ピーリング、クリアリング、AI画像解析を用いた気孔および表皮の特徴の特徴づけ

サマリー

本プロトコルは、表皮ピーリング、クリアリング技術、AI支援画像解析を用いて、2つの異なる種の気孔および表皮形質を比較評価する方法を提示します。この目的は、農業応用および広範な植物研究において、気孔機能の基盤となる細胞構造を高スループットかつ再現性のある定量化を可能にすることです。

要約

気孔の形態や周囲の表皮形質の正確な特徴づけは、気孔機能を理解する上で不可欠です。比較プロトコルとして、表皮ピーリングと葉片除去という2つの補完的な技術を用いて、生態学的に異なる2種の双子葉植物である Fraxinus excelsior と Taraxacum officinaleの気孔細胞と表皮細胞の大きさ、形状、密度を評価します。このプロトコルには、サンプル準備、画像診断、形質定量のための詳細な手順が含まれており、コストと労力の両面で効率的な手動測定(組織のクリアリングやピーリング)、そしてAI支援画像解析による高スループットアプリケーションの可能性を秘めています。YOLOv8ベースの気孔検知モデル、細胞分割用のジェネラリスト深層学習ツール、ピクセルベースの分類器の3つのセグメンテーションツールが、手法横断の精度と適合性を評価しました。口孔と表皮の特徴に有意な差が、手作業およびAI解析の両方で一貫して観察されています。AIツールにより再現可能な定量化が可能となり、YOLOv8ベースの気孔検出モデル(StoManager1)が気孔特性で最も優れた性能を発揮し、表皮分節にはジェネラリストのディープラーニングツール(Cellpose)が用いられました。AIに基づく形質検出は T. officinale で非常に一貫していましたが、 F. excelsiorでは限定的であり、結果は手作業測定とは異なり、種特異的な解剖学や画像品質が方法適合性にどのように影響するかを示しています。これらの発見は、AI支援分析が気孔および表皮形質の定量に有用な枠組みを提供する一方で、より広く高スループットの応用に至る前に専門家による検証とパイロットテストが不可欠であることを示唆しています。

概要

気孔は表皮の微細な孔で、植物のガス交換や蒸散を調節する上で重要な役割を果たします。したがって、気孔機能の形態的基盤を理解することは作物の性能向上の鍵となります^。気孔の構造や機能に関する多くの研究は気孔の形態のみに焦点を当てていますが、気孔の応答性を完全に理解するには、周囲の表皮細胞の大きさや形状の特徴付けも必要です。これらの形質の正確な定量化は、ガス交換や作物改良の基盤となる構造と機能の関係を理解する上で不可欠です。

作物改良が高度な遺伝子編集手法にますます依存する中で、光合成、内在的な水利用効率、炭素獲得に影響を与える気孔などの主要な形態特性を理解することが極めて重要です。このニーズは、光合成能力と収量の両方を維持する強靭な作物の需要が増加し、干ばつや熱波の頻発に直面しているため、特に切実な状況^です。したがって、標準化された画像診断および分析プロトコルの強い必要性があります。気孔剥離は、ニスやネイルポリッシュを使った葉面の痕跡を測定する最も簡単な方法です。気孔および表皮のサイズ、形状、密度を測定します ^4,5,6。その手順は迅速で非破壊的であり、サンプルの迅速な処理を可能にします。組織クリアリング法は、静脈ネットワークの同時特性評価と、葉の水理的より包括的な特性評価を可能にする代替手法です。

化学的クリアリングは組織を柔らかくし光学的に透明化し、機械的破壊なく気孔や表皮細胞の現地イメージングを可能にします。クリアリングは乾燥した検体や繊細な標本を含む幅広い組織タイプに広く適用可能であり、気孔画像だけでなく静脈ネットワークの可視化、蛍光イメージング、内部解剖学的構造の可視化にも利用可能です。7,8,9,10,11,12 これにより、気孔形質を他の機能的形質と並べて分析することが可能となります。有機溶媒、水溶液、過水和、またはハイドロゲル埋め込みなど、さまざまなクリアリング法が存在^します。これらは期間、画像適合性、試薬の入手可能性に違います。ここで使われているプロトコルはシンプルでコスト効率が高く、専門的なスキルを必要としません。これらの技術は、化学的固定、埋め込み、試料の切片処理を必要とする光顕微鏡や走査型電子顕微鏡のようなより手間のかかる方法に比べて、安価かつ迅速です。

気孔および表皮の特徴を解析する従来の方法は、顕微鏡画像の手動分割に頼ることが多く、これは労力がかかり時間がかかり、観察者のバイアスの影響を受けやすく、スループットが制限され、解析パイプラインの効率が低下^します。さらに、トリコームや不規則な細胞壁などの解剖学的特徴は、一貫した形質定量にさらなる課題をもたらします。自動画像解析ツールは高スループットのデータ抽出に大きな可能性をもたらしますが、特定の植物組織向けに最適化されており、葉の種類や調製方法を越えて容易に移行できるわけではありません。例えば、StoManager1(補足図1)はYOLOv8ベースの物体検出モデルを用いて気孔検出に高い精度を提供しますが、特に気孔特性向けに訓練されています。Cellpose(補足図2)は、大規模で事前学習済みのジェネラリスト分割モデルであり、入力データが動物細胞や細胞小器官に基づく事前学習モデル(例:cyto、cyto2)に似ている場合に良好な性能を示します。Ilastik(補足図3)は、ユーザー定義の注釈に依存するピクセルベースの分類ツールです。CellposeもIlastikも使いやすいですが、画像品質、背景アーティファクト、組織特有の特徴の変動に対応するために再学習や微調整が必要な場合があります。

さらに、気孔および表皮の形態は種¹⁷間で高いばらつきを示します。気孔の密度や大きさなどの形質は特に変動しますが、通常は逆相関しており、共に気孔動態の種の違いを決定します。気孔が大きい場合は密度の低下を部分的に補うことができますが、一般的に^運動学が遅くなるため、熱波が頻発する際には炭素同化の維持や過剰な水分損失の防止に不可欠な気孔反応が重要になるため不利になることがあります。このばらつきは気孔特性の測定を複雑にし、選択されたプロトコルの妥当性やAIベースの結果の堅牢性を損なう可能性があります。

