私たちは、ヒトの頸部オルガノイドを確立し遺伝的に操作するための詳細なプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
子宮頸がんは女性で4番目に多いがんであり、最も頻繁に子宮外角膜に影響を及ぼします。子宮外頭皮は、基底細胞と分化する副基底細胞および上基底細胞からなる層状扁平上皮で覆われています。子宮頸部形成後の再生は、幹細胞の活発な活性の存在を示唆しています。しかし、子宮頸部幹細胞の同一および調節機構および悪性転換過程に関する理解は、人間の子宮頸部組織へのアクセスが限られ、子宮外球管における幹細胞活性を評価する最適なシステムが不足しているため、限られています。最近確立されたヒトの頸部オルガノイドはこれらの制約を克服し、頸部生理学および病理学の研究に新たな機会を提供します。しかし、ヒトの頸部オルガノイドを単離・確立するための標準化された方法は存在しません。ここでは、ヒトの外胚管オルガノイドを確立する方法を説明します。具体的には、人間の外頭皮から単一細胞を分離するプロトコルを提示します。子宮頸部組織を最適化された酵素溶液で培養することで、子宮頸部上皮を剥がして細胞収量を最大化しつつ線維芽細胞汚染を最小限に抑えます。さらに、最適化された培地製剤を用いたヒト子宮頸部オルガノイドの培養条件を概説します。さらに、頸部オルガノイドの継承および遺伝操作の手順も詳述しています。このプロトコルは、ヒトの子宮頸部オルガノイドを確立し、それを用いて子宮頸幹細胞や疾患の研究に活用するための非常に効率的なアプローチを提供します。
概要
子宮外小球頸部は子宮頸がんの最も一般的な部位です1,2。先進国でヒトパピローマウイルス(HPV)ワクチンが導入されてから子宮頸がんは減少傾向にありますが、世界的には依然として女性の間で4番目に多いがんです 3,4。また、一部の国では子宮頸部前がん病変の発生率が増加し続けています5,6。低度の扁平上皮内病変(LSIL)は自然に退行することが多い一方で、高悪性度の扁平上皮内病変(HSIL)は浸潤性がんへの進行リスクがあり、通常は切除や円錐切除などの外科的介入が必要です。これらの処置は外子管を短縮し、流産や早産のリスクを高める可能性があります 7,8。子宮頸部生物学の深い理解と再生療法の開発はこれらの課題に取り組む助けとなる可能性がありますが、堅牢で生理学的に関連性の高いモデルシステムが必要です。
動物モデルは、頸部の恒常性、疾患メカニズム、治療戦略の理解を大きく前進させました。しかし、人間の生物学や病理学とは本質的に異なるため、翻訳価値は限定的です。代わりに、オルガノイドは人間の生物学や疾患をモデル化する強力なプラットフォームとして登場しています。オルガノイドは幹細胞由来の3次元微細構造であり、その起源組織の組織学的および分子的特徴を再現します。これらは気管、食道、子宮頸部など複数の組織にわたる多様なヒト組織幹細胞の同定に用いられています。さらに、オルガノイドは遺伝操作を可能にし、がんや線維症を含む多様な疾患の病因モデル化を可能にします。さらに、オルガノイドは薬物や細胞療法の有効性と毒性をスクリーニングする効果的なプラットフォームとしても機能します。
最近、2つの独立したグループがヒトの頸部オルガノイドシステムを確立しました22,23。これらの進展を基に、子宮頸部オルガノイド培養の効率を大幅に向上させ、ヒト子宮頸部幹細胞13を同定しました。さらに、頸部上皮を剥がすことで、頸部上皮の下にある線維芽細胞の含有を最小限に抑えました。遺伝子操作を伴う子宮頸部オルガノイドを用いることで、微生物代謝物とその下流経路が子宮頸部恒常性の維持と前がん進行の防止に果たす役割を明らかにしました。したがって、頸部オルガノイドの生成、維持、遺伝子改変のための標準化かつ最適化されたプロトコルは、頸部生物学および病理学の研究に不可欠なツールとなるでしょう。
本記事では、ヒトの頸部オルガノイドの生成および通過に関する詳細かつ最適化されたプロトコルを紹介します。また、電気穿孔による遺伝子操作のプロトコルも記述しています。
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プロトコル
ヒト子宮頸部組織を用いた細胞分離およびオルガノイド培養は、韓国大邱のDGISTおよび慶尚北道のチルゴク慶北国立大学病院の内部審査委員会(DGIST-20210401-BR-112-01およびKNUCH-2020-12-020-001)によって、関連する倫理規則に従って承認・実施されました。ヒト外胚胎組織はチルゴク慶北国立大学病院産婦人科から提供されました。良性子宮疾患のために全腹腔鏡下子宮摘出術を受けた患者から、健康な子宮頸部組織が採取されました。すべての患者からインフォームド・コンセントが得られました。
