変形性関節症の前臨床研究のための標準化された不安定性誘発動物モデル

サマリー

このプロトコルは、変形性関節症の研究に適した動物モデルを確立することを目的としています。

要約

世界で最も多い関節疾患である膝変形性関節症(OA)は、世界的な健康に大きな負担をもたらしており、その発症メカニズムと治療戦略に関する広範な研究が行われています。多くの研究にもかかわらず、モデル確立のための標準化された方法論は依然として不足しています。このギャップを埋めるために、マウスの内側半月板不安定化(DMM)モデルとラットの内側半月板裂裂(MMT)モデルを用いる不安定性誘発動物モデルの開発に関する包括的かつ再現可能なプロトコルを提示します。さらに、術後の痛み閾値と空間的歩様安定性を評価する簡単かつ容易に実施可能な手順を記述し、前臨床OA研究における方法論的一貫性を促進することを目的としています。組織学的および行動的検証により、両モデルの成功が確認され、変形性関節症研究学会国際(OARSI)のスコアが著しく上昇し、歩幅が有意に変化し、機械的痛み閾値が対照群と比較して大幅に減少し、関節変性と過敏症が顕著であることを示しました。これらの検証結果は、両モデルの再現性と翻訳的関連性を強調しています。したがって、詳細なビデオドキュメントを提供することで、手続きの標準化を促進し、研究室間の一貫性を促進し、OA研究成果の信頼性と比較可能性を高めます。

概要

変形性関節症(OA)は非常に有病率の高い変性関節疾患であり、世界的な障害の主な原因の一つです^1,2。広範な研究にもかかわらず、効果的な疾患修飾OA薬剤(DMOADs)の開発は比較的遅いもの^{となっています。}現在では、OAは関節軟骨、軟骨下骨、腱、滑膜^4,5を含む複数の関節周囲組織にまたがる複雑な病理学的変化を伴う多因子性疾患であることが広く認識されています。OAの多様な病理過程に関する効果的な前臨床研究には、明確に定義され適切な動物モデルの使用が必要です。さまざまなOA動物モデルが確立され、6,7,8,9,10,11が報告されていますが、多くの研究は依然として不適切な動物モデルを用いており、その結果の翻訳的関連性が制限されています。この問題に対処するため、内側半月板(DMM)および内側半月板損傷(MMT)の再現可能な不安定化手順を含む標準化された不安定性誘発OAモデルをビデオ形式で提示し、前臨床OA研究およびモデル標準化の実用的な参考資料として活用しています。

過去の研究で報告されているように、半月板の不安定性は臨床症例における膝関節変性の主な要因です。したがって、マウスやラットにおける外科的誘発半月板不安定性は、OAの実験的誘導に効果的なアプローチとなります。この文脈で、マウスのDMMモデルとラットのMMTモデルという2つの代表的な不安定性誘発OAモデルを提示します。マウスにおけるDMMモデルは、OAの分子メカニズムの調査に特に有用であり、マウスは遺伝子組み換えに適しており、ヒトOAに非常に似た徐々かつ長期的な疾患進行を示します。しかし、DMMモデルは軟骨下骨の病理学的変化に焦点を当てた研究にはあまり適していません。これらの研究では、代替モデルの方が翻訳的関連性が高い場合もあります。

さらに、マウスのDMMモデルを補完するためにラットでMMTモデルを確立しました。MMT手技は、関節軟骨および軟骨下骨の両方に関わるより広範な構造的損傷を誘発し、臨床現場で観察されるOAの進行した病理的特徴をよりよく反映します。これにより、ラットMMTモデルはバイオエンジニアリングやトランスレーショナル研究、特に生体材料、再生治療、関節修復を標的とした薬物送達システムの評価に適しています。MMTおよびDMMの手術技術は過去の研究で説明されていますが、標準化、再現性、技術的な精度を研究室間で確保する包括的で段階的な視覚プロトコルは依然として不足しています。このギャップを埋めるために、動物の準備から術後ケアに至るモデル確立の重要な各ステップを詳細に示したビデオベースのデモンストレーションを作成しました。さらに、痛み閾値の評価と空間的歩様安定性の分析に用いられる2つの行動評価手法を導入し、OA誘導後の機能評価の一貫した枠組みを提供します。したがって、外科的プロトコルと行動プロトコルを統合することで、本稿は前臨床OA研究における方法論的標準化を促進し、研究間でのデータの比較可能性とトランスレーショナル関連性の向上を目指しています。