このプロトコルは、表皮ピーリングと化学クリアリングという従来の2つの準備技術と、形質のセグメンテーションと測定のための最新の人工知能(AI)および機械学習(ML)ツールを統合しています。対照的な生態学的戦略を持つ2種の一般的な光を必要とする双子葉子葉植物(F. excelsior と T. officinale)を用いて、気孔および表皮形質の変動を調べ、3つの手法がどのように比較され、どこで潜在的な誤差が生じるかを評価しました。3つのAIツール、すなわちStoManager1(気孔検出用のYOLOv8ベースの深層学習モデル)、Cellpose(ジェネラリストな深層学習セグメンテーションツール)、ilastik(表皮組織のピクセル分類器)の性能が評価されました。この統合的アプローチにより、気孔および表皮形質の再現性かつ高スループットの定量化が可能となり、生態学的および農業研究における表現型解析のための堅牢かつ拡張可能な枠組みを提供します。しかし、密集したトリコーム、厚いキューティクル、低い細胞境界コントラストなどの解剖学的特徴はセグメンテーションの精度を低下させる可能性があり、ピーリングとクリアリングのどちらかを選択する際には、AIベースの定量化を適用する際に考慮すべきです。

私たちの知る限り、これは表皮剥離と化学的クリアリングの手法を直接比較し、複数のAIベースのセグメンテーションツールを組み合わせて気孔および表皮形質の定量を行う初のステップバイステッププロトコルです。古典的な顕微鏡技術とアクセス可能な機械学習ワークフローを組み合わせることで、このプロトコルはユーザーバイアスを減らし、スループットを向上させ、種を超えた再現可能な表現型を容易にします。これにより、このアプローチは生態学、作物改良、気候変動研究に広く適用可能となり、モデル再訓練や転移学習を通じたツールの継続的な拡張の基盤を提供します。

プロトコル

注: T. officinale および F. excelsior の葉の採取には、これらの非保護種は一般公開の庭園から採取されたため、特定の許可や承認は必要ありませんでした。すべてのサンプルの収集は、機関および地域のガイドラインに準拠していました。

1. 植物材料の収集

1. 比較分析のために健康な葉を選択してください。現在の実験では、気孔分布が対照的な2種の双子葉植物の健康で日光に当たる成熟葉が選ばれました。すなわち、下部葉面にのみ気孔を持つ下気孔の F. excelsior樹木と、両組織性多年生草本植物 T. officinaleです。
2. サンプルの種類や場所ごとに3〜5枚のレプリケートリーフを取ります。
3. きれいなハサミかカミソリの刃で葉を剥がしてください。切り取った葉はすぐに水に入れて脱水を防ぎます。
4. 採取後は葉柄を完全に水に浸し、4°Cで保存します。
5. プロトコルの第2または第3節を48時間以内に進めてください。

2. 気孔圧のピーリングの準備と観察

注:クリアリングプロトコル中に発生したすべての化学廃棄物は、機関および地域の安全規則に従って処理されました。グルターアルデヒドを含む溶液は別々に採取され、有害化学廃棄物として処分されました。水酸化ナトリウム(NaOH)溶液は、許可がある場合に処分前にpH 6-8まで中和されました。希釈した漂白剤とエタノール溶液は、機関や自治体の規制で許可された場所で大量の冷水とともに排水口に捨てられました。 TBO溶液は地域のガイドラインに従い化学廃棄物として回収・処分されました。利用者は、承認された廃棄手順については、施設の安全対策事務所に相談してください。

1. 必要に応じて、選んだ葉の表面を水で優しくすすいでほこりやゴミを取り除きます。すぐにフィルターペーパーや柔らかいペーパータオルで葉の表面を軽く吸い取り、余分な水分を取り除きます。自然乾燥は組織の収縮を引き起こし、気孔や表皮細胞のサイズが不正確になる可能性があるため避けてください。
2. 顕微鏡スライドにサンプルの詳細(例:種、葉面、準備日)を永久マーカーでラベル付けし、画像診断、分析、データ解釈を通じて各サンプルの追跡性を確保し、将来の使用のために適切な保管を可能にします。
3. 非腺性(毛のある)トリコームを持つ種は、ピーリング準備前にカミソリでトリコームを葉表面から除去してください。トリコームが存在すると細胞境界が見えにくくなり、画像品質が低下する恐れがあります(図1)。
4. 小さなブラシを使って、薄く均一な透明で伸ばしにくいネイルポリッシュ(「伸び」や「剥がし」の処方は避けてください)をターゲットの部分に塗ります。皮の準備は必ず葉の中央部分を選び、先端と根元は避けてください。
5. ネイルポリッシュを完全に乾かします(通常室温で2〜5分)。長時間の曝露は組織の変色(例:柔らかい葉に赤みが差す)を引き起こし、最終的な皮剥ぎで確認できることがあり、均一な着色が必要な下流解析に支障をきたすことがあります。
6. 乾いたら、塗布された部分に透明テープの帯を貼ります。ネイルポリッシュの端から始めて、テープを表面に徐々に貼り付け、優しく押し当ててしっかり接着し、気泡や折り目を防ぎます。指紋を避けるためにニトリル手袋を着用してください。
7. ネイルポリッシュフィルム(表皮の印)と一緒にテープを慎重に剥がしてください。
8. テープ(粘着面が下)をきれいな顕微鏡スライドに貼り、折り目や重なりを避けてください。
9. 準備済みのスライドは室温で保管し、ほこりや直射日光から守ってください。
10. 複合光学顕微鏡で400倍の拡大でスライドを観察します。ソフトウェアのガイドに従って画像を保存し、関連するスケールも一緒に保存してください。

