライマー設計と検証

注:RTddPCRプライマー設計は一般的に定量qPCRと同じ原理に従いますが、正負の液滴を明確に分離するために追加の注意が必要です。このプロセスを促進するために、NEB、IDT、またはThermoFisherのプライマー設計ツールを使用してください。成功するRTddPCRアッセイは、高い特異性と堅牢な増幅によって定義され、増幅(陽性)と非増幅(陰性)のドロップレットの間に明確な分離が生まれます。以下のNCBI RefSeq登録IDがPCRプライマーの設計に使用されました:

行動速度:NM_001127449.1
フォワード1:CAGTCTAACAGGGTGGGGGAAAG
裏面1:CCAACTCAAGGCAAGTAACAACAC
アンプリコンの長さ:98
フォワード2:GTAGTGATGTGTGTGCAGGGTATT
裏面2:GACTTTCCCACCCCGTTAGAC
アンプリコンの長さ:118

ギャップ43:NM_017195.3
フォワード1:GGAAATTTTTGCACTGTACCC
裏面1:GACTCCTCAGAGAGGACAT
アンプリコンの長さ:122
フォワード2:キャグトキャットキャットガァアッタッキャットグアッタグッカ
裏面2:CATTGCACACACACACTTGG
アンプリコン長:116

  1. 推奨されるプライマー長を18〜30塩基対、GC含有率40〜60%のプライマーを設計してください。融点(Tm)が55〜65°Cの範囲で、前方と逆方向のプライマーが2〜5°C以内に位置するようにしてください。GCクランプを使い、3フィート端の最後の5塩基内に1つまたは2つのGまたはC塩基を組み込み、結合特異性を高めつつ、GやCの長い連なりは避けましょう。
  2. プライマー特異性を検証するために、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)などのアラインメントツールを用いて、プライマーが意図した標的配列にのみ結合することを確実にします。増幅細胞は50〜200塩基対の大きさを設計し、最適は約100塩基対を選びます。これは、生成物が短い方が増幅効率が高く、プライマーダイマーと区別しやすいためです。
    注:本研究では、RT-ddPCRでは短いPCR産物が長いものよりも高い効率で増幅されることが多いです。
  3. プライマー二量体を最小限に抑えるには、GC含有率が50〜60%で、二次構造を避け、3'相補性を持つプライマーを設計します。プライマー検証時にはアガロースゲル電気泳動を用い、プライマー二量体を評価するには必ずノーテンプレートコントロールを用いてください。
  4. 二次構造形成の可能性が高い領域にプライマーを設計するのは避けてください。これは増幅効率を妨げる恐れがあります。

6. RTddPCR

注意:QX200 ddPCRシステム(Bio-Rad)を使用して、製造元の指示およびDas ら(2022)43の記述に従いRTddPCRを実施し、アッセイの再現性を高めるためにいくつかの細かな調整を行ってください。

  1. 適切なcDNAを用いてddPCRの即使用ユニバーサルミックスおよび標的特異的プライマーでRTddPCR反応を準備します。
  2. ドロップレットジェネレーターを使ってドロップレットを生成します。
  3. エンドポイント蛍光をドロップレットリーダーで読み取り、内蔵ソフトウェアでデータを解析します。
  4. 正確な定量化と再現可能な液滴形成を確保するために、以下の品質管理措置を用いてください。
    1. プライマーセットは同じ行や同じ列に一貫して走らせてプレートの影響を最小限に抑えましょう。
    2. 小量のピペッティングを減らすためにマスターミックスを準備してください。
    3. 気泡を防ぐために低流量ピペットを使用し、均一なサンプル配分にはマルチチャネルピペットを使用します。
    4. 液滴生成後はプレートを優しく扱い、蒸発を防ぐためにすぐに密閉してください。
    5. すべての反応は氷上で準備し、試薬の繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。
    6. 汚染を監視するために、各プライマーセットにテンプレートなしコントロールを含めてください。
    7. 1万個未満の許容液滴を含む井戸は分析から除外します。
    8. 再現性を確保するために、すべてのサンプルに対して技術的再現を実施してください。
  5. 液滴蛍光振幅プロットを手動で検査し、自動閾値測定の正確性を検証します。

