方法論記事

イソディッドダニ研究における人工膜を通って血液を供給するイソディッドマダニ研究

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DOI：

10.3791/69606

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2026年3月20日

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

この記事について

サマリー

この方法は、3Dプリントされたチャンバーとラボで製造されたシリコーン膜を組み合わせた 、in vitro ティックの血液供給システムの開発を示しています。このシステムは人工的にダニの給餌を可能にし、さまざまな摂食段階での簡単なサンプリングと少量の血液利用を可能にし、イソディッドマダニの研究に非常に貴重なツールを提供します。

要約

本研究は、高解像度フォトポリマー樹脂から作られた3Dプリントチャンバーを用いた人工シリコーン膜を通じたダニ給餌システムの詳細なプロトコルを提示します。この方法には、給餌チャンバーの設計、シリコーン膜の準備、システムの組み立て、そしてダニ給餌のための最適化条件が含まれます。ダニはアメリカ合衆国および世界中で主要な病気の媒介者の一つです。ダニの研究は、ダニ媒介疾患の予防と発生率を効果的に抑えるための戦略を策定するために不可欠です。必須の嗜血性外寄生虫であるダニは、生き延び病気を伝播するために血液を吸血しなければならず、ベクターと宿主の相互作用、病原体伝播、ダニの生物学的・生理的・解剖学的形態の研究において、血液給餌は基本的なプロセスとなっています。シリコーン膜を用いたダニ給餌システムは、過去数十年にわたり広く利用され、改良されてきました。しかし、多くの既存のシステムは単一のダニ種、生活段階、特定の条件に合わせて調整されています。このプロトコルで記述されたダニの摂食システムは、アメリカ合衆国の主要なマニ媒介種である Amblyomma americanum、 A. maculatum、Ixodes scapularis、 Rhipicephalus sanguineus の成虫など、いくつかの重要なマダニ媒介種から部分的に摂食済みおよび完全に膨らんだ個体の両方を入手するために成功裏に用いられています。このシステムは、 Dermacentor variabilis の成虫や幼虫 A. americanumの摂食開始に成功しており、成虫A . americanumで最も高い摂食率(>85%)が観察されました。したがって、本研究で開発された給餌チャンバーは、100μLまでの低容量血液にも適応可能であり、病原体伝播や毒物学的研究において重要です。透明な蓋とチャンバーの高さが最小限で、ダニの摂食時間を通じてダニの観察を容易にしました。

概要

ダニは強制的な血液供給型の外部寄生虫であり、細菌、ウイルス、世界中の動物や人間に病気を引き起こす寄生虫など、幅広い病原体を運び媒介することができます。1,2,3,4。アメリカ合衆国で最大の病気の媒介者であり、世界の他の地域では蚊に次ぐ2,3,5、いくつかのダニ種は病原体関連疾患を媒介し、他の種はアルファガル症候群(AGS、赤身肉アレルギーとも呼ばれる)などの非感染性疾患を誘発することが知られており、近年世界中で報告が増加しています6。 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。ダニの生物学、生理学、遺伝学、媒介者の能力を理解することを目的とした研究は、伝染性および非感染性の両方のマダニ媒介疾患の経済的および公衆衛生的負担を軽減するための戦略を策定するために不可欠です。ダニと宿主の相互作用を研究するには、特定の研究課題に取り組むために部分的に餌を与えたか完全に腫れたダニが必要です。これは生きた動物の給餌によって達成でき、ダニが全ライフサイクルを完遂できるようにします。生きた動物をダニの餌やりに利用することは、ダニコロニーの形成と維持に非常に効果的ですが、実施は困難であり、宿主の利用可能性制限や施設規制のため、すべての研究仮説に当てはまるとは限りません。最も重要なのは、体外ダニ給餌システムの成功裏の導入が生きた動物の使用を減らす助けとなり、「動物利用代替(3Rs)」フレームワーク(置き換え、削減、精製)の研究における重要な目標である20。

人工膜ダニ給餌システムを研究に利用することには多くの利点があり、幅広い科学的課題に取り組む機会を提供します。これらは大まかに三つのグループにまとめられます。(1) 異なる血液源(例えばダニのα-GAL産生など)を用いた宿主血液の変異およびベクター間相互作用への影響評価21、(2) 血液中の化合物投与による殺菌剤毒性の評価22 および血液供給中のダニ分泌化合物の回収23、 (3) 授血中の自然獲得による病原体の供給によるベクター能力の評価2425、26、27などです。さらに、人工膜給餌システムの性質により、宿主に関連した変異を導入せずに、さまざまな処理や濃度を小規模かつ大量に試験できるため、生きた動物の必要性を減らします。