3. クリアされたセクションの準備と閲覧

1. 葉片を約1cm^²のもので切ります。すべての工程はニトリル手袋を着用し、排気フードの下で作業してください。
2. サンプルをラベル付きバイアルに移し、固定液(4%グルタルアルデヒド、0.1 Mリン酸バッファー、pH=6.9)(注意)で覆い、4°Cで24時間保存します(固定液の調製用表1参照)。
3. ピペットで固定液を取り出し、サンプルを蒸留水で覆います。30分ほど離れてください。これを3回繰り返します(図2A-C)。
4. 水を取り除き、サンプルを1 M NaOH溶液で覆います(20 g NaOHを蒸留水0.5Lに溶かします)。
5. 葉の除去時にNaOH溶液は緑色に変わります。NaOH溶液は1日に1回新しい溶液に置き換えてください。3〜4日間、またはサンプルが淡い黄色に変わりNaOH溶液が透明になるまで続けます(図2D-F)。
6. NaOH溶液を取り除き、サンプルを漂白剤(5% NaClO)で覆います。この濃度の市販漂白剤が適しています。
7. サンプルを漂白剤で1〜2分間孵化します。試料は白く半透明になります(図2G-I)。
8. 前の溶液を取り除き、サンプルを蒸留水で2分間蓋をします。試料を、75:25、50:50、25:75、100%エタノールの等級蒸留水・エタノール系列で脱水します。
9. エタノールを除去し、サンプルをトルイジンブルーO(TBO)3%アルコール溶液で覆い、100%エタノール100mLに3gのTBOを溶かします。一晩中出て行け。
10. 染色液を取り除き、サンプルを100%エタノールで2分間覆います。この工程を、段階化された蒸留水-エタノール系列を用いて繰り返します:25:75、50:50、75:25、そして最後に蒸留水(図2J-L)。クリアリングプロセスに関連する一般的なミスやトラブルシューティング手順については図3を参照してください。
11. サンプルは4°Cの蒸留水で観察まで保管してください。
12. サンプルをガラススライドに移し、蒸留水を一滴加え、ガラスのカバースリップで覆って顕微鏡観察と画像撮影を行います。
13. 複合光学顕微鏡で400倍の拡大でスライドを観察します。ソフトウェアのガイドに従って画像を保存し、関連するスケールも一緒に保存してください。詳細は 資料表 をご覧ください。

4. 画像解析と測定

1. 画像処理と解析にはFiji²³(ImageJディストリビューション、バージョン1.54p)を使用してください。
2. Lineツールを使ってスケールバーに線を引き、「 Analyze > Set Scale」を選択し、既知の距離をスケールバーの長さに合わせて修正し、長さの単位をμmに変更します。
3. 測定 値を分析>。 エリアとフェレットの直径 のオプションを必ず確認してください。
4. ポリ ゴン選択 ツールを使って、対象のオブジェクトを輪郭線にします。 M キーを押して測定を記録してください。
5. フィジーにおける以下の気孔および表皮形質を測定し、クリアサンプルと気孔剥離の両方を計算します(図3)。
6. 気孔の数(Ns)を計算します。
   1. 平均気孔面積(As)を算出します。
   2. 平均気孔幅(Ws)を求める:フェレットの最小直径を用いて。
   3. 気孔密度(SD)は以下の式で計算します。
      
      ;単位 Ia(測定に選ばれた葉の面積、mm²)あたりです。
   4. 平均表皮細胞面積(Ae)を算出します。
   5. 表皮細胞密度(ECD)は以下の式で算出します。
      