プロトコル

すべての実験手順は浙江中国医科大学動物倫理福祉委員会の指針に従って実施され、プロトコル番号IACUC-20251020-11のもとで承認されました。DMM手術では、10〜12週齢の雄C57BL/6マウスを用い、MMT手術には体重200〜225gのオスSprague-Dawleyラットが選ばれました。すべての動物は特定の病原体フリー(SPF)条件下で飼育され、実験前に1週間の順応期間が設けられました。動物福祉と実験の一貫性を確保するため、食料、水、寝床は週に少なくとも2回は交換され、標準的な飼育環境が維持されました。

1. 動物の調理

1. 手術前に適切な鎮痛剤(例:ブプレノルフィン)を機関のガイドラインに従って投与してください。動物を吸入麻酔(例:2%イソフルランを0.4L/minで、4L/minの新鮮ガス流を誘導チャンバーで投与)で麻酔し、鼻錐を使って手術中ずっと麻酔を維持します。ペダルの離脱反射がないことを確認することで、麻酔の深さを確認してください。
2. 下まぶたの結膜に2〜3mmの潤滑眼軟膏を塗り、優しくまぶたをマッサージして軟膏が眼表面に均等に広がるようにします。
3. 右膝関節の周囲の毛を剃り、手術部位をポビドンヨードと70%エタノールによる3段階の洗浄で消毒します。動物を無菌手術台に置いてください。

2. マウスにおけるDMM手術

注意:この手技は、 通常内側半月板を脛骨高原に固定する内側半月板靭帯(MMTL)を横断することで関節の不安定化を誘発します。

1. 麻酔を受けたマウスを仰向けに位置させ、右膝の上に約3〜5mmの小さな内側膝蓋側皮膚切開を行います。
2. 上に覆われている軟組織を慎重に切り離し、関節包を露出させます。膝蓋腱の内側に切開を入れ、膝関節を優しく外側に移動させて膝関節を視覚化します。MMTLが内側半月板の前角から脛骨高原をつなぐ細い靭帯として現れることを確認しましょう。立体顕微鏡を使って可視化を強化し、関節軟骨損傷のリスクを最小限に抑えましょう。
3. マイクロハサミ、#11メス刃、または曲げた注射器針を使って、MMTLの脛骨付着部を慎重に切断してください。曲げた注射器を使うと、鈍い刃が下の関節軟骨を保護するのに役立ちます。内側半月板の不安定化を観察して切断の成功を確認しましょう。
4. 切開された関節カプセルを8-0で閉じます吸収性縫合を施し、その後、皮膚切開部を創傷クリップまたは6-0縫合で閉じます。
   注意:縫合中に関節軟骨を刺したり損傷したりしないように注意し、切開を閉じる際には関節の張りを適切に保つようにしてください。
5. 動物が温熱パッドで回復するまで、完全に動きが戻るまで注意深く観察してください。

3. ラットにおけるMMT手術

注:この手術は内側側副靭帯(MCL)の切断後に内側半月板の完全な断裂を生じさせ、関節不安定性と進行性軟骨変性を引き起こすため、OAを誘発します。

1. 麻酔を受けたラットを適切に位置させ、右膝の上に約6〜8mmの内側膝蓋側切開を行います。
2. 鈍的解離を行い、筋肉層を分離し、MCLを明確に露出させます(図2)。
3. 外科用ハサミを使って、MCLの中央点を完全に横断します。
4. 切断した内側(MCL)を優しく引き戻し、下部の内側半月板を露出させます。細い鉗子を使い、半月板を掴み、最も狭い部分で全層切断を行い、完全な裂け目を作ります。
5. 軟部組織の位置を変え、切開部を層ごとに閉じます。筋肉と筋膜には5-0吸収性縫合糸を使用し、その後、皮膚の閉鎖には創傷クリップや5-0吸収性縫合糸を用います。
6. ステップ2.5で説明した手順に従い、動物が回復するのを待ちます。