Results

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一次胚の齧歯類皮質ニューロン、海馬ニューロン、PLL被覆1μm挿入物にプレートされたBFCNは強固に接着し、神経質を5〜7日間in vitro (DIV)に延長します。11 DIVまでに、文化は密集したネットワークを示します。成体ラットのDRGでは、PLL被覆された3μm挿入部にラミニンを一層加えることで、軸索延長が5DIV分に相当します。これらの観察は、挿入物が長期的な神経細胞成長を支え、下流RNA抽出に必要な十分な軸索材料を提供できることを確認しています。必要に応じて、複数のインサートを組み合わせて十分な素材を確保します。

個々の挿入物からTRIzolを抽出することで、逆転写およびその後のddPCRに必要な十分なRNAが得られます。RiboGreen定量により、全ニューロン分画からは一貫したRNA収量(212.85 ng/挿入)が確認され、神経突起分からは低い収量(42.75 ng/挿入)が確認されました(図2)。一般的に、神経細胞が豊富に使われる部分に比べて、全ニューロン分画から約5〜7倍のRNAが得られます。

すべてのプライマーはRTddPCR実験前に検証されています。各ターゲット転写産物に対して、少なくとも2つのプライマーセットを注文し、同じニューロンサンプルから生成されたcDNAに対して従来のPCRを用いて試験します。最も強く特異的な帯を作るプライマーペアがRTddPCRのために選ばれます(図3A)。例えば、 Gap43にはプライマーセット1を選びました。 Actγのように曖昧な結果がある場合には、アニーリング温度を最適化するために勾配PCRを行います(図3B)。これにより、絶対定量には十分に検証されたプライマーのみが使用され、液滴分離におけるアーティファクトの可能性が低減されます。

スクレーピングと綿棒採取の手順は、体性区画と神経系区画を確実に分離します。全ニューロン分画から単離されたRNAは、Actγ 46,47,48,49(図4)などの転写産物の濃縮を示します。対照的に、軸索・神経突起の割画は体積が制限されていることと一致し、総RNAの量は著しく少ないものの、Gap43(図4)など遠位突起に局在することが知られている転写産物の濃縮が見られます。体細胞制限転写本の交差検出が最小限であることは、挿入物を慎重に取り扱い最適な密度でプレートした場合に高い区画純度を示します。

良好な結果として特徴づけられるのは、(1) 軸索が明確に伸長した完全な神経形態、(2) 膜の破裂なしに区画がきれいに分離していること、(3) 陽性と陰の液滴を明確に分離する実証済みプライマー、(4) 軸索転写産物に対する強いRTddPCRシグナルがあること。最適でない実験では、RNA収量の低下、神経突起分のソーママーカーによる交差汚染、またはプライマー二量体化による液滴「雨」の増加などのRTddPCRアーティファクトが発生します。これらの問題は、インサート膜の損傷、過剰なスクレーピング圧力、プライマーのアニーリング温度最適化の不十分に関連していることが多いです。