1. 外腎組織からの単細胞分離
注:このプロトコルは、約5mm×5mm×5mmのヒト外球頸部生検サンプルから始まります(図1)。
- 生検した組織を10cmのペトリ皿に入れ、氷のように冷たいDPBS(カルシウムとマグネシウムなし)で一度洗って血液やゴミを取り除きます。
注:ヒトの子宮頸部組織は手術後3時間以内に氷冷のAdvanced DMEM/F12で検査室に運ばれ、到着直後に処理されました。 - 組織を1.5 mLのチューブに移し、1 mLのディスパーゼ溶液(2.4 U/mL)を含み、37°Cで1時間、チューブローター(20 rpm)で優しく攪拌します。
注:ディスパーゼ溶液(2.4 U/mL)は、使用直前に氷のように冷たいDPBSでディスパーズ粉末を作動濃度まで溶かして新たに調製されました。 - サンプルを新しい10cmの培養皿に移します。鉗子を使って白い上皮層を他の組織から慎重に分離します。
- 鋭い鉗子を使って上皮表面を優しく剥がし、完全なシートとして剥がします。すぐに分離した上皮層を氷の上に置いた50mLの円錐形チューブに移します。
注意:表面上皮が簡単に剥がれない場合は、鈍頭の鉗子で表面をこすり取ってください。 - 剥がれたサンプルやスクイそげたサンプルに組換えトリプシンベースの解離液1 mLを加え、混合物全体を50 mLの円錐形チューブに移します。
- 前の工程の残りの組織は、もう一方の50mL円錐形チューブに残しておきます。
- 頸椎上皮を含む50 mL円錐形チューブを37°Cで5分間、チューブローター(20 rpm)で優しく攪拌しながらキュベートします。
- 細胞懸濁液に新たに調製した氷冷ブロッキングバッファー(PBSに2%の牛の子牛血清(BCS)を加えて酵素反応を止めます。
- チューブを450× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液を慎重に取り除き捨てます。
注意:解離した組織に血液が目視で確認されたり、組織が粘着しているように見える場合は、次のステップを進めてください。そうでなければ、ステップ1.13に進みましょう。 - ペレットに1×赤血球溶解バッファー1mLとDNase(10 U/μLストック)20 μLを加えます。室温で5分間培養して赤血球を溶かし、粘着性のDNAを分解します。
- 細胞懸濁液に氷冷ブロッキングバッファー(PBSに2%牛の子牛血清(BCS)を加えて酵素反応を止めます。
- チューブを450× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液を慎重に取り除き捨てます。
- 細胞ペレットは氷のように冷たいブロッキングバッファー(PBSに2%の牛の子牛血清(BCS))を混ぜて洗浄します。
- チューブを450 × g で5分間遠心分離します。上澄液を慎重に取り除き捨てます。
- 細胞ペレットを200〜500μLのオルガノイド培養培地に再懸浮させます。
- トリパンブルー溶液を用いたヘモサイトメーターで細胞数を数えます。生検サンプルあたりの推定細胞収量は50,000から500,000個の間です。
2. 外巣管オルガノイドの種子付けと培養
- 500〜2,000個の 生存細胞 を、最終体積50μLのオルガノイド培養培地(材料リストに記載)を1.5mLのマイクロ遠心チューブ内に再懸浮させます。細胞生存率は、播種前にトリパンブルー排除法で評価されました。
- 細胞懸濁液に基底膜マトリックス(例:マトリゲル)を50μL加えます。気泡の形成を防ぐために氷で優しく混ぜ、100μLの混合物を24ウェルプレートに置かれた細胞培養インサートの内部に注ぎます。基底膜マトリックスの取り扱いに関わるすべての処置は、特に指定がない限り早期ゲル化を防ぐため氷上または4°Cで行われました。
- プレートを37°Cで20〜30分間インキュベートし、基底膜マトリックスと細胞の混合物が固まるまで待つ。
- 混合物が固まったら、挿入物の下のウェルに400μLのオルガノイド培養培地を加えます。
- オルガノイドを1〜2週間培養し、平均直径150〜250μm(最大直径約500μm)に達するまで行います。