人工膜を通じたダニの給餌システムは研究やダニコロニーの飼育支援に広く利用されており、場合によってはダニの長い生活環を完了させることも可能にしています。ダニの摂食システムとその材料の最適化に関する多くのプロトコルが、異なるダニ種32、33、34に対して報告されています。それでも、体外でのダニの給餌は、システム条件、使用される材料、そして最も重要なダニの種や段階によって大きく変動することがよく知られています。さらに、多くのシステムは連続流システム27のように大量の血液を必要としており、非常に効果的ですが、必要な血液量が多いためコストがかかることがあります。このプロトコルは、アメリカ合衆国で5種異なるダニ病媒介種の成虫段階で成功が示されている人工膜ダニ給餌システムの詳細を説明しています。これにはAmblyomma americanum、A. maculatum、Ixodes scapularis、Rhipicephalus sanguineus、Dermacentor variabilisが含まれます。

プロトコル

マダニの給餌実験は、市販の除鉄剤付き牛血(Hemostat Laboratories, CA, USA)および去細血管化ヒト血液(Bioivt, CA, USA)を使用して行われました。これらは、機関動物ケア・利用委員会(IACUC)および機関審査委員会(IRB)承認のプロトコルとガイドラインに従って血液を採取・処理します。本研究では生きた脊椎動物をダニの餌に使用しませんでした。このプロトコルで使用されるすべてのダニは、オクラホマ州立大学のダニ飼育施設から購入されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. マダニの摂食室

  1. 無料の3D設計ソフトウェアを使って、35mm x 10mmのペトリ皿に収まるチャンバーを設計してください。印刷部品のサイズ(図1A)は以下の通りです:チャンバー本体(パート i)25mm(内径)×20mm(高さ)、底面の壁厚3mm、上蓋リングの厚さ6mm(パート ii)、内径30mm×高さ5mm、壁厚3.5mm、外輪(パート iii)31mm(内径)×高さ5mm、壁厚3mm。
    注:蓋リングには、磁石を設置するための直径3mm×高さ2mmの円形開口部が4つあります。チャンバーの上部にも磁石を取り付けるための同じ大きさの開口部があります(図1B)。3Dモデルのデザインは、最も一般的な3Dプリントファイル形式である .stl ファイルとして保存すべきです。このプロトコルで使用された3D設計を含むファイルは、要望に応じて提供いたします。
  2. 10インチの14K LCD3Dプリンターを用いて、グレーまたは白色のフォトポリマー樹脂(図1A)や、.stlファイルから3Dモデルを印刷する他の高解像度3Dプリンター/サービスを使用してチャンバーを印刷します。
    注:このプロトコルはアリゾナ大学の印刷サービスと樹脂を使用しています。高解像度樹脂を使用することで、詳細で耐久性のあるチャンバーを作成できます。
  3. 手袋を着用し、組み立て前に洗浄し、必要に応じて細かいサンドペーパー(180〜200番)で優しく研磨して樹脂の残留物がないか確認してください。パーツ i (図1A)の平らな底面が滑らかであることを確認しましょう。これによりシリコーン膜の適切な接着が保証され、漏れのリスクが減ります。
  4. すべての乾いた作品をUV光に10分間当てて、樹脂の完全な重合を確実にします。
    注:有害樹脂を印刷に使用するほとんどの3Dプリントサービスは、UV光を使って樹脂を硬化させ(モデルを硬化させ、樹脂の毒性を除去します)、しかし、時折「完全に硬化していない」状態が残ることもあります。完全に硬化していないモデルは触るとわずかに粘着性があり、偏極されていない樹脂を含んでいることがあり、これは有毒または取り扱い時に刺激を引き起こすことがあります。紫外線を多く照射することで樹脂の完全な硬化が保証されます。
  5. 3mm×2mmの丸い磁石をチャンバーと蓋リングの上部のスリットに透明エポキシ接着剤で接着します。室温(20〜25°C、最低16時間)で一晩乾燥させます。蓋リング上部の磁石にかかる磁極の引力に合わせるために、磁石の極が一方向に向いていることを確認してください(図1A、パート ii)。
  6. 図1A–Cに示すように、すべての部品が適切に適合するようにモデルのすべての部品を組み立てます。