5. 統計

1. ANOVAとTukeyのHSD Post-hoc検定を用いて、サンプル群間の差を検証します。
2. R²¹ですべての統計解析を実施してください。
3. 種ごとに合計3枚の複製葉を分析し、各葉から3枚の皮を観察します。

6. AI支援解析

1. セグメンテーションのために機械学習ツールを選択してください。
   1. ターゲット構造(気孔または表皮細胞)、画像品質、解析目標に基づいて適切な機械学習に基づくセグメンテーションツールを選択してください。
   2. 気孔特有の深層学習モデルを用いて気孔形質の自動検出と測定を行い、表皮細胞の分断にはジェネラリスト的な深層学習やピクセルベースのセグメンテーションツールを用いましょう。
   3. 具体的なソフトウェア実装については「機械学習ツールおよびソフトウェア」セクション(補足ファイル)を参照してください。
   4. 大規模解析の前に一部の画像に対してパイロットテストを行い、セグメンテーションの性能を評価し、誤陽性の潜在的な原因を特定します。
2. コンピューティング環境を準備しましょう。
   1. 8〜12コアプロセッサ、少なくとも32GB RAM、そして最低24GB VRAMのNVIDIA CUDA対応GPUを搭載したワークステーションを使用してください。
   2. 注釈や目視検査を容易にするために、高解像度ディスプレイ(できれば4K)を使用してください。
   3. 開発者の指示に従って選択したすべてのソフトウェアツールをインストールし、ソフトウェアのバージョンを記録して再現性を確保してください。
3. 機械学習解析用の画像を準備します。
   1. 顕微鏡画像はTIFFまたはPNG形式でインポートし、可能な限り8ビットまたは16ビットのグレースケール画像を使用してください。
   2. 各画像に目に見えるスケールバーが含まれているか、分析前に空間的にキャリブレーションされていることを確認してください。
   3. 破片、ひだ、気泡が最小限で、照明がまとまり、明確に定義されたセル境界のある関心領域を選択します。
   4. ぼやけたエッジ、強い影、コントラストの低い画像は除外してください。これらはセグメンテーションの精度を低下させます。
4. 気孔断節を行います。
   1. 気孔特有の深層学習モデル(補足ファイルセクション1)に画像を読み込みます。
   2. 対象の大きさ制限や信頼値などの検出パラメータを、種や画像解像度に応じて設定します。
   3. 自動検出を実行して気孔複合体を区切し、気孔数、面積、フェレット径などの出力指標を抽出します。
   4. 下流解析のためのセグメンテーションマスクと測定表のエクスポート。セグメントオーバーレイを視覚的に確認し、誤検出されたオブジェクトは手動で除外します。
5. 表皮細胞分断を行います。
   1. 画像をジェネラリストの深層学習セグメンテーションツールやピクセルベースの分類器に読み込みます(補足ファイルセクション2-4)。
   2. 表皮細胞、細胞境界、背景の手作業注釈付き例を用いて代表画像を用いてモデルを訓練または微調整します。
   3. セグメントを実行してオブジェクトマスクを生成し、ImageJ/Fijiまたは同等の画像解析ソフトウェアで後処理のためにマスクをエクスポートします。
   4. サイズベースまたは分位体ベースのフィルタリングを適用し、小さな偽陽性対象を除去し、目視検査でセグメンテーションの精度を確認した後、細胞面積や細胞密度などの表皮細胞指標を抽出します。
6. パラメータを記録し、品質管理を行うこと。
   1. 解析中に使用されたすべてのソフトウェアバージョン、パラメータ設定、フィルタリング閾値、ハードウェア仕様を記録してください。
   2. 代表的なセグメンテーションオーバーレイを保持し、セグメンテーションの品質を文書化します。
   3. 統計分析やデータ報告の前に、自動セグメンテーション出力を視覚的に検証します。
7. すべてのML処理のための画像準備
   1. サンプルイメージング
      注:MLベースのセグメンテーションは、生物学的文脈ではなく強度の勾配、エッジの連続性、一貫したオブジェクトジオメトリに依存するため、画像の前処理と領域選択がモデルのパフォーマンスと誤差構造を決定的に決定します。
      1. 剥がれた葉や剥がれた葉面の高解像度画像を、スケールバーで撮影します。良い機械学習ワークフローのためには、測定可能なオブジェクトが画像全体でシャープで連続的かつ高コントラストであることを確認しましょう。
   2. 地域選択と画質
      注:セクション6.7.1での画像取得後、画像は目視検査され、画像スケールが許す場合は、アーティファクトのない関心領域を手動で選定して下流のセグメンテーションを行います。残骸、ひだ、気泡、照明の不均一な部分など、アーティファクトが少ない注目地域を選びます。気孔モデル(例:StoManager1)では、孔の視認性の明確さと明確なガードセルシルエットを優先してください。表皮モデル(例:Cellpose、ilastik)では、セルの等高線に沿った安定した強度勾配を確保し、不連続または低コントラストのエッジはセグメンテーション性能を大幅に低下させます。境界が曖昧な画像は、セグメンテーション前に除外または再処理すべきです。
   3. ファイル形式
      セーブファイルはTIFFまたはPNG形式(セグメント化には8ビットまたは16ビットグレースケール推奨)で保存されます。
   4. オプションの画像強調
      1. 境界が弱い場合は、ImageJ/Fijiでコントラストを強調したり背景を減らしたりしてください。
      2. エッジジオメトリに注目してください。これらはセル境界として解釈される誤った勾配を生み出すことがあります。
      3. データセット内のすべての画像に対して、このような調整を一貫して適用してください。
         注意:エッジジオメトリには特に注意が必要です。影やハロー、不均一な背景グラデーションは、機械学習モデルがセル境界と誤認する人工的な強度の遷移を生み出す可能性があります。
8. StoManager1 (v1.0.0 GUI バージョン)
   注:StoManager1は、畳み込みニューラルネットワーク(YOLOv8-seg-x)を用いて、植物葉気孔の自動かつ高スループットの検出、測定、解析を可能にします。このツールは、さまざまな画像タイプから主要な気孔指標(面積、密度、孔/ガード細胞比、集約指数など)を定量化し、手作業やバイアスを削減し、大規模な生態学的・生理学的研究を促進します。使いやすいWindowsアプリが利用可能で、オプションの後処理(補足ファイルセクション1)²³以外はコーディングスキルは不要です。
   1. StoManager1の実行:インストールと設定
      1. GitHub(https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1)またはスタンドアロンのWindowsアプリケーション(補助ファイルセクション1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³を通じてアクセスできます。
      2. 互換性のあるライブラリバージョン(Python依存関係)を確保;他のML/イメージソフトウェアがインストールされている場合、競合が発生する可能性があります。
   2. StoManager1はGUIまたはコマンドラインインターフェースで起動します。
   3. 葉の画像を含む入力ディレクトリを選択してください。
   4. モデル選定;セグメンテーションに基づく詳細な指標についてはYOLOv8-seg-xモデルを確認してください。バウンディングボックスモデル(YOLOv3)ではチェックを外しておくと、メトリクスが少なくなります。
   5. パラメータ調整;必要に応じて、検出閾値、画像解像度、マスクの歪み、物体のサイズ制限を調整してください。一部の気孔オブジェクトが検出されない場合は、主に(1)検出信頼度を下げてより多くの真の気孔を回復し、偽陽性検出の確認を行ってください。(2) 画像解像度を向上させる。大きな値ほど小さな気孔の検出が向上するが、計算負荷は増加する。
   6. ランのセグメント化:
      1. 「 プロセス開始」をクリックすると、気孔と気孔全体を検出、分割、測定できます。
      2. 「 統計分析」をクリックすると、グループレベルの統計を処理できます。
   7. 結果を集めましょう。出力は YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (セグメンテーションモード)または直接YOUR_OUTPUT_PATH(バウンディングボックスモード)に保存されます。CSVファイルにはオブジェクトごとの指標および概要指標が含まれています。マスクや結果画像も生成されます。
   8. バッチ処理を開始します。
   9. 完成後、出力:セグメンテーションマスクと画像ごとのCSV結果ファイルを集めます。画像ごとの結果には、気孔数と気孔面積、フェレット直径(最大/最小)、ガードセル指標、集約・均一・発散指数、孔/ガード細胞比が含まれます。
   10. Excel、R、Pythonを使って出力を復習し、さらなる統計や可視化を図りましょう。
   11. 品質管理;マスクやオーバーレイを目視で確認しましょう。必要に応じて、サイズ、形状、または手動でキュレーションした際のアウトライヤーオブジェクトを削除してください(下記参照)。
       注:Cellposeおよびilastikの詳細なプロトコルおよび後処理手順は 補足ファイルに記載されています。大規模なデータセットや複雑な画像で最適なパフォーマンスを得るためには、8〜12コアのプロセッサ、少なくとも32GBのRAM、そして最低24GB VRAMのNVIDIA CUDA対応GPUを搭載したシステムを推奨します。効率的な注釈や可視化のために、大型で高解像度のディスプレイ(できれば4K)も強く推奨されます。