注意:オルガノイドが適切な大きさに達し、玉ねぎ皮のような同心ラメラーパターンを示した場合、必要に応じてパッセージを検討してください。
3. オルガノイド解離と再播種
- 細胞培養インサートの上に1 mLのディスパーゼ溶液(2.4 U/mL)を加え、ピペットで基底膜マトリックスを優しく解離します。
- 分散基底膜マトリックス混合物を15 mLチューブに移し、37°Cで1時間インキュベーションします。
- 細胞懸濁液に新たに調製した氷冷ブロッキングバッファー(PBSに2%の牛の子牛血清(BCS)を加えて酵素反応を止めます。
- チューブを450× g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上澄液を除去し、ペレットを200μLのTrypLEエクスプレスで再懸浮させます。
- 37°Cで5分間孵化します。
- 氷で冷たいブロッキングバッファー1mL(PBSに2%の牛の子牛血清(BCS))を加え、ピペットで優しくピペットして酵素を中和します。
- 懸濁液を40μmのセルストレーナーに通して単一セルを得ます。
- チューブを450× g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄液を慎重に取り除き捨てます。
- 細胞ペレットを200〜500μLのオルガノイド培養培地に再懸浮させます。
- トリパンブルー溶液を用いたヘモサイトメーターで細胞数を数えます。24ウェル細胞培養挿入の1ウェルあたり、期待される細胞収量は50,000から500,000細胞の間です。
- その後、500〜2,000個の細胞を50μLのオルガノイド培養培地(材料リストに記載した組成)に再懸浮させます。細胞懸濁液に基底膜マトリックス50μLを加えます。優しく混ぜ、泡の発生を防ぎ、100μLの混合物を24ウェルプレートに置かれた細胞培養インサートの内部に分散します。
- プレートを37°Cで20〜30分間インキュベートし、基底膜マトリックスと細胞の混合物が固まるまで待つ。
- 混合物が完全に固化したら(通常37°Cで20〜30分後)、挿入部分の下のウェルに400μLのオルガノイド培養培地を加えます。
- オルガノイドを1〜2週間、3D細胞外マトリックス埋め込み法を用いてオルガノイド培養培地(材料リストに記載された組成)で培養します。培養液は加湿インキュベーターで37°C、CO₂5%で維持します。培地を2〜3日ごとに交換し、オルガノイドの平均直径が150〜250μmに達するまで成長を監視します。
- オルガノイドが適切なサイズに達したら次のラウンドに移行し、必要に応じて同心円状の層状パターンの玉ねぎ皮のような微細構造を示します。
4. ヒトの頸部オルガノイドの電気穿孔による遺伝的操作
注:このプロトコルはLonza Amaxa 4D-NucleofectorおよびP4一次細胞4D-ヌクレオフェクターXキット(#V4XP-4032)を使用しています。
- ヒト子宮頸部細胞の懸濁液から分離後、各1.5 mLチューブに10万〜20万個の細胞を移します。
- チューブを450 × g で4°Cで3分間遠心分離します。 上澄液を慎重に取り除き捨てます。
- 細胞ペレットをP4一次細胞4D-ヌクレオフェクターXキットのヌクレオフェクター溶液/サプリメント混合物20μLに再懸浮させます。この混合物は、1チューブあたり16.4μLのヌクレオフェクター溶液と3.6μLのサプリメントを組み合わせて調製されます。
- 再懸濁細胞を含む各チューブに、対照または標的のsiRNAオリゴを300 nM加えます。ピペッティングで優しく混ぜます。
注意:siRNAオリゴの体積は1本あたり2μLを超えてはいけません。 - ヌクレオフェクター混合物(ヌクレオフェクター溶液/サプリメント混合物に再懸濁した20μLの細胞+最大2μLのsiRNAを含み、合計20〜22μL)をP4一次細胞4D-ヌクレオフェクターXキットのエレクトロポレーションキューベット容器に慎重に移します。
- ヌクレオキュベットの血管を優しく叩き、サンプルがキュベットの底を覆うようにします。
- ヌクレオキュベット血管の蓋を閉じ、電源オンの4D核子装置のリテーナーに入れます。
注意:リテーナー内の核子血管の正しい向きを確認してください。 - 核反応プロセスを開始。P4一次電池プロセスで各キューベットごとにEA-125パルスコードを設定してください。
- 完成後は、リテーナーからNucleocuvette導管を慎重に取り出します。
- 細胞が安定するまで、核子管を室温で10分間培養します。
