ラットの全層皮膚創傷の柔軟な電磁コイルパッチによる治癒促進

サマリー

このプロトコルは、柔軟な銅コイルパッチを用いてラットに全層円形の皮膚創を作り、その治癒を促進する方法を示し、電磁場を脈動させる。

要約

慢性および大きな皮膚創は治癒の遅れと高い感染リスクにより、臨床的に大きな課題をもたらします。パルス電磁場(PEMF)療法は非侵襲的なアプローチであり、組織修復を促進することができます。本研究は、柔軟な印刷銅コイルパッチをカスタムPCBコントローラに接続し、全層の背側創傷に局所的なPEMF刺激を届ける再現可能なラット創傷モデルプロトコルを説明しています。対側の傷は未治療の対照群として機能しました。治癒の進行状況は定期的な写真撮影と創傷面積測定で評価されました。このプロトコルは、再生医療における局所的な適用とパラメータ調整に焦点を当て、さまざまな状態におけるPEMFベースの治療をin vivo で評価・最適化するための実用的かつ適応可能なシステムを提供します。パラメータ選択は、線維芽細胞増殖の直交CCK-8スクリーニングに基づいており、0.25〜1.3 mT、10〜40 Hz、1日あたり30〜90分を測定しました。主効果解析では、1.3 mT、30 Hz、60分/日が最適レベルと特定され、 in vivo 試験に採用されました。

概要

慢性的な皮膚創傷(糖尿病性潰瘍など)は健康上の問題が増しており、治癒の障害、感染、切断につながることもあります^。従来の治療は時間がかかり費用もかかるため、組織修復を早める補助療法への関心が高まっています^。電磁場療法はその一例であり、非侵襲的であり、前臨床および臨床の両方で治癒促進効果が示されています 2,3,4,5。極めて低周波(~100 Hz)帯のパルス電磁場(PEMF)は、血管新生や成長^因子の放出を含む修復に重要な細胞プロセスを刺激^{できます。}

例えば、PEMF曝露は糖尿病および健康な齧歯類において線維芽細胞成長因子2(FGF-2)を上方調節し、血管新生8を増加させることで創傷閉合を有意に加速させ^ました。同様に、治癒障害モデル(例:糖尿病ラット)においても、PEMF治療は治癒速度を改善し、新たに形成された組織の引張強度を高めることが示されています^。臨床的には、慢性創傷患者に対してPEMF療法が検討されています。糖尿病性足潰瘍患者を対象としたパイロットランダム化試験では、PEMF曝露下で微小循環血流の増加と創傷閉合の速さが報告されました¹⁰。一般的に、PEMFは他の創傷タイプでも有益な効果を示しており、例えばパルス磁場で治療された火傷の治癒改善が観察されました¹¹。これらの研究は、^{創傷ケアにおける}補完療法としての電磁刺激の可能性を強調し^{ています。}

従来の有線刺激器と比べて、磁気作動は経皮コネクターの必要性を排除し、ハードウェア関連の合併症のリスクを減らします。無線磁気システムは他の文脈でも組織特異的刺激を実現しており、例えば導電性神経誘導導管は交流磁場下で誘導微小電流を発生させ、電流振幅は場パラメータ¹²によって間接的に決定されます。磁気戦略は血管形成を支えることもでき、これは皮膚治癒における重要なボトルネックです。なぜなら、静的または動的磁場が単独または磁気反応性のある生体材料と組み合わせることで、内皮の挙動や血管新生シ^{グナル伝達}を調節することが示されているからです。これらの先例が、非侵襲性と外部プログラム性を保ちつつ、創傷床にPEMFを集中させるコンフォーマルで取り外し可能なコイルパッチの開発を動機付けました^12,13。以下のプロトコルでは、このPEMF療法をラット全層創傷モデルに実施するためのステップを詳細に説明します。これには、装置の適用、刺激の投与、アウトカム評価が含まれます。

プロトコル

すべての動物処置は江南大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されました。番号2025-0630S0360-915[408])をもっていました。このプロトコルは、6〜8週齢のオスのSDラット(約200〜250g)を使って実施しました。実験前は、ラットは個別に飼育され、自由に食物と水にアクセスでき、実験動物の飼育・利用ガイドに従い12時間の明暗サイクルで維持されていました。