結果

剥がしとクリアリングの結果比較

T. officinale と F. excelsior は、サンプルが除去されたか剥がされたかによって気孔および表皮の特性に変動を示しました(図4)。クリアされたサンプルは一般的に細胞境界をより鮮明にし、ガード細胞の形状や孔口の明確な可視化を提供しましたが、重なり合う組織層が小さな気孔を隠し、サイズの推定値を上方に偏ることもありました。F. excelsiorでは、クリアサンプルの方がピーリングよりも平均気孔面積と気孔幅が有意に大きかったのに対し、T. officinaleでは有意な差は認められませんでした。ピールされたF. excelsiorの気孔密度は有意に高かったのに対し、T. officinaleでは方法効果は検出されませんでした。表皮細胞面積は両種の方法間で差はなかったが、剥がしたF. excelsiorの表皮細胞密度はやや高かった。

全体として、方法依存的な違いは形質や種ごとに異なり、特に気孔の大きさが異なる場合(例:発育中の葉の中)、表皮形質はほとんど影響を受けなかった場合、ピーリングが気孔測定に信頼できる選択肢であることを示唆しています(図5)。

AIの結果と、それが剥がれやクリアリングの方法とどのように共鳴するか

気孔特異モデルのStoManager1は、剥離された画像で気孔をより確実に検出しました(図6)一方で、クリアされたサンプルでは性能が著しく低下しました(図7)。StoManager1の調製方法における性能をさらに評価するため、ピーリングとクリア画像の両方を用いてT. officinaleとF. excelsiorの気孔形質検出を比較しました(図8)。T. officinaleでは、モデルは調製方法を通じて気孔の存在と密度を確実に検出しました。しかし、得られた値は手動測定と大きく異なっていました(表2および図5および図8)。ほとんどの気孔形質は剥離されたサンプルとクリアされたサンプルで大きく異なり(p < 0.05)、これはAI検出パイプラインが製剤法に非常に敏感であり、大規模適用前に慎重な検証が必要であることを示しています。対照的に、F. excelsiorでは軸心気孔が存在しないため、検出は軸面に限定され、クリアサンプルでは検出が不安定で、頻繁に偽陽性が出ました(図8)。これらの結果は、種特異的な解剖学的特徴や画像品質がAI解析の効果に強い影響を与えていることを示しています。Cellpose(図9A)やIlastik(図9B)のようなジェネラリストMLツールは、剥がれた表皮細胞をより効果的に分割し、クリア画像では効果的でした。しかし、両ツールとも、特に低コントラスト条件下や細胞輪郭がぼやけている場合に、ピーリングとクリアリングの両方の準備技術で多数の偽陽性を生み出しました。このような場合、不明瞭な気孔や表皮の輪郭が複数の微小な物体に過剰に分割され、個々の表皮細胞として誤分類されることが多かった(図10参照)。その結果、後処理が不可欠であり、単なる外れ値除去だけでなく、上位分位数によるフィルタリングも必要であり、確実に同定された細胞を保持します。

図1:毛毛除去前後の F. carica の気孔剥離 。大きなトリコームは皮に跡を残し、空気のポケットを形成して表面が不均一になり、焦点の定着を妨げることがあります(大きな灰色の点として見えます)。 F. carica は、毛のある葉にプロトコルを拡張するために例外として含まれました。(A) 200倍倍で、トリコーム除去前の画像がトリコームの印によって部分的に遮られている。(B) トリコーム除去後に画像の品質が向上すること。(C) トリコーム除去前の400倍拡大画像では、トリコームの圧痕によって大部分が遮られている。(D) カミソリでトリコーム除去後の画像での閉塞は最小限。スケールバーは100μm(A、B)および50μm(C、D)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:クリアリングプロトコルの連続したステップ。T. officinale、F. excelsior、F. caricaの代表的な画像は、クリアリングプロトコルの連続した段階を示しています。(A-C)新鮮な葉っぱ。(D-F)はNaOHとクリアリングを終えて去る。(G-I)はNaClOで漂白した後に去る。(J-L)はトルイジンブルーOで染色した後に離脱します。この視覚的補助は、次のステップに進む前に予想されるサンプルの外観を示し、種ごとのプロトコルのばらつきを強調します。F. caricaは、より広範な葉や脈の形態に対するプロトコルの適用可能性を示すために、例外種として含まれました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:気孔および表皮形質の測定例。 測定された形質は画像上で次のように示されています: As = 気孔面積; Ls = 気孔長; Ws = 気孔幅; A= 表皮細胞面積。気孔密度および表皮細胞密度は、プロトコルで記載された範囲内で計算されました。400倍倍の画像。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:クリアリングプロトコルとピーリングプロトコルで取得した画像の比較。 T . officinale と F. excelsior の代表画像。透明化と気孔剥離画像を比較し、気孔および表皮細胞の可視性と変動性を示す。スケールバー50μm、400倍倍の拡大で撮影します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:クリアリングとピーリングプロトコルの手動形質測定結果の違い。T. officinale と F. excelsior におけるクリアリング法と表皮剥離法の気孔および表皮質の違いを示すボックスプロット。(A)平均気孔面積(B)平均気孔幅(C)気孔密度(D)平均表皮細胞面積、(E)表皮細胞密度。アスタリスクは統計的有意度を示しています(P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001)。統計的有意な有意性は一方向ANOVAを用いて評価し、その後TukeyのHSDポストホック検査を実施しました。グループごとのサンプルサイズ:n = 3-5。略語:As = 気孔面積;Ws = 気孔幅;SD = 気孔密度;Ae = 表皮細胞面積;ECD = 表皮細胞密度。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:ピールサンプルの気孔検出モデルを用いたセグメンテーション結果の例。 成熟した日陰露出葉の下側の剥がれた T. officinale のサンプルに対するStoManager1の分割結果で良好な検出精度を示しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:クリアサンプルを用いた気孔検出モデルを用いた分割結果の例。 成熟した日陰露出葉の下側のT . officinale のクリアサンプルに対するStoManager1の分割結果は、剥がれたサンプルと比べて検出精度が低下していることを示しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:クリアリングとピーリングプロトコルにおけるAI支援形質測定結果の違い。 T . officinale および F. excelsior の画像から StoManager1 が処理した気孔解剖学的特徴のAI解析測定を示すボックスプロット。形質には気孔面積(As)、気孔幅(Ws)、気孔長(Ls)、気孔密度(Ds)が含まれます。単位は 図5の通りです。統計的有意な有意性は一方向ANOVAを用いて評価し、その後TukeyのHSDポストホック検査を実施しました。アスタリスクは統計的有意度を示しています(P < 0.05; *P < 0.01; **P < 0.001)。グループごとのサンプルサイズ: n = 3-5。略語: As = 気孔面積; Ws = 気孔幅; Ls = 気孔長; Ds = 気孔密度。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図9:ジェネラリスト深層学習ツールとピクセルベースの分類器を用いたセグメンテーションのスクリーンショット。 剥がした F. excelsior サンプル(背面葉面)の分割は、(A)ジェネラリスト深層学習ツール(Cellpose(cyto2))と(B)ピクセルベースの分類器(ilastik)によるものでした。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図10:F . excelsior の剥がれたサンプル(葉の背面)のIlastik分割マスクで多数の偽陽性を示している。 小さな点は異なる表皮細胞として誤分類されます。後処理中には、誤検知を効果的にフィルタリングするためにサイズベースの閾値を設定するための手動(目視)検査が必要です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