- 核子管の蓋を開け、各キュベットに37°Cの予温されたオルガノイド培地180μLを加え、細胞懸濁液を新しい1.5mLチューブに優しく移して再懸濁させます。
- 細胞懸濁液の体積(500〜2,000個)を取り、オルガノイド培養培地に再懸浮させて最終体積50μLにします。
注意:ステップ4.12の残りのセルは破棄しないでください。これらはステップ4.14で使用されます。 - オルガノイドは方法2のプロトコルに従い、エクトケルビックスオルガノイドの播種と培養を行います。siRNAの効果を比較し、その結果得られるオルガノイドの数、サイズ、構造など多様な要因を比較します。
- ステップ4.12の残りの細胞を96ウェルの超低温アタッチメントプレートに分散し、37°Cで48時間インキュベーションします。
- 48時間後、細胞を1.5mLのチューブに移し、450× g で遠心分離機で3分間投与します。上清液は捨てる。
- 細胞ペレットを用いて、ターゲット遺伝子のノックダウンを確認し、遺伝子発現の変化を評価するためにリアルタイムのPCR実験を行います。
注意:すべてのヒト子宮頸部組織および細胞懸濁物は、感染の可能性がある物質として扱うべきです。一次ヒト標本を含むすべての手技は、BSL-2の基準に従い、認定されたバイオセーフティキャビネット内で実施し、機関の倫理および生物安全規則に従って実施すること。適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用し、使用後は機関承認の消毒剤で作業面や機器を消毒してください。酵素試薬(例:TrypLE Expressのような分散酵素や解離酵素)は皮膚や目の刺激を引き起こす可能性があり、ピペッティング中にエアロゾルが発生することがあります。エアロゾル発生を避け、可能な限りチューブをキャップし、接触時にはすぐに水ですすいでください。施設の曝露手順と製造元のSDSガイダンスに従います。すべての生物廃棄物(マトリックス含有物質や汚染プラスチックを含む)は、機関のガイドラインに従って処分してください。siRNA電気穿孔については、製造元の電気安全指示に従い、パルス開始前にキュベットが正しく装着され、蓋が完全に閉じられていること、濡れた手袋やこぼれの近くでの操作を避け、デバイスおよび付属品の損傷を点検し、パルス直後にキューベット電極に直接接触しないこと。
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結果
3Dヒト子宮頸オルガノイド培養
新たに分離されたヒトの外胚管組織は、上記の順序で単一細胞に解離され、その後24ウェルの細胞培養挿入物の上にプレートされ、このプロトコルで示されたように子宮頸管オルガノイドを形成するために培養されました(図1)。ヒトの子宮頸部オルガノイドは、単一細胞から2週間かけて直径最大500μmまで成長します(図2A)。オルガノイド生成の成功率は90%を超え(11種類の異なる生検組織から10回)、当プロトコルではオルガノイド形成効率は約40%です。培養日数7日目から10日目にかけて、彼らは玉ねぎの皮のような微細構造の同心円状の層状パターンを示し始めました。これらの微細構造は、分化した上基底細胞と外縁部の基底幹細胞からなるオルガノイドにおける層状扁平上皮の生成を示しています。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色により、オルガノイド内の層状扁平...
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ディスカッション
本稿では、ヒトの頸部オルガノイドの確立および通過のプロトコルを記述しています。また、遺伝的に操作するためのプロトコルも提供しており、子宮頸部生物学と病理学の研究を大きく前進させています。私たちはこのプロトコルをヒト子宮頸部オルガノイド向けに最適化しましたが、わずかな修正を加えれば他のオルガノイド系にも適用可能です。
オルガノイド培養を確立・最適化するための重要な情報には、最小限の成分で最大効率を実現する詳細な培地組成と、最適な酵素と機械的断片化を用いた単細胞解離プロトコルが含まれます。単細胞解離については、ヒト子宮頸部サンプルをディスパーゼ溶液で1時間培養しました。その後、食道および気管組織と同様に、頸部上皮を完全なシートとして剥がしました(図1)12,27。対照的に、他の研究ではハサミで子宮頸部組織を細切にし、コラーゲン酵素溶液で30〜4...