4. 行動評価

1. 手術前にベースライン評価を行い、術後指定時点(例:2週、4週、8週)に再評価を行います。
   注:オペレーター間の変動を最小限に抑えるため、行動テストは実験グループ分けを盲目にした同じ訓練を受けたオペレーターによって実施されました。各測定は動物ごとに3回繰り返し行われ、平均値を分析に用いました。
   1. 簡易機械的引き出し閾値試験
      1. マウスを高くしたワイヤーメッシュのプラットフォームの個別の区画に入れ、テスト前に少なくとも30分間は慣らしさせてください。その後、電子フォン・フレイ麻酔計を用いて機械的な痛み感受性を評価します。
      2. フォン・フライのフィラメントを使って、プローブをマウスの右後ろ足の足底面に当て、力を徐々に¹²に増やします。
      3. 反応を記録し、ポジティブな反応は突然の足の引っ込めや身をすくめる、舐める動作で示されることを覚えます。一貫した反応の有無を評価し、時間経過による感度の変化を評価します。
   2. 歩行分析
      1. 自動歩行分析システムを活用して評価しましょう。
      2. 動物が自発的に装置のガラス通路を渡ることを許可します。有効な試行とは、動物が止まることなく一定のペースで動く試行と定義します。システムソフトウェアが足跡を自動的に識別し、複数の歩様パラメータを計算するのを待ちます。右(手術)後肢の主要指標(スタンスフェーズの持続時間、振る速度、足の圧力など)を分析し、対側の後肢や偽操作の対照群と比較してください。
         注:すべての動物は、ベースライン評価前に毎日のトレーニングセッションを通じて検査装置に慣れさせました。各動物に対して、各時間点に3回の走行が記録され、動物が一時停止せずに一定の速度を維持した試行のみが有効とみなされました。すべての測定は訓練を受けたオペレーターによって二重盲検設計で実施され、オペレーター間の変動を最小限に抑え、データの再現性を確保するために繰り返しの実行を平均化しました。

結果

DMM OAマウスモデルの特徴付けと検証
1週間の順応期間を経て、図1に示された手順に従い、マウスにおけるDMM誘発性変形性関節症(OA)モデルが確立されました。病理学的および行動評価は手術後2週間に実施されました。図2Aに示すように、最も顕著な変性変化は内側大腿脛骨関節に局在していました。軟骨変性の程度はOARSIスコアリングシステム^13,14を用いてさらに定量化され、DMMモデル群のスコアは対照群に比べて有意に高いことが示されました(図2B)。すべてのOARSIスコアリングは、実験群を盲検化された病理医によって実施されました。各動物ごとに内側区画の冠状切片を採取し、3分ごとに分析しました。最も得点が高い部分が膝関節の総合得点として使われました。OARSIスコアはシャピロ・ウィルク検定で検証された正規分...

ディスカッション

このプロトコルは、広く使われている2つの外科的OAモデルの誘導および評価のための標準化された枠組みを提供します。これらのモデルは、人間の心的外傷後OAの病態生理学的特徴を密接に再現するため、強い翻訳的関連性を持つため、特に価値があります。DMMモデルは内側半月板靭帯の切断を含みますが、MMTモデルは内側半月板の直接断裂を伴います。当研究室では、マウスでは内側半月板の正確な識別が難しく、完全な半月板裂傷は過度な軟骨損傷を引き起こす可能性があるため、マウスでDMM手術が日常的に行われています。さらに、DMMモデルでは軟骨下の損傷がMMTモデルに比べてかなり軽度であることが観察されています。これは、DMMモデルが軟骨変性や機構経路の研究には理想的である一方で、骨関節症研究における軟骨下骨の再構築の研究にはあまり適していないことを示唆しています。

DMMおよびMMT両手技における成功の重要な要因は、関節軟骨に医原性損傷を誘発しない標的靭帯(DMMモデルのMMTL)とMMTモデルのMCLの正確な切断です。このような意図しない...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
歩行解析システム	上海新潤情報技術有限公司	XR-FP202
リポジック			眼科軟膏
ネズミ	南京モデル動物研究所	C57/BL6
痛み検査システム	上海新潤情報技術有限公司	XR-XZD	電子フォン・フレイ麻酔計
ラット	南京モデル動物研究所	S/D