解決策	調理	最終巻
バッファー1のベース	7.12 g(Na2HPO4 × 2H2O)を200 mLのディステートに含めます。H2O	200 mL
バッファー2のベース	200 mLの離間液に7.12 gのNa2HPO4 *2H2Oを投与。H2O	200 mL
リン酸塩バッファー	塩基1を36 mL、塩基2を14 mL + ディスト50 mLを混ぜます。H2O	100 mL
固定液	5%グルターアルデヒド9.25 mLとリン酸バッファー12.5 mL、ディスト28.25 mLを混ぜます。H2O	50 mL

表1:固定溶液のレシピ²⁴。 本研究で使用された解の構成。

種	サイド	方法	マン(アス)	AI(As)	マン(W)	AI(Ws)	マン(L)	AI(Ls)
フラクシヌス	アバクシャル	ピール	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
タラクサクム	アバクシャル	クリア	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
タラクサクム	アバクシャル	ピール	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
タラクサクム	アダクシャル	クリア	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
タラクサクム	アダクシャル	ピール	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

表2: 手動測定とAIに関する指標的な比較。ML(StoManager1)のスケール化された結果。人間とAIは、それに対応して手動およびAI(StoManager1)の結果を示します。単位は 図5の通りです。手動測定とAI測定は大きく異なります。いくつかの比較は、気孔欠損(例:アダシアルF . excelsior)や検出失敗(例:細胞輪郭が曖昧で気孔が検出しにくい)など、さまざまな理由で利用できません。