1. 全層切除創の創設

1. 動物と外科の場を準備してください。
   1. 誘導室内で3〜4%のイソフルランを用いて麻酔を誘導します。正直反射を失った後は、鼻錐を通じて麻酔を~2%に保ちます。
   2. ラットを無菌の手術台の上に伏せに置きます。背側胸郭(肩甲骨から腰椎中央部まで、側面も含む)を電動クリッパーで剃ります。
   3. 注意:手術用アクセスとコイルの設置がスムーズになるように、中央線の両側に少なくとも5×5cmの毛を除去してください。
   4. 剃った部分を70%エタノールで消毒し、その後ヨードホル溶液を塗ります。エタノールとヨウ素のスクラブを3回繰り返し、最後にヨウ素を塗ります。
   5. 手術室を無菌ガーゼで覆い、計画された傷の部位だけを露出させます。
2. 両側の全層切除創を作ります。
   1. 無菌外科マーカーを使って背側側に直径2cmの円を2つ描き、前肢の後ろの中央線の両側にそれぞれ1つずつ配置します。
      注意:両方の円は大小が等しく、動物内で比較できるように左右対称に配置されていることを確認しましょう^14,15。
   2. 無菌ハサミまたはメスで、円形の皮膚部分を切除します。表皮、真皮、肉塊を除去して全層の傷(~3.14 cm²)を作ります。
   3. 滅菌ガーゼで優しく圧迫して止血を達成します。同じ技術で対側側腹に同じ2cmの傷を作ってください。
      注意:創傷床は露出した筋膜または筋肉で構成され、残留真皮は含まれていません。
   4. 創創形成直後に術後鎮痛(例:リドカイン4 mg/kgを皮下投与)を投与します。
3. 実験グループを割り当てる。
   1. 被験者内設計を用い、一方の創傷にPEMF治療を施し、反対側の創傷を対照として用いてください。
   2. 別のコホートに偽のデバイス(同一の非電源コイル)を受け取り、デバイスの存在を制御します。
   3. 未処理または偽処理された制御を維持し、電磁効果と取り扱いやドレッシング効果を区別すること。

2. PEMFデバイスの応用

1. 傷を包帯し、コイルを位置づけてください。
   1. PEMF治療用の傷の上に、無菌の薄いガーゼまたは半透膜を直接貼ります。創傷床を完全に覆いましょう。
   2. 柔軟な銅コイルパッチを包帯した傷口の上に位置させます(図1)。コイルの中央に傷が収まるように中央に置きます。
      注:コイルの直径(~5 cm)は創傷縁を越えて伸びる場合があります。傷口が有効磁場圏内に収まるようにしてください。
2. コイルを固定しろ。
   1. 医療用接着テープを胴体に優しく巻きつけてコイルを固定します。胸部を圧迫せずにコイルとドレッシングを密接に接させてください。
   2. 必要に応じて、コイルの上に柔軟なアルミストリップを敷いて位置を安定させます。呼吸や局所的な血流の制限は避けてください。
   3. 絡まりを防ぐために、リード線をボディから離す(例えば頭部の方へ)配線してください。
3. PEMF刺激を投与してください。
   1. コイルをPCBコントローラに接続して(図2)、デバイスを起動します。刺激パラメータを30Hz周波数と~1.3 mTの磁場強度に設定し、1日60分持続させます。
   2. 毎日同じ時間(±1時間)に刺激セッションを行い、一定の間隔を保ちましょう。
      注:これらのパラメータは直交CCK-8スクリーニング(0.25-1.3 mT、10-40 Hz、30-90分/日、表1)に基づいて選定され、1.3 mT、30 Hz、60分/日が最適と特定されました(表2)。
   3. コントロール傷の上に同じ非活性なコイルを1時間置いて、偽の治療効果を発揮します。混乱を避けるために、シャムコイルには明確に印をつけてください。
4. 装置を取り出して傷を調べてください。
   1. 60分後にコントローラーをオフにしてください。コイルや接着剤は慎重に取り外してください。
   2. 出血、浮腫、副作用がないか傷口を調べてください。必要なら滅菌ガーゼを交換してください。
      注:1時間の刺激中、コイル表面温度はほぼ周囲温度に保たれます。顕著な加熱は観察されませんでした。
5. 治療後のケアを提供します。
   1. 自己外傷を防ぐためにエリザベス朝の襟をつける。呼吸や摂食に支障をきたさずに適切なフィット感を確保してください。
   2. 後肢に軽くガーゼを巻きつけて背側の傷の引っかき傷を減らします。
   3. 麻酔から完全に回復するまでラットを監視してください。鎮痛を継続してください(例:リドカイン4mg/kgを12時間ごとに2〜3日間、または施設プロトコルに従って投与)。
   4. 研究期間中(例:14日間)毎日PEMF治療を繰り返します。