図1
図1:膜挿入を用いた区画特異的RNA分離の概要。 齧歯類ニューロンは、1〜3μmの孔径を持つ半透性挿入物で培養され、これにより神経突起の伸長が可能でありながら体細胞性を制限しました。全ニューロンの準備では、上部区画の細胞を無菌細胞スクレーパーで削り取り、ペレット状にしてTRIzolで溶解し、RNA単離、cDNA合成、RTddPCRを行いました。残留細胞の残渣は無菌綿棒で挿入膜から除去されました。ニューライト製備のために、ニューライトのみを含む挿入膜を逆さにしてメス刃で切断し、TRIzolに直接浸し、その後RNA分離、cDNA合成、RTddPCRを行います。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2
図2:RiboGreenアッセイを用いた標準RNA濃度曲線。 (A) 希釈されたRNA標準の系列で、RiboGreen RNA定量アッセイを用いて蛍光強度を測定しました。線形回帰解析により、RNA濃度と蛍光信号の間に強い相関が認められました(R² = 0.9956)。R²値が1に近いことは、RiboGreenアッセイのRNA定量に対する優れた線形性と信頼性を示しています。(B)Aで得られた傾きの式(y=19.738x + 14.905)を用いて、各区画の総RNAを算出した。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3
図3:PCRおよびアガロースゲル電気泳動によるプライマー検証。 (A) Actγ および Gap43 のcDNAを用いたPCR増幅産物を2%アガロースゲル上で分離し、プライマー特異性を評価しました。各遺伝子に対して、2つの独立したプライマーセット(セット1とセット2)がテストされました。DNAのサイズマーカー(はしご)は隣接レーンに分子量(10 kb、0.5 kb、0.1 kb)を示しています。期待されるサイズの異なる単一バンドは、選択されたプライマーセットの増幅と特異性の成功を裏付けます。(B) PCR増幅は、温度勾配(55-65°C)に沿って Actγ プライマーセット2を用いて最適なアニーリング温度を決定しました。増幅生成物はDNAラダー(レーン2、サイズ表示)とともに2%アガロースゲルで分離されました。試験範囲全体で期待されるサイズの一貫した単一帯が観察され、最も強い増幅は55°Cで検出され、このプライマーセットにとって最適な温度であることが示唆されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4
図4:選択された転写本のRTddPCR解析およびmRNAコピーの定量化。(A,B) (A) Actγおよび(B) Gap43の液滴分離を示す代表的な一次元振幅プロット。各点は単一の液滴を表し、青い液滴は正の増幅を示し、灰色の滴は負の増幅を示します。Y軸は振幅を表し、X軸はddPCRプレート内のウェル位置を示します。陽(青)と陰(灰色)の滴が明確に分離されていることで、指示されたプライマーセットによる標的転写産物の堅牢な検出が確認されました。(C) 全ニューロンおよび神経突起画におけるActγおよびGap43転写産物のコピー数/μLおよびコピー数/gをまとめた表。コピー数推定は、ddPCRドロップレットカウントを用いた絶対定量から得られました(パネルA、Bに示されています)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

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再現性にはいくつかのステップが重要です。インサートコーティングは神経細胞の接着を促進するために均一でなければなりません。未完成の被覆は神経突起や軸索の成長不良を引き起こします。細胞プレートの密度も同様に重要で、密度が高いと樹状細胞の交差が増加し、稀なプレートは軸索RNAが不十分に供給されます。スクレーピングと綿棒の手順は正確に行う必要があります。圧力が低すぎると体細胞汚染が残り、圧力が強すぎるとインサートが損傷するリスクがあります。