補足図1:葉の除去時によくあるミスの例で、結果に影響を与える例。 トラブルシューティング用の画像:(A) セクション3.10でのサンプルの不完全な再水和による染色の不均一;(B) 化学処理された非常に脆弱な試料の誤った取り扱いによる機械的損傷;(C) 3.5区画でクロロフィルが不完全に除去されたため、サンプル中央に緑色がかった。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:StoManager1ユーザーインターフェースの例。 StoManager1ユーザーインターフェースのスクリーンショットで、入力セットアップと結果表(左)、およびミクログラフビュー(オリジナル画像付き右上)、気孔検出オーバーレイ(右下、 T. officinale 剥離サンプルの軸面)が示されています。この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:Cellposeユーザーインターフェースの例。 GUI上で進行中のセルポーズ分割のスクリーンショットで、パラメータ調整(例:モデル選択 - 推奨される事前学習済みのcyto2モデルまたはカスタムトレーニングモデル、閾値、細胞径キャリブレーション)。表皮細胞の手動注釈は、各細胞を独自の色で強調し、モデルのキャリブレーションを導きます。オーバーレイは F. excelsior の腹側表皮剥離の断片を示しています。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図4:イラスティックのセグメンテーションプロセス。 オーバーレイは F. excelsior のアバシアル表皮剥離画像上のピクセル単位の分類を示しています。(A) 進行中のイラスティック分割のスクリーンショットで、手動でラベル付けされたクラス(表皮細胞(黄色)、細胞輪郭(青)、トリコームなどの非表皮背景(赤)による教師ありトレーニングのスクリーンショット。(B) 表皮クラスのみを示すスクリーンショット(黄色)で、分類器が個々の表皮細胞をどのように分離するかを示しています。特にコントラストが低い領域や照明の不均一な領域で、複数の偽陽性による「微小な」検出が見られることに注意してください。(C) 輪郭クラスのみを示すスクリーンショット(青)で、分類器が周囲の表皮組織から細胞境界をどのように分離しているかを示しています。一部の輪郭線は連続的でなく、特にコントラストが低く照明が不均一な領域で複数の偽陽性「微小」検出が発生することに注意してください。(D) 背景クラスのスクリーンショット。マスクは気孔複合体、腺トリコーム、その他の破片(赤)を強調し、表皮細胞体は除外しています。表皮領域には、グレースケールのアーティファクトやテクスチャに基づく誤分類による多数の小さな偽陽性「微小」検出が見られます。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図5:セルポーズトレーニング設定。 クリアされた T. officinale サンプル(両葉面)のCellposeトレーニング設定(GUI)の例で、調整前のデフォルトモデルパラメータを示しています。事前学習済みのcyto2モデルを選択し、学習率は0.1と100の学習エポック(デフォルト値)で、それぞれモデルの重みの更新速度とトレーニングパス回数を決定します。これらのデフォルトは一般的に修正されます(例:学習率=0.15;エポック=12)。これにより、訓練時間を短縮し、モデルを植物表皮形態に適応させます。しかし、エポック番号が低いと検出性能が低下し、誤検知が増加する可能性があります。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図6: セルポーズはマスクを「ラベル」付けします。 剥がれた F. excelsior サンプル(アブアシアル葉面)にCellpose「ラベル」マスクを適用し、各セグメント対象に固有の識別子を割り当てた監督付きトレーニングの結果を示します。表皮細胞(eと示される)が優勢であり、気孔保護細胞の対(gと示される)も検出されます。トリコームが表皮細胞(左上)または気孔(中央下部)と誤分類されている場合、偽陽性が確認され、画像の一部で表皮細胞が標識されていない場合には偽陰性が見られます。このマスクタイプは、監督モデルの下流の定量化や洗練に使用されます。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図7: ImageJ/Fijiにおける分節された表皮細胞の定量化。剥がれた F. excelsior サンプル(アバシアル葉面)のilastikピクセル分類後の分節表皮細胞定量を示すスクリーンショット。(A) エクスポートされたマスクでは、検出された各ピクセルクラスターが個々のパーティクルに対応し、オブジェクトレベルの指標(例:面積、周囲、フェレット直径)を自動的に抽出できます。結果ウィンドウ(下部)には数千のオブジェクトの生の測定値が表示されます。「微小」なドットノイズや断片的な輪郭から発生する小さな粒子の数が非常に多いことに注目し、多数の偽陽性の存在を示しています。これらのアーティファクトは、真の表皮細胞を単離するために生物学的に知られたフィルター処理を経て、下流の統計解析に至ります。(B) ImageJ/Fijiにおけるイラスティック分割表皮対象の領域ベースフィルタリング。小さな破片やノイズは、最小面積を150〜350μm²に適用することで排除され、パネルAのフィルターなしマスクに比べて検出される粒子数を約10倍(10倍)減少させます。このフィルタリングステップは微小な偽陽性を大幅に除去しますが、完全な分類は依然として残っており、断片的な輪郭や残留する非表皮要素が残り、円形性閾値や生物学的に知られたスクリーニング後のスクリーニングなどのさらなる精緻化が必要です。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図8:ImageJ/FijiにおけるCellpose「ラベル」マスクの後処理。 剥がれた F. excelsior サンプル(アバクシアル葉面)に対してLabels to ROIsプラグインを使用することで、マスク内の各セグメント対象物を関心領域(ROI)に変換し、表皮細胞および気孔ガード細胞複合体の個別の検査と測定が可能になります。ROIは元の顕微鏡写真(左)に重ねて表示され、結果ウィンドウ(右下)にはセルレベルの指標(例:面積、フェレット直径、周囲長)が表示されます。このステップにより、生物学的に情報に基づいたキュレーションが可能となり、各ROIが真の表皮細胞に対応しているかどうかを確認し、トリコームや誤分断された気孔などの遺物を除外し、閾値フィルタリング後も残るものを除外することで、後の分析ステップに役立てることができます。 この図形をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

気孔の測定を一貫させるために、標準化された結果を得るために中央層からピールを取るべきであり、主要な脈は避けるべきです。気孔密度は葉の基部、先端、縁に向かって大きく変異し、減少するため^です。新鮮な葉が最も信頼できる皮を生み出します。ただし、縮まらない透明なネイルポリッシュと高品質の透明テープを用いて歪みやアーティファクトを避けます。~12時間を超える遅延は脱水によって輪郭の明瞭さを低下させます。ピーリングは一時的に固定されるため、空気が閉じ込められる可能性があるため早期の画像診断が推奨されますが、1か月経っても品質は許容範囲で保たれます。

特定の組織タイプ、画像診断目標、安全性の考慮^{事項13、14、15}に応じたさまざまなクリアリング方法が存在する。化学的クリアリングは、利用性の低さ、低毒性、葉の種類にまたがる広範な適用性から、水性NaOHベースのプロトコルを用いて行われました。組織の反応は種によって異なるため、テストと最適化が必要です。硬葉の葉は≥2週間かかることがあり、残留緑色組織は染色や解剖学的特徴の隠蔽を妨げることがあります(補足図1C)。より速い除去のために、NaOH濃度を2.5 Mまたは5 Mに増やすことができます。軟らかい葉は漂白後に脆くなります(セクション3.7;補足図1B)、次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)への過剰曝露は組織を劣化させたり、表皮層の分離を引き起こすことがあります。ほとんどの柔らかい葉には30秒から2分の漂白で十分ですが、より丈夫な種は最大1時間²⁷分かかることもあります。クリアリングは皮の準備より時間がかかり、~5日かかり専門的な訓練も不要ですが、多様な種に合わせて調整可能です。クリアおよび染色されたサンプルは4°Cの蒸留水で保存でき、長期保存のために永久的なマウントが推奨されます^15,27。

気孔特異のStoManager1は、ほとんどの画像タイプで気孔複合体を確実に検出し(補足図2)、ピーリング法における手動注釈と概ね一致する検出結果を示しました。しかし、気孔面積の測定は手動測定とは体系的に異なっており(表2)、大規模な解析前に手作業で測定された小さなサブセット(例:1種あたり10〜20個の気孔)に基づく校正が必要でした。StoManager1はスループットを大幅に向上させ、非標準の場合は手動検証が必要です。