2. 膜の準備

  1. 30cm×30cmのラップをきれいな面に貼り、平らな面で伸ばしてしわがつかないか確認し、端をテープで固定します(図2Ai)。
  2. レンズクリーニングペーパーを4〜5枚、5cm間隔で広げたプラスチック/ラップの上に重ねます(図2Aii)。
  3. 以下に示す成分と量を使ってシリコーン膜を準備します。
    注:この量は4〜5個(7 cm× 12 cm)の膜を準備するのに十分で、それぞれ最大5〜6個の給餌室を収容し、合計20〜30個の室を収容できます。
  4. シリコーン混合物は、シリコーンクリアコーキング15g(硬度20–25ショアA)とシリコーンオイル4.5g(全シリコーンの30%)、ヘキサン2.9g(全シリコーンの19.3%)を加えて準備します。材料をプラスチックの計量ボートに入れ、ヘラで優しく混ぜます(図2Aiii)。
    注意:材料を優しく混ぜて、泡の発生を最小限に抑えてください。
  5. レンズ用紙の小さな端に沿って2〜3gのシリコン混合物を置き、ラップに固定します。シリコーンがレンズ用紙を通り抜けるまで5〜10秒待ちます(図2Aiv)。
  6. シリコーンの混合物をレンズ用紙シートに均等に塗り、蓋や定規、ヘラなどの直線定規器具を使って使います。使用する物体がレンズ用紙の全面積を覆っていることを確認してください(図2Av)。これにより、シリコーンが一筆で覆われ、膜のフリルや物体の縁での波紋を防ぎます。
  7. スプレッディングツールをスプレッディングの開始位置に戻し、膜内のシリコーン混合物がすべて使われていることを確認してください。スプレッティングツールにシリコーン混合物が残るため、ツールを戻して回収することで隙間を避けるためにシリコーン全体が使われます(図2Avi)。
    注意:膜は波紋なく均一に半透明に見えるべきです(図2B)。
  8. 異なる厚さの膜は、まずシリコン混合物の量を増減して準備してください。膜が乾燥するまで厚さを測定できません。
  9. 膜は室温(20〜25°C/最低16時間)で一晩自然乾燥させます。
  10. デジタル屋外マイクロメーター測定ツールを使って膜の厚さを測定します。成虫のダニ種ごとに異なる膜の厚さが用いられており、口の部分が短い(膜の厚さ70μm)から長い口器(膜の厚さ200μm)まで様々です。
  11. 組み立て済みのチャンバーからすべての部品を取り出し、チャンバーの下縁にシリコーングルーを塗布します。正確な接着剤の位置を狙うには、1mlのシリンジを使い、シリコーン接着剤を注ぎます(図2Ci)。
  12. 接着剤の塗布には針の代わりに200μLのピペットチップを置き、針先と同様に注射器の先端にねじ込みます(図2Ciii)。これにより、各チャンバーの下縁に細かい接着剤を塗布できます(図2Civ)。
  13. チャンバーを膜の上に置き(図1、パートi)、重り付きの物体を置いて沈殿を確実にします。室温(20–25°C/最低16時間)で一晩放置します(図2D,E)。
    注意:平らな重りのある物を使いましょう。このプロトコルでは2.5kgのアクリル片を使用しました(図2E)。
  14. チャンバーの膜余剰を曲がったハサミで切断します(図3A)。
  15. ダニ給餌にチャンバーを使用する前に、残っているプラスチックラップ(膜が準備される場所(ステップ2.1)(図3B))を外してください。
  16. チャンバーの部品を組み立て直し、底部に35 mm x 10 mmのペトリ皿を設置し、蓋を逆さにして磁石の間に置いてチャンバーの蓋として使います(図3C,D)。
    注意:蓋は逆さまにして使用してください。蓋のホルダーリングは逆さまにすると蓋にぴったり合うためです(図3C,Dの部品説明参照)。
  17. チャンバー膜を蒸留水に浸し、35mm×10mmのペトリ皿の底部を使ってください。膜は室温(20–25°C/最低16時間)の水に一晩浸します。膜は元々疎水性なので、血液を加える前に水に浸すことで、閉じ込められた泡の発生を減らすことができます。
    注:気泡が存在しないことは、疎水性が除去されたことを確認できます。