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謝辞
この作業は保健福祉省からの助成金(RS-2024-00439434 for Y. Jeong)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| P4一次細胞4D-ヌクレオフェクターXキット | ロンザ | V4XP-4032 | |
| 96ウェル超低アタッチメントプレート | SPL | 39796 | |
| セルストレーナー40 &マイクロ;m | SPL | 93040 | |
| 50mL円錐形チューブ 500/箱 | SLP | SPL50050 | |
| 15ml円錐管 | サーステット | 62.554.502 | |
| クライオピュアチューブ 1.8mL - 白色 | サーステット | 72.379P | |
| 37 & deg;C、5%のCO2およびnbsp;インキュベーター | エッペンドルフ | 9734IQ905476 | |
| 細胞培養挿入 | SPL | 37024 | |
| Amaxa 4D-核核法器 | ロンザ | AAF-1003X | |
| ブロッキングバッファ(DPBSのBCS2%) | Gibco / ウェルゲン | BCS:26010074;DPBS: LB001-02 | |
| ディスパーズII粉末 | ギブコ | 17105041 | |
| DNAse I | 酵素学 | M059L | |
| マトリゲル | コーニング | 356231 | |
| 赤血球溶解バッファー | ビオセサン | R2015 | |
| TrypLEエクスプレス | ギブコ | 12605 | |
| ウォッシュバッファー(HBSS) | JBI | BL003-1 | |
| 高度なDMEM/F12 | ギブコ | 12634028 | |
| グルタMAXサプリメント | ギブコ | 35050-061 | |
| ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン | バイオウエスト | L0022-100 | |
| ヘペス | ギブコ | 15630-080 | |
| B27サプリメント | ギブコ | 17504044 | |
| ノギン | ペプロテック | 118214 | |
| N-アセチル-L-システイン | シグマ | A9165 | |
| Y-27632 | STEMCELL テクノロジーズ | 72307 | |
| FGF2 | ペプロテック | 100-18B-50UG | |
| FGF7 | ペプロテック | AF-100-19-250UG | |
| A83-01 | セレックケム | S7692 | |
| フォルスコリン | シグマ | F6886 | |
| ニューレグリン1 | ペプロテック | 100-03-50UG | |
| NGF | ペプロテック | AF-450-01-100UG | |
| R-スポンディン | シノバイオロジー | 11083-HNAS | |
| HGF | ペプロテック | 100-39H-250ug | |
| FGF10 | ペプロテック | 100-26 | |
| ペトリディッシュ 35 mm | SPL | 10035 | |
| <ストロング>オルガノイドメディアレシピ<ストロング> | |||
| Name | Company | <ストロング>カタログ番号 | <強力>集中力<強力> |
| 高度なDMEM/F12 | ギブコ | 12634028 | |
| グルタMAXサプリメント | ギブコ | 35050-061 | 1回 |
| ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン | バイオウエスト | L0022-100 | 1回 |
| ヘペス | ギブコ | 15630-080 | 10 mM |
| B27サプリメント | ギブコ | 17504044 | ビタミンAなし 1回 |
| ノギン | ペプロテック | 118214 | 100 ng/ml |
| N-アセチル-L-システイン | シグマ | A9165 | 1 mM |
| Y-27632 | STEMCELL テクノロジーズ | 72307 | 10 uM |
| FGF2 | ペプロテック | 100-18B-50UG | 50 ng/ml |
| FGF7 | ペプロテック | AF-100-19-250UG | 25 ng/ml |
| FGF10 | ペプロテック | 100-26 | 100 ng/ml |
| A83-01 | セレックケム | S7692 | 500 nM |
| フォルスコリン | シグマ | F6886 | 10 & mu;M |
| ニューレグリン1 | ペプロテック | 100-03-50UG | 50 ng/ml |
| NGF | ペプロテック | AF-450-01-100UG | 20 ng/ml |
| R-スポンディン | シノバイオロジー | 11083-HNAS | 100 ng/ml |
| HGF | ペプロテック | 100-39H-250ug | 25 ng/ml |
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