プライマー検証はもう一つの重要なステップです。各転写体に対して2つの独立したプライマーセットを運用することで最も信頼性の高いペアを選べ、勾配PCRはさらにアニーリング温度を精緻化できます。この方法によりプライマー-ダイマー生成が減少し、液滴の透明度が向上し、生物学的複製体間での再現可能な定量が保証されます。このアプローチは高い区画純度を実現しますが、体細胞物質からの微量汚染を完全に排除することはできません。軸索RNAの収率は本質的に低いため、フルトランスクリプトームシーケンシングなど大量の入力を必要とする解析の範囲が制限されます。この方法の重大な制約は、遠位軸索と近位軸索の転写本局在を扱えないことです。膜孔を通るグリアや内皮細胞の延長は特定の条件下で報告されていますが、私たちの培養システムはこの可能性を最小限に抑えています。成人のDRG培養では、シトシンβ-D-アラビノフラナサイド(Ara-C)5,7の添加および他の神経細胞培養(皮質、海馬、BFCNs)に血清フリー培地を使用することで、グリア細胞および内皮細胞の増殖が効果的に抑制されます。さらに、ここで使用されている剛性ポリカーボネートまたはポリエチレンテレフタレート(PC/PET)膜は非弾性で、活発な細胞移動に対しても許されません。さらに、DRG培養には大径軸索の通過を可能にするために3μmの孔径挿入を用いています。対照的に、皮質やBFCN培養では1μmの孔径挿入を用い、これによりグリアの移動がさらに制限されます。これらの特性は、柔軟な孔を通じた内皮移動を支援するPDMSベースのマイクロデバイスとは私たちのセットアップを区別しています。先行の報告34、35、36、40と一致し、本研究の分子検証は軸索転写産物(例:Gap43)の強い濃縮と体細胞マーカー(例:Actγ)の検出が無視できることを確認し、膜を通過する物質の神経特異性を支持しています。物理的制約がグリア移動を完全に排除するわけではないため、研究者はGfapをネガティブマーカーとして用いるべきです。

マイクロ流体装置と比べて、インサートシステムはよりシンプルでスケーラブルであり、ルーチン培養ワークフローにも互換性があります。特殊な装置を避けつつ、再現可能な軸索-ソーマ分離を可能にします。挿入物とRTddPCRを結合することで、アクセスのしやすさと高い感度を提供し、qPCR検出閾値以下でしばしば低い転写本の絶対定量を可能にします。このプロトコルは、軸索転写本の局在変化の探査、発達、神経毒性、損傷刺激に対する局所翻訳の評価、さらに神経変性疾患や神経発達障害に関連するRNA輸送欠損の研究に適しています。将来の改良には、複数のmRNAを同時に定量するための多重RTddPCRや、低入力RNAシーケンシング手法との統合によるトランスクリプトームカバレッジ拡大が考えられます。さらに、このシステムをヒトiPSC由来ニューロンに適応させることで、疾患モデリングや再生研究への応用が拡大する可能性があります。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PKSは、軸索再生および神経変性におけるG3BP1細胞透過性ペプチドの使用に関する米国特許を保有しています。他の著者たちは利益相反を認めていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、マーキン末梢神経障害・神経再生センター(P.K.S.)からの助成金によって支援されました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6ウェルプレート用細胞培養挿入物、1.0 μm 毛穴サイズ、無菌コーニング353102消耗品
6ウェルプレート用細胞培養挿入物、3.0 μm 毛穴サイズ、無菌セルトリート230603消耗品
狭刃付きセルリフターVWR76036-006消耗品
CELLSTAR 6ウェル組織培養プレートVWR82050-842消耗品
ddPCR 96-ウェルプレート バイオラッド12001925消耗品
ddPCRドドロップレットリーダーオイル バイオラッド1863004試薬
QX200/QX100 ドロップレットジェネレーター用のDG8カートリッジバイオラッド1864008消耗品
ラミニンGibco/Fisher Scientific23017-015試薬
LunaScript RTスーパーミックスキットNEBE3010L試薬
蛍光ベースの96ウェル黒色マイクロプレートサーモ・フィッシャーM33089消耗品
PCRプレート熱封、ホイル、ピアス可能バイオラッド1814040消耗品
ポリリジンシグマP1274試薬
PTC Tempo 96 サーマルサイクラーバイオラッド12015382装備
クアンタソフトソフトウェアバイオ・ラッドPCRデータ解析ソフトウェア
Quant-it リボグリーン試薬およびRNAアッセイキットサーモ・フィッシャーR11490試薬
QX200 ddPCR エヴァグリーン・スーパーミックスバイオラッド1864034試薬
QX200 エヴァグリーン用液滴生成オイルバイオラッド1864005試薬
QX200 液滴発生器バイオラッド17005227装備
QX200 ドロップレットリーダーバイオラッド17005228装備
トリゾル試薬インビトロジェン15-596-026試薬

References

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