気孔と表皮の同時分割は、最適なシャープネスが異なり、形態や膜の透明度の異質さが分割誤差をもたらすため困難です。同じように、大きな画像セット(例:アダクシャル/アバクシャル面、ピールド/クリアド)でのトレーニングは特異性を失います。植物表皮に関する事前学習済みのCellposeモデルは存在しません。主に動物細胞で訓練された標準的な「CYTO」および「CYTO2」モデルは、表皮画像では性能が劣ります。したがって、信頼性のためにはカスタムトレーニングが必要です(補足第2節)。トレーニング後でも、過剰なセグメンテーションや偽陽性は特に低コントラストや未クリア画像で一般的です(補足図3)。

ilastik(補足セクション3、補足図4)では、対象セルクラス(例:表皮のクラス1)に対してオブジェクトマスクを生成し、監査や手動修正のためにクラスマスクを保持すべきです。バッチ処理およびその後のImageJ/Fijiワークフローは、時間を節約し、手作業のミスを減らすことができます。面積、標準偏差、または分位数による一貫したフィルタリングは、ノイズや誤検出を抑制するために不可欠です。フィルタリング後、中央値セル面積とセル数は手動値に近づきます。手動測定や代替の機械学習ツール(Weka、RootPainter)とのベンチマーキングは、パラメータの調整やセグメンテーション品質の評価に不可欠です。MLバッチ処理はリソースを大量に消費します。安定したトレーニングや大規模なバッチセグメンテーションには、NVIDIA CUDA対応GPUと≥32GBのRAMが必要です。中級システム(例:16GB RAMと統合グラフィックス)では、教師ありトレーニングは通常、<10画像に対して5〜10分ほどかかり、複数の注釈クラスや異種画像タイプを使用すると頻繁にクラッシュします。CUDAはCPUや統合GPU実行に比べて処理速度を約10〜20倍向上させました。

Cellpose、ilastik、StoManager1の各機能表現の違いは、それぞれ異なる特徴表現に起因します。Cellposeは物体中心に向かうベクトル流場を予測し、光学ハローや急激な屈折境界に敏感で、これらは流れを乱し、除去されたF. excelsiorで偽陽性のクラスターを発生させます。Ilastikは人間主導のピクセル分類器として、背景として明示的にラベル付けされていない限り、高浮彫の舗装セルの壁やハローをオーバーセグメントします。StoManager1は、物体レベルの形状パターン(中心孔を持つ対になったガードセル)を用いた気孔複合体を検出し、ピーリング製剤(F. excelsior²⁸を含む)で良好に機能します。しかし、ハローによるぼやけはクリアリング時の孔隙の視認性に影響を与え、誤分類ではなく偽陰性を生み出します(補足ファイル第1および第3節)。したがって、CellposeとStoManager1は自動セグメンタとして動作し、ilastikは人間主導の分類器として機能します(補足ファイルセクション1-3)^28。

種特異的な細胞アーキテクチャはAIのパフォーマンスを調節します。 T. officinaleでは、滑らかで楕円形のガードセルマージンがStoManager1のトレーニング分布と一致し、剥がれたサンプルでも検出可能でした(補足図2)。一方、ジェネラリストツールはガードセルと舗装セルを混同しがちでした。 F. excelsiorでは、後退気孔と高浮きの舗装細胞がクリア画像の偽陰性を引き起こします。これらの不一致は種や調剤に依存するイメージングジオメトリを反映しています。手動測定とAI由来測定の体系的な違いは、AIによる画像からのスケールエンコーディングの欠如と、準備による光学的アーティファクトの欠如に起因します。緩和策には、組織調製によるぼやけやハローの視覚的トリアージ、上記の条件下でのピーリングの優先使用、気孔の一部に対する線形補正を伴う手動キャリブレーション(手動 = a + b × AI)が含まれます。追加の戦略としては、分類群特有の増強や補助クラス設計(ただし、自身で訓練されたモデルは大規模で多様なデータセット上で事前学習モデルよりも低いままである可能性が高い)、セグメンテーション後の上位分位体フィルタリングなどがあります。

AIセグメンテーションの誤りは体系的で非ランダムであるため、後処理が不可欠です。画像品質の診断は単純な決定木に従うことができます。まず表皮のコントラストとシャープネスをチェックしてください。鋭い場合は偽陽性に進みます。ぼかしの場合は、小さな高周波アーティファクトが出ることを想定し、フィルターを調整してください。誤検知(例:ドットやデブリ)が最小限の場合は±2〜3のSDアウトライヤーフィルタリングで通常十分です。小さなアーティファクトが優勢の場合は分位体ベースのフィルタリングを用いましょう。次に形質分布(例:中央値 Ae)を生物学的期待値や手動データと比較してください。必要に応じて閾値を細化し、アーティファクト豊富なデータセットでは上位10〜50%分位数のみを保持することで、意味のある出力が得られます(補足図7 および 8参照)。表皮MLツールによる高い偽陽性率のため、信頼できる気孔密度推定は自動で得られませんでしたが、StoManager1は境界が明確な場合に正確な気孔測定²⁸ を提供しました( 図6および図7参照)。表皮の中央値では、Aeは頑健であり、平均よりも小さな偽陽性に対して感度が低いことが証明されました。

方法の選択が形質検出に影響を与えました。ピーリングは気孔密度の除去よりも優れており、気孔を完全に露出させました(図3)。一方、除去は層状や色素組織の小さな気孔をしばしば隠してしまいましたが、気^孔形状の保存は良好であったこともあります。AIツールの中で、StoManager1は特にピーリング準備において最小限のキュレーションで堅牢な気孔測定を一貫して提供^し、ピーリングは正しく同定された細胞と画像カバレッジを増加させることで表皮測定も改善しました^。将来の利益は、生態生理学や作物改良のための自動イメージングパイプラインに統合するための大規模で分類学的に多様な事前学習モデルから最も生じる可能性が高いです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
消毒液洗浄剤 NaClO &5%	ドメストス、GB	H000023244	皮膚の火傷など、
リン酸二水素ナトリウム(Na2HPO4. 2H2O)	ペンタ、CZ	10028-24-7	NA
エタノール、抗体、100%A.R.。	ケムラボ NV、ベネバーサオ州	CL00.0505.1000	非常に可燃性です。
ガラスバイアル 2 mL	VWRライフサイエンス、米国	548-0045
グルターアルデヒド50%溶液	VWRライフサイエンス、米国	23H2856331	吸入すると致命的だ。飲み込むと有毒です。 保護手袋を着用し、服装、そして眼鏡。
顕微鏡スライド	ノーマックス、PT	5470308A	NA
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