3. ダニの摂食と血液の準備

  1. 各チャンバーの蓋に2〜3個の小さな呼吸穴(35 mm x 10 mmのペトリ皿から)(図1Aのパートiv)を開けます。これはステップ2.16(図3E)で言及されています。加熱した金属メスか薄い金属ヘラで蓋の呼吸穴を突き刺します。
    注意:呼吸穴はチャンバーハウジング内に湿度を取り込むことができます。
  2. 最終濃度50 μg/mLのゲンタミシン硫酸塩を血液に補足します。抗生物質は1週間以内に使用予定の血液にのみ添加し、4°Cで保存してください。 抗生物質を投与する前後で牛の血液(または他の動物の血液)は4°Cに保ちましょう。
  3. 35mm×10mmのペトリ皿に2〜3mLの血液を入れ、その上にチャンバーを置きます。調整リングを回転させることでチャンバーの高さを調整し、1チャンバーあたりの使用量を増減させます(図1Aのパートiii参照)。チャンバーの高さを調整し、ペトリ皿の底から膜まで1〜2mmの隙間を残します。参考として図4Aのマゼンタ色の矢印を参照してください。
    注:チャンバーの調整リング設計により、使用される血液の量を制御できます。つまり、ペトリ皿の底と膜の間の空間が大きくなる と、その空間を満たすためにはより大きな体積が必要になります。
  4. 餌を与えていないダニは、オスとメスの同数のチャンバーに入れます。常にオスとメスの両方がチャンバーに入っていることを確認してください。これは摂食率に影響を与える可能性があります(図4B はチャンバー内の成虫A . americanum のオス4匹とメス4匹を示しています)。成虫の段階では、取り扱いを容易にするために1チャンバーあたり最大10〜15ティックが使用されます。
    注:未成熟段階を扱う場合、ティックの数は増加します(1室あたり20〜50匹のニンフ、このプロトコルには記載されていません)。
  5. チャンバーを37°C±1°Cの覆いのあるドライバスに置き、湿度源(水 カップ)を設置し、相対湿度が63%±2%を保つ状態(図4C)を12:12時間の明暗光周期で使用します。
    注意:これらの要件はダニの種類や実験室の条件によって異なる場合があります。必要に応じて他の湿度設定も試し、実験室に最適な環境を評価してください。

4. 血液とチャンバーの代替

  1. 血液交換の合間に膜をすすぐための溶液を入れたスカートボトルを2本用意してください。1本のボトルに蒸留水に0.005%のナイスタチン溶液を加えます。2本目には蒸留水を加えます。
  2. 12〜16時間後に新鮮な血で新しいペトリ皿を準備し、37°Cのドライバスに入れてからチャンバーを設置します。
  3. 新鮮な血液が温まる間に、使用済み血液からチャンバーを取り出し、膜の裏側を蒸留水で3〜5秒洗い流し、その後0.005%ナイスタチン溶液で3〜5秒洗い流して真菌汚染を防ぎます。残留したナイスタチンを取り除くために蒸留水で再度膜をすすぎます。
    注意:このプロセスは5分未満で終わり、膜に付着したダニの上表面の摂食には影響しません。
  4. 使用済みの血液とすすい水はすべて、0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液(10%漂白剤)入った容器に捨ててください。血液廃棄物は施設の安全プロトコルに従って廃棄されます。
  5. すすいで後、血液と一緒に新しいペトリ皿にチャンバーを入れます。
    注意:汚染や漏れがなければ、洗浄前に最大2〜3ヶ月間チャンバーを使用してください。チャンバーや膜は汚れ、3ヶ月以上洗浄なしで使用すると汚染のリスクがあります。これによりダニの摂食率が低下します。チャンバーは最大1.5年間(~10回の洗浄サイクル)再利用してください。
  6. チャンバーは0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液(漂白剤10%)に最大30分間浸し、その後食器用洗剤で洗います。チャンバーを長時間(>30分)漂白剤にさらさないでください。臭いは付着率を下げ、樹脂の強度を時間とともに弱める可能性があります。
    注意:長時間漂白剤に曝露すると、濡れた状態ではチャンバーが柔軟になり、乾燥すると脆くなり、破損の原因となります。これにより、繰り返しの観察によりチャンバーは4〜5回の洗浄サイクルを超えません。同じチャンバーを洗わずに連続使用(最大3ヶ月)すると、最近洗浄したチャンバー(通常は>7日)に比べてマダニの付着が速くなります(チャンバーに入れてから1〜3日)。これは、マダニがチャンバーで摂食する際の排泄物やその他のフェロモンの集まり臭いが、マダニの摂食を刺激するためと考えられます。