3. 創傷モニタリングとデータ収集

1. 傷の画像を撮影する。
   1. 負傷後0日、3日、7日、10日、14日の傷の写真撮影。必要に応じて軽い麻酔で動物を動かしないようにしてください。
   2. 各画像に測定スケールを含め、カメラを傷口に対して垂直に固定距離^14,15に位置させます。
2. 傷の面積を測ってください。
   1. ImageJの画像スケールをリファレンスルーラーを使ってキャリブレーションします。傷痕のマージンをトレースして、面積(mm²)を計算します。
   2. 各時刻で創傷面積を記録し、ベースラインに対する創傷閉鎖の割合を計算します。
   3. PEMF治療および制御創を定量的に比較します。
3. 組織学のために組織を採取する(任意)。
   1. IACUC承認の手順に従い、実験エンドポイントで動物を安楽死させてください。
   2. 創傷組織サンプルを切除し、組織学的処理のためにホルマリンを固定します。
   3. パラフィン埋め込みおよび染色(例:H&E、マソン三色染色)を行い、コラーゲン沈着、再上皮化、血管新生を評価する^13,16。

4. データ分析と解釈

1. 創傷閉鎖曲線を生成します。
   1. 各グループの時間経過による傷の閉鎖率をプロットします。
   2. 治癒速度とあらかじめ定められた閉鎖閾値までの時間を計算します。
2. 統計分析を行いましょう。
   1. すべての動物の創傷面積データをまとめ、各時点の平均±標準差(SD)を計算します。
   2. 正規性(シャピロ・ウィルク検定)および分散の均質性(レヴェーン検定)を確認しましょう。
   3. 「治療」と「時間」の要素を用いた二方向ANOVAを用いて差を分析します。有意な相互作用が検出された場合は、Tukeyの事後検査を実施してください。
   4. 統計的有意性を*p < 0.05、**p < 0.01と定義します。

結果

この全層ラット創傷モデルでは、フレキシブルコイルパッチを用いた毎日のPEMF療法により、対照群に比べて創傷閉合が有意に速くなりました。効果を厳密に評価するため、ラットはプロトコルの項目で示された実験デザインに基づき3つのグループに分けられました。被験者内対照群(各ラットにPEMF治療済みの傷1つと反対側未治療の創傷1つ、データを解析用に統合)、偽対照群(PATCH:無動力コイルで覆われた創傷)、および未治療対照群(CTRL: 標準的な創傷ケアのみ)。 図1、 図2、 図3 は、これらのグループにおける14日間の創傷治癒の進行を示しています。0日目には、両群の対になった創傷の大きさが等しく、初期状態が一貫していることが確認されました。3日目時点で、対照群とPEMF群の両方で創傷面積の減少が認められました。しかし、統計解析(双方向ANOVA)では、この初期時点でPEMF群と対照群間の創傷面積の差は...

ディスカッション

重要なステップには、対称的な全層創傷の作成、コイルパッチが隙間のない無菌バリアの上に平らに覆われること、そして日々の一定の曝露を維持することが含まれます。逸脱は圃場の投球を減少させ、治癒結果のばらつきを増やすことがあります。

