バルクRNAセクシークシーデータに基づくトランスクリプトミクス解析

Summary

本プロトコルは、生データから機能的濃縮解析までのバルクRNA-seqプロセスの解析のための完全なパイプラインを確立します。

Abstract

非アルコール性脂肪肝(NAFL)は通常良性の病気と考えられています。しかし、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進行すると、患者は末期肝疾患を発症するリスクが大幅に高まります。多くの研究がNAFLからNASHへの移行の分子メカニズムを解明しようとしています。高スループットシーケンシング技術(バルクRNA-seqなど)は、トランスクリプトームを調べることで、分子の発現、シグナル伝達経路の活性化、疾患進行に関連するその他の要因を明らかにすることで、研究者により深い理解をもたらしました。研究者が病気治療の潜在的な標的を特定するために分析できる豊富なオープンソースデータがあります。しかし、トランスクリプトームの上流解析のための効率的かつ信頼性の高いプロセスが不足しているため、関連研究は制約を受けています。ここでは、再現性が高くユーザーフレンドリーな上流解析と関連する差異遺伝子解析パイプラインを提供し、プライベートまたは公開データの標準化された処理と詳細な解析を実現します。パイプラインは4つのステップに分かれています:(1) データの品質管理;(2) 遺伝子マッピング;(3) 差異遺伝子解析;および(4)関数解析。このプロセスは、疾患変換の分子メカニズムを明らかにし、Bulk RNA-seqデータの解析を通じて潜在的な薬物標的や治療アプローチのスクリーニングを支援することを目的としています。

Introduction

非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、世界的に最も多く見られる慢性肝疾患であり、人口の4分の1以上に影響を及ぼしています。近年、その発生率は劇的に増加しています。^1,2,3。増加する病気の負担、特にそのより進行した形態である非アルコール性脂肪肝炎(NASH)は、世界的な健康上の大きな課題であり、重い経済的負担となっています^。NAFLDの第一段階は非アルコール性脂肪肝(NAFL)で、炎症や線維化を伴い、NASHへと進行することがあります。後者は肝硬変や肝細胞癌(^HCC)を含む末期肝疾患への進行リスクを大幅に高めます^5,6,7。HCCの発症率と死亡率は^{NASHの増加}と関連しており^、2030年までに肝移植の主要な適応となると予想^{されています。}しかし、NAFLDの臨床進行は非常に異質

Protocol

デモンストレーション目的で、Lan Baiらが生成した公開データセットPRJNA1023502を用いて、上流および下流解析の各ステップを示すために用いられ^ました。このデータセットはオープンアクセスのNCBI SRAデータベースから提供されるため、追加の権限や倫理的承認は必要ありません。必要なソフトウェアおよびRパッケージのバージョンをすべて確認するには 、材料表 を参照してください。公開されているデータセットPRJNA1023502、6つの非NASH、6つのNAFL、6つのNASH肝RNA-seqサンプルで構成されています。このプロトコルでは、SRAデータベースからのデータ取得、品質管理(fastp)、アラインメント(HISAT2)、定量化(featureCounts)、下流の差分発現および機能豊か解析を含むバルクRNA-seqワークフローのすべてのステップを実証しました。

1. SRAツールキットのインストール

1. SRAツールキットの公式ウェブサイトを訪れ、バージョン3.2.1をダウンロードしてください。

2. 公開データのダウンロード

1. SRA番....

Results

バルクRNA-seqの上流解析ワークフローは 図1Aに示されています。このワークフローはLinuxプラットフォーム上で以下の重要なステップを順次実行します。まず、fastpを使って生のシーケンスデータの厳格な品質管理を行い、低品質のリードやアダプターシーケンスを除去します。その後、HISAT2は高品質なリードをリファレンスゲノムにアラインメントし、Samtoolsがアラインメントファイルを変換・ソートします。最後に、FeatureCountsは遺伝子レベルの定量化を行い、遺伝子発現マトリックスを生成するため、後続解析のための高品質な入力を提供します。その後の処理と統計解析はR環境内で行われ、関連するワークフローと必要なソフトウェアパッケージは 図1Bに示されています。分析のために発表された研究から選ばれ、非NASH6件、NAFL6件、NASH^{サンプル6} 件(図1C)から構成されています(

Discussion

バルクRNA-seqデータ解析は、ゲノミクス、バイオインフォマティクス、統計学、コンピュータサイエンスを統合した学際的な課題として特徴づけられます。完全な分析ワークフローは、生データの前処理、品質管理、配列アラインメント、遺伝子レベルの定量化、データ正規化、差異発現解析、生物学的解釈など、複数の上流および下流のステップを含みます。これらのステップの中で、生のシーケンシングリードを高品質な遺伝子発現マトリックスに正確に変換することは特に重要であり、上流処理中に導入された誤りが下流の生物学的結論に影響しやすいためです。したがって、トランスクリプトミック研究の再現性向上には、透明かつ標準化された上流解析ワークフローの確立が不可欠です。

このプロトコルは、fastp(読み取りトリミングや品質管理用)、HISAT2(スプライス認識アラインメント用)、featureCounts(遺伝子レベルの定量化用)など広く使われているツールを統合した、効率的で完全なスクリプトベースのワークフローを提供します。これらのツールは、Tuxedo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
バイオマルト	バイオコンダクター	2.64.0	Ensemblによる遺伝子注釈
clusterProfiler	バイオコンダクター	4.16.0	機能豊化解析
DESeq2	バイオコンダクター	1.48.1	微分表現解析
ファクトマインR	アグロパリテック	2.11.0	PCAおよび多変量解析
ファストプ	オープンジーン	1.0.1	FASTQデータの品質管理とフィルタリング
フィーチャカウント	ウォルター&エリザ・ホール医療研究所バイオインフォマティクス部門	2.0.0	遺伝子発現定量のために各遺伝子にマッピングされたリード数を数えます
ggplot2	ポジット	3.5.2	データ可視化
グレッペル	カミル・スワヴィコフスキ	0.9.6	重複しないテキストラベル
グリッジズ	クラウス・O・ウィルケ	0.5.6	尾根線の区画を作成
HISAT2	ジョンズ・ホプキンス大学	2.2.1	フィルタリング済みの高品質リードを参照ゲノムにアラインメントします
R	Rコアチーム	4.5.0	データ計算、分析、可視化のための環境
RColorBrewer	エーリッヒ・ノイヴィルト	1.1.3	プロット用のカラーパレット
サムツールズ	大規模ゲノミクスの作業分野	1.22.0	効率的な取得とアクセスのためにSAMファイルの変換と処理
SRAツールキット	国立バイオテクノロジー情報センター	3.2.1	NCBI SRAデータベースから生のシーケンスデータを取得・前処理