結果

ダニ種ごとの膜の厚さ。
成虫ダニ種ごとに以下の膜厚仕様で最高のマダニの摂食率が観察されました: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; リピセファルス・サングイヌス 70–100 μm;肩 胛骨(Ixodes scapularis )<150 μm)、 Dermacentor variabilis <150 μm。すべてのダニ種は、摂食時の湿度と温度(湿度63%、温度37°C)で維持されました(表1)。

このプロトコルで使用されるダニと血液源
すべてのダニはオクラホマ州立大学のマダニ飼育施設から採取され、相対湿度>90%、20°C、12時間の明暗太陽周期で管理されました。すべてのダニは、さまざまなダニ種のα-gal(αGal)レベルを調査する研究プロジェクトの一環として、除細血管処理された牛または人間の血液から餌を与えられました。本研究は、研究グループが実施したアルファ-ガル症候群(AGS)のより広範なプロジェクトの中で、異なる血液源への摂食の影響を比較しました。ここで記述するほとんどのダニ標本は、完全膨張前に解剖され、部分的に摂食されたダニ(摂食後2〜5日)でαGal定量解析が行われました。アン ブリオマ・アメリカナム のダニのうち、αGal定量に必要とされない部分だけが補充を許可されました。ここでは牛に餌をあげたダニと人間に餌を与えたダニの摂食率の詳細な比較は示されていませんが、牛の血液を餌にしたダニの方が完全な出血(すなわち摂食成功率)をより多く達成したことは注目に値します。長期間フィーダーに留められたダニ(n=35)のうち、15匹が完全に腫れ、摂食成功率は42.8%に達しました。そのうち9頭は牛の血、6頭は人間の血で育てられました(60%が牛餌、40%が人間飼料)。

ダニの給餌率と成功率の比較
本研究におけるダニの摂食率は、部分的に餌を与えられたダニの獲得(2〜5日間の摂食)に基づいて決定され、摂食成功率は完全な乳房膨張と定義され、通常はメスのアロスクトゥム色の変化で示されました(データは Amblyomma americanumのみで利用可能)。オスの摂食率は2日以上連続摂食(2〜5日)と定義されました。全体的な給餌率は、牛および人間の血液から餌を与えられたダニのデータと、チャンバーに入れられたダニから2〜5日間の摂食または完全出血を達成する割合を算出して算出されました。<2日間の付着後、または付着してから死亡したダニは、給餌速度の計算の対象として考慮されました。血液源がダニの摂食率に与える影響に関する定量的データは示されていませんが、この観察証拠はほとんどのダニ種において、2〜5日間の給餌期間中に牛と人間の血液で付着率や摂食率に大きな差はないことを示唆しています。例外として、 Rhipicephalus sanguineusは3日目から5日目の間に牛の血液よりも人間の血液を摂食する速度が低いことが観察されました。この in vitro マダニ給餌システムで部分的に摂食し、完全に腫れ出したすべてのダニ種の摂食率は 表1にまとめられています。

Amblyomma americanum メスの体重と摂食段階の分類
部分的に餌を与えられた雌の A. americanum は、摂食日数に分けて以下の通りに分類されました:(1) 無給餌、(2) 2–3日部分給餌、(3) 4–5日 部分給餌、(4) 腫れている(図5)。充血期には、急速勃起期のマダニ(体重48.9mgから109mg)と完全に腫れたマダニ(体重272.7mgから348.7mg)が含まれます。