この研究には、発見の解釈や翻訳の可能性評価時に考慮すべきいくつかの制限があります。まず、このプロトコルは急性切除創を持つ健康なオスのSDラット(6〜8週、200〜250g)で実証されており、糖尿病、虚血、感染症、加成、免疫抑制などの臨床的に不安定な治癒環境を完全には捉えきれません。さらに、1.3 mT、30 Hz、60分/日の単一のPEMFパラメータセットのみをin vivoで評価し、このレジメンは in vitro 線維芽細胞増殖スクリーニングに基づいて選択されました。最適な投与量は、樹種、創傷の種類や深さ、包帯やバリアの厚さ、対象となる生物学的プロセス(例:炎症、血管新生、またはリモデリング)によって異なります。シミュレーションやデバイス設計は局所的な投...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞培養プレート	バイディ	H908002	CCK-8アッセイの場合
減脂顕微鏡スライド	シトテスト	P/N.80312-3161	装備は...H&E/マッソン染色
鎮痛剤(塩酸リドカイン注射)	フアム	70011657	オピオイド鎮痛剤、4 mg/kg(痛みのコントロール用)
麻酔装置	RWDライフサイエンス(中国省深圳市)	R520-ISO	酸素供給付きのイソフルラン蒸気化器
自動免疫組織化学染色装置	ライカ	21.2201	自動免疫組織化学的染色
生検パンチ(20mm)	インテグラ・ミルテックス	#33-37	直径2cmの円形スキンパンチ
カメラ、デジタル	ファーウェイ Mate 70 Pro	該当なし	≥創傷画像診断用12 MP
CD31抗体	アブカム	AB182981	IHCの内皮マーカー(図4B)
CD34抗体	アブカム	AB81289	IHCの内皮マーカー(図4B)
細胞計数キット-8(CCK-8)	バイオシャープ	BS350B	体外PEMFパラメータスクリーニング(OD450)に使用
細胞培養皿(10cm)	バイディ	H802004	線維芽細胞培養用の10 cm(100 mm)組織培養皿および注記;
細胞培養培地(例:DMEM + FBS)	バイディ	L100-500	CCK-8スクリーンでの線維芽細胞培養
CO2インキュベーター	熱力学	BB150-2TCS-L	線維芽細胞培養のために
コイル、柔軟な銅	カスタムファブリケーション(社内製造)	該当なし	螺旋プリントコイル(直径5cm、ポリイミド)
コントローラボード(PEMF発電機)	カスタムビルド(社内設計)	該当なし	カスタムPCB、コイルを30Hz、~1.3 mTで駆動
電動ヘアクリッパー	WahlまたはOster(ペットグルーミング)	モデル9160	毛皮の剃りに使う動物グルーミングクリッパー
エリザベス朝カラー(齧歯類)	ミューケバイオ	MK-EC-01	創傷の妨害を防ぐ
埋め込みステーション	エプレディア・ヒストスター	A81000002	組織学の処理(実施された場合)
フェイスマスク	ヴェデング	V531596	麻酔の維持
線維芽細胞(細胞株L929)	プロセル	CL-0137	CCK-8増殖スクリーニングに使用される細胞
有限要素シミュレーションソフトウェア(例:COMSOL Multiphysics)	COMSOL	CM010004	磁場シミュレーション(図5B-C)
フレキシブルアルミストリップスプリント	ディアゴ	1592	コイルの変位を防ぐためのサポート
鉗子	マジェスティック	01625	手術中の皮膚や包覆物の取り扱いについて
ヘマトキシリン&イオシン(H&E) 自動染色・シーリングユニ	DRS-プリズマ-P+フィルム	61770249	日常的な組織学染色のための消耗品
画像解析ソフトウェア	国立衛生研究所	バージョン1.54	創傷面積測定(例:ImageJ)について
画像解析ソフトウェア	国立衛生研究所	バージョン1.54	創傷面積測定(例:ImageJ)について
誘導室	RWDライフサイエンス(中国省深圳市)	802-00132-00	イソフルラン麻酔誘導
赤外線サーマルイメージングカメラ	ヒクマイクロ	H11	モニターコイル表面温度(図5A)
ヨウ素ポビドン消毒剤 10%	ハイノート	該当なし	皮膚消毒剤(ヨウ素)
イソフルラン	RWDライフサイエンス(中国省深圳市)	20037015	吸入麻酔薬(USPグレード)
リドカイン注射 10%	サンマ	該当なし	術後鎮痛のために
マッソンのトリクロム染色キット	バソ	C250202	コラーゲン/ECM可視化用の消耗品
医療用スキンマーカーと定規	トンダウス	該当なし	傷の写真にスケールを含める
マイクロプレートリーダー	熱力学	A51119500C	CCK-8アッセイでのOD450測定
ミクロトーム	エプレディア HM 340E	23900670	組織学/IHCの切開(実施された場合)
ポリホルムアルデヒド組織固定剤	プロフィール共有	SB-C009	動物組織標本の固定
ラットケージ	鳳橋	CP-JM	個別飼育用の標準的なラットケージ。
ラッツ、スプラグ・ドーリー(オス、6–8週間)	魏靖宇蘇州	SCXK2024-0004	200–250g;個別に住み、IACUC承認の使用
メス	金環	35W0602	切除創の創設のために
半透膜ドレッシング	ZD	Q20189	代替創傷バリア
統計解析ソフトウェア(例:GraphPad PrismやR)	ソフトウェア・マッケイフ	10.6.9(890)	二因子ANOVAおよび事後多重比較
滅菌ガーゼ	ZD	3141626	創傷ドレッシング/保護バリア
無菌手術用カーテン	ZD	V271617	皮膚準備後の手術部位をドレープするために
外科用ハサミ	マジェスティック	01627	切除創の創設のために
注射器と針	ミナンク	20193141643	皮下鎮痛投与のために
スライド全体スキャナー	3DHISTECH	該当なし	デジタルスライドスキャン