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図1:ダニの給餌室 - 3Dモデルおよび膜付きプリントアセンブリ。爆発した3Dモデルおよび最終組み立てチャンバーには、(i)チャンバー本体(ティックハウジング)、(ii)蓋ホルダーリング、(iii)高さ調整リング、(iv)40 mm x 10 mmのペトリ皿蓋、(v)血を塗った40 mm x 10 mmのペトリ皿底(A)が展示されています。3Dプリントモデルの組み立てと個々の部品サイズ(mm(B)で示されています。組み立て済みチャンバーはグレーの8K分解能樹脂(C)で印刷されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:シリコーン膜およびチャンバーアセンブリの準備。(i) 30cm×30cmのラップをテープで固定し、目に見えるしわがないか確認する、(ii)ラップの上に約5cm間隔で置くレンズクリーニング用紙の個別シート、(iii)円を描く動きでヘラでシリコーン成分を優しく混ぜる、(iv)各レンズ用紙の端に沿って1〜2gのシリコーン混合物を塗布して固定する、 (v) シリコン混合物をレンズ紙に均等に広げ、紙より大きな直線の器具(画像はガラス蓋の端を示しています)、(vi) 広げる際にシリコーン混合物の量が減少したため、ツールに残ったシリコーンを戻し再分配し、均一な被覆を確保する(A)。適切に広げた膜では気泡や隙間は見られませんでした(B)。接着剤塗布のための注射器の準備:(i) シリコーン接着剤を充填した1 mLの注射器、(ii) 注射器の先端に取り付けた200 μLのピペットチップ、(iii) 漏れ防止シールを確保するためにピペットの先端をネジ止めし、(iv)部品i(C)の裏縁に接着剤を塗ること。乾燥膜(D)に置かれたチャンバーと、その上に重り付きの物体(2.5kgの厚いアクリルブロック、マゼンタ色の矢印)を置いてしっかりと接着を確実にします(E)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:使用前のチャンバーおよび膜の最終準備工程。チャンバー周囲の膜の縁を曲がった小さなハサミ(A)、チャンバー使用前にラップを外す(B)、最終モデルの組み立て(C)、水を含む40 mm x 10 cmのペトリ皿へのチャンバー設置、チャンバー蓋としてペトリ皿のリッドを使用すること(D)(数字i-vは 図1Aに指定された部品を示します)。 そして呼吸穴(マゼンタ色の矢じりで示される)を示すチャンバー蓋(E)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:授血準備とダニの配置。薬室は血の入った皿に置かれ、高さ調整リングは強調表示されます(マゼンタ色の矢印)(A)。オスとメスのダニが同数収容されているチャンバーハウスの内部図(B)。ダニ室は湿度源のあるドライバスに設置され、相対湿度(RH)±63%±温度37°C1°Cを維持します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5: アンブリョンマ・アメリカナム の摂食時のサイズと体重の変化。餌を与えていないダニの大きさと部分的に餌を与えたダニの平均体重が示されています。これらの画像は、各給餌間隔で記録された平均重量に対応する典型的な例を示しています。付随する表は、各給餌時間点の平均重み、標準偏差、分析されたティック数、中央値、四分位数1および4分位3を示しています。2〜3日間餌を与えたダニの体重は、最低7.4mgから最大19.2mgの範囲を示しました。4〜5日間の給餌量は20.6mgから44.8mgの範囲でした。急速な乳房膨張期の開始時および完全に腫れたダニの体重は48.9mgから348.7mgの間でした。 4〜 5日間、メス(黄色い矢じり)と完全に膨らんだメス(マゼンタの矢じり)の添付画像。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ダニの種と性別フィードされたティック数/チャンバーに置かれたティックの総数(死んだティックの数)給餌速度(ダニは2〜5日付着)平均体重(mg)(標準標準偏差)使用される膜厚(μm)
アメリカン メス85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
アメリカンナム オス19/22 (2)86.30%記録されていません100 - 200
A. maculatum メス45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
A. maculatum オス36/47 (11)76.60%記録されていません記録されていません
R. sanguineus メス34/60 (26)56.60%記録されていません70 - 100
I. scapularis メス15/23 (8)65.20%記録されていません<150
*牛に与えられた成虫Aaダニの摂食成功率(n=35)は42.8%でした

表1:ダニの給餌速度と平均体重。

補足図1:すでに3Dチャンバーの部位に付着している個々のダニの低容量(100μL)給餌。人工膜の底部にシリコーン接着剤で取り付けられた小さなPCRチューブに100μLの血液が詰められます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ダニの人工膜給餌システムはダニ研究に非常に効果的なツールであり、多くの研究室で生きた動物の餌食の代替として広く利用されています28,29。これらのシステムの主な価値は、病原体、殺虫剤、ダニ由来化合物、その他の調節分子を含む様々な因子を血液ミールを通じて届けたり回収したりする能力にあります(22,23,25,27)。人工膜給餌システムの最適化は、持続可能なダニコロニーの育成を促進し、生きた動物への依存を減らす可能性があります。

このプロトコルで示された体外マダニの給餌システムは、成虫のAmblyomma americanumおよびIxodes scapularisで特に成功しています。ダニの摂食成功率は、満腹に摂食を完了したダニの割合(または割合)として定義されます。しかし、部分的に餌を与えたダニ(通常は摂食開始後3〜4日)であれば、ほとんどのダニの生物学や生理学を研究する研究所では、特定の実験仮説を解消するのに十分な場合が多いです。この人工膜給餌システムプロトコルおよびα-Gal(αGal)プロジェクトの特定の研究目的に対応するため、「ダニの摂食速度」は部分的に餌を与えられたダニの獲得(2〜5日間の摂食)を指し、「ダニの摂食成功」はA. americanumの完全な腫れを指す用語として使われました。最も高い摂食率はA. americanumのメス(87.6%)で、次いでA. americanumオス(86.3%)、A. maculatum メス(68.2%)、A. maculatum オス(76.6%)、I. scapularis メス(65.2%)、R. sanguineus メス(56.6%)、A. americanum の摂食成功率は42.8%でした(表1)。部分的に餌を与えられた雌のA. americanumは、摂食日数に基づいて4つのカテゴリー(摂食段階)に分類され、以前の文献から修正された21:(1) 無給餌、(2) 2–3日間の部分給餌、(3) 4–5日間の部分給餌、(4) 腫れている(図5)。充血期には、急速腫れ期の開始時のダニ(体重48.9 mgから109 mg)と完全に腫れたマダニ(体重272.7 mgから348.7 mg)が含まれます(図5)。この人工膜マダニ給餌システムは、同じ研究グループや共同研究者内で、牛の血液から部分的に餌を与えられたマダニを生成することを可能にし、その後ネズミの寄生や、ダニ咬傷誘発性赤身肉アレルギーであるアルファガル症候群(AGS)の伝播仮説の検証に利用されました。また、N-糖コミクス研究では11,21、37歳。個別の設置の利便性により、異なる血液源を使用でき、透明な蓋と最小の高さのチャンバーにより、十分な作業距離を保った立体顕微鏡下で給餌期間中のダニの可視化が容易になりました。

湿度(水浴90%から乾浴63%±2%RH)、温度(37°Cから35°C、そして再び37°Cに戻る)、膜の厚さ(表1)の最近の変化により、複数のダニ種の摂食が成功しました。体外マダニの摂食において温度と相対湿度(RH)は重要な変数ですが、膜の厚さと強度は異なるダニ種間での成功する摂食を保証する重要な要素です(33,38)。短い口器を持つダニ(Rhipicephalus sanguineusやDermacentor variabilis)は、長い口器を持つAmblyomma sppやIxodes sppよりも薄い膜を必要とすることを考慮する必要があります。最も高いマダニの摂食率は、膜厚100〜200μmのAmblyomma americanumとA. maculatumで、厚さ70〜100μmのRhipicephalus sanguineus;Ixodes scapularisは厚さ<150μm)、Dermacentor variabilisは<150μm(表1)で見られます。人工膜ダニの給餌において注目すべき重要な要素は、給餌速度の変動が依然として起こることです。このシステムでは、温度がわずかに変化するだけで、例えば37°Cから35°C、そして数日後に37°Cに戻ることで、ダニの摂食速度が増加または回復することが多いです。さらに、乾浴から水浴に切り替えても、Amblyomma属やIxodes scapularisで同様の結果が得られるが、この効果はRhipicephalus sanguineusでは観察されず、乾浴で63%±2%のRHでより効果的に摂食している。

Ueti, M.ら(USDA-ARS)が開発した5部連続流システムから応用され、その後Yamasaki, Y.らによって追加種向けに改良された他の人工マダニ給餌システムは、高い効率を示し、一貫して高いダニの給餌成功率を達成しています27,40.しかし、部分的に餌を与えられたダニの解剖のために頻繁にシステムにアクセスする必要がある研究では、ダニ収容室の繰り返しの開閉が面倒で、これらのセットアップはあまり適していません。このプロトコルで説明されている3Dプリントチャンバーは、磁気式の確実な蓋と個別のペトリ皿を備えており、セットアップを妨げることなくダニの給餌を容易に取り扱い、目視検査が可能です。透明な蓋は視覚的に監視を妨げずに行え、埋め込まれた磁石を介してチャンバーにしっかりと固定されます。これは、KröberとGuerin22,29の設計で最適化された一般的なマダニ給餌システムとは異なります。これらのシステムでは、すべての給餌ユニットが一体化されているため、血液から給餌室を外さず個別の可視化が不可能であり、ダニの逃走を防ぐ方法が用いられています視覚化を許可しないでください。さらに、このin vitroマダニ給餌システムはさらに改良され、より小さく部位特異的な血液を供給することができます。例えば、メスのダニが定められた摂食部位に付着すると、底部のペトリ皿は、付着部の真下に100μL未満の血液を含む100μLのPCRチューブの上部など、小型のリザーバーに置き換えることができます(補足図1)。この低量摂食アプローチにより、病原体の獲得と伝播に関する詳細な研究、さらにダニ毒性物質や宿主由来抗体の影響の調査が可能になります。このプロトコルは、さまざまな成虫ダニ種から部分的に餌を与えたダニを入手するのに成功することが証明されています。本研究の目的上、産卵率および完全腫れ率は評価されていません。しかし、初期観察に基づきAmblyomma americanumとIxodes scapularisで達成可能なダニの子孫を得ることを目的としたさらなる最適化が進められています。このシステムの最も革新的な特徴は、小規模な実験操作に柔軟に対応し、処理や環境条件の制御された変化を可能にしつつ、コロニー育成の応用も支援できることです。

体外 でのダニ給餌は、ダニの生物学、生理学、ベクター能力を研究する研究者にとって貴重なツールです。しかし、人工膜ダニの給餌は時間と労力のかかる作業です。このプロトコルは、3Dプリントされたチャンバーとシュアロックシステム、そして簡単な実験室製膜を特徴とし、チャンバーのプリントと膜の準備後は簡単なセットアップを提供し、長期使用を可能にします。さらに、膜の厚さを調整することで、異なるダニ種に効果的に適応させることができます。さらに、チャンバーサイズや膜厚などの最適化により、さまざまなダニの寿命段階での応用が可能になります。

開示事項

著者らは本論文で述べた研究に関連する実質的な金銭的利益を一切表明していません。

謝辞

著者らは、ダニの給餌やマダニのチャンバーおよび膜の設置を支援した学部生兼作業者のカラ・ゴールデン、シドニー・イングハム、オマイマ・ジャドゥー・ナジマの勤勉な働きに感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1mL ルアーロク注射器BD309628ルアーロク・ティップ
Advanced Clear Silicone ゼネラル・エレクトリック2810435透明なシリコンコーキング。このコーキングは硬化後に水浸透性のバリアを形成します。
クリアエポキシ接着剤JBウェルドクリア‎B009EU5ZM0Amazon製品番号
透明なフードラップ(ラップシール)よかったCLO00020
除細血管の牛の血液止血抑制器研究所DBB100
除細血管ヒト血液生物IVT
使い捨てヘラレヴゴ社17211Amazon製品番号
ドライバスインキュベーターONiLABサイエンティフィックHB120-SAmazonの商品番号。加熱ブロックは逆さまにして平らな面を作ります。
ゲンタミシン硫酸塩ミリポール・シグマG3632-5G
レンズクリーニング用紙ティフェンEK1546027T
マイクロピペットチップ、200 & μ;L Biotix uTIP63300057注射器用に。シリコーンコーキングアプリケーター
ニトリル手袋インスパイアコバルトOGAmazon製品番号
ナイスタチンフィッシャー・バイオリエージェントBP2949-5
ペトリ皿 35 mm x 10 mmファルコン351008
フローゼン ソニック MEGA 8K V2 レジンプリンターフローズンB0F9NBXVVTビルドボリュームは320 x 175 x 300 mmです。社内印刷を希望する場合はAmazonで購入可能です
プロ8Kフォトポリマー レジンアクアグレーフローズンアリゾナ大学を通じて収縮が少ない。高品質&8K解像度の非常に精巧な3Dモデルです。
丸形磁石 3mm x 2mmミェロスB08NZTN426Amazon製品番号
RPGフォトポリマー レジン スモークホワイトフローズンアリゾナ大学を通じて高品質&非常に精巧な3Dモデル。素晴らしいフレックスと印象的な曲がり。
シリコーンオイルミリポール・シグマ378321-250ml
Tinkercad 無料3Dソフトウェア設計ティンカーキャッド該当なしhttps://www.tinkercad.com
ボートの計量(容量100 mL)プラ・ポンタMDO-AZOC-1030

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