縦断的インピーダンスベースの腫瘍細胞生存可能性測定を用いた連続殺害アッセイ - T細胞の性能を評価する有用な方法

サマリー

本プロトコルは、慢性抗原刺激下でのCAR T細胞の連続殺死能力と持続性を定量化するインピーダンスベースのリアルタイムアッセイを提示し、費用対効果の高いアッセイプレートの再利用のためのプレートウォッシュ法を取り入れています。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)細胞療法は、特定の血液悪性腫瘍の治療に革命をもたらしました。しかし、多くの患者は抗原の喪失、抗原のダウンレギュレーション、またはT細胞の枯渇により再発を経験します。これらの課題は、慢性抗原刺激下でのCAR T細胞の殺菌能力と持続能力を評価する機能的アッセイの必要性を強調しています。連続殺人アッセイは、CAR T細胞が腫瘍標的を繰り返し除去する能力を測定し、CAR T細胞応答の耐久性と強力に関する貴重な洞察を提供します。

ここでは、リアルタイム細胞解析(RTCA)システムを用いてインピーダンスベースのアッセイを提示し、CAR T細胞介在の連続殺人をin vitroで定量化します。腫瘍細胞は繰り返しシードされ、CAR T細胞を指定されたエフェクター対標的(E:T)比で添加する前に、アッセイ特異的Eプレートに付着させます。このプラットフォームはラベルなしで腫瘍細胞の生存能力を継続的に監視し、高い時間分解能で動的細胞毒性を捉えます。コア指標には細胞指数(CI)の動態、腫瘍細胞殺菌率、標的クリアランスまでの時間が含まれます。腫瘍と標的を繰り返し結合した際に観察される殺菌能力の進行性低下は、後天性CAR T細胞機能障害、いわゆるT細胞枯渇のマーカーとなります。これらの指標を組み合わせることで、さまざまなE:T比でのCAR T細胞機能の正確な評価が可能となり、時間経過による異なるCAR T細胞構成や共治療間の直接比較が可能になります。

コスト効率を高めるため、アッセイ性能やデータの完全性を損なうことなくアッセイEプレートを再利用できるプレートウォッシュ手順を開発しました。最適化されたワークフローにより、分析コストを削減しつつ分析の堅牢性を維持します。このアプローチにより、CAR T細胞機能の手頃かつ拡張可能な前臨床評価が可能となり、細胞治療設計の改善を促進します。

概要

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、大型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫1,2,3,4,5など複数の血液悪性腫瘍に対して顕著な臨床的成功を収め、がん免疫療法に革命をもたらしました。最初の規制承認以降、CAR T細胞製品と治療患者数は着実に増加^{しています。}製品の種類や臨床適応によって、典型的な点滴用量は患者1人あたりおよそ2×10 6から5 ×^{10 8}CAR⁺ T細胞までさま^ざまです。高量点滴は効果的な腫瘍除去と長期的な疾患制御のために必要ですが、臨床的および実践的な課題も伴います。細胞数が多いと、サイトカイン放出症候群(CRS)や免疫効果細胞関連神経毒性症候群(ICANS)などの重篤な副作用のリスクが高まる可能性があり、いずれも用量依存的^です。さらに、重度の前処理やリンパ球枯渇患者から機能的なCAR T細胞を十分に製造することは困難であり、治療施設にとっては物流面でもコストがかかること^{もあります。}

これらの課題にもかかわらず、CD19標的型CAR T細胞療法は再発または難治性B細胞悪性腫瘍患者において70%〜90%の完全寛解率を達成し、臨床における画期的な影響を示しています 10,11,12。しかし、CAR T細胞療法には長期的な効果を制限する関連課題があります。主な障害には、抗原の喪失やダウンレギュレーション、CAR T細胞の持続不全、^機能的枯渇などがあります。CAR T細胞の枯渇は、増殖能力の低下、抗腫瘍活性の低下、持続能力の低下を特徴とし、反応不遂および再発の重要な原因^{となります。}疲弊したCAR T細胞は、エフェクター機能の低下、抑制性受容体の持続発現、慢性抗原曝露および免疫抑制性腫瘍微小環境によるサイトカイン産生の不全を伴います¹⁴。臨床研究では、機能的なCAR T細胞の持続性の喪失が再発リスクの増加と関連していることが示されています11,15,16,17。長期間の生体内活性が治療成功の主要な予測因子であるため、CAR T細胞製品の耐久性と持続的な殺菌能力の理解は、前臨床およびトランスレーショナル研究の両方において重要な目標です。特に注目すべきは、CAR T細胞が長期間にわたって腫瘍細胞を繰り返し認識し溶解する能力、いわゆる「連続殺人」である点です。この特性は持続性と消耗耐性の機能的指標を提供します¹⁸。

本記事では、xCELLigenceリアルタイムセル解析(RTCA)インピーダンスプラットフォームを用いた連続殺傷アッセイの詳細なプロトコルを提供し、オプションの洗浄手順を含む、Eプレートと呼ばれるアッセイプレートの再利用を可能にすることで、アッセイ性能を損なうことなくコスト効率を向上させます。このようなプロトコル開発の理由は、従来の細胞毒性アッセイの限界から生まれます。従来の細胞毒性アッセイは通常、静的なエンドポイント表示のみを提供します。クロム51放出、乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイ、フローサイトメトリーベースの生存可能性アッセイなどの一般的なアプローチは、ラベルが必要で、手間集約的なワークフローを伴い、定義された^時間点に限定^{されています。}さらに重要なのは、長時間の刺激や複数回の抗原曝露による動的殺菌動態を容易に捉えられず、これはCAR T細胞の持続性や機能枯渇と直接結びついている状況である¹⁸。

xCELLigence RTCAプラットフォームは、電気インピーダンス²⁰を用いた標的細胞の生存能力をラベル不要でリアルタイムで動態的にモニタリングすることで、これらのギャップを埋めています。付着した腫瘍標的細胞は金のマイクロ電極被覆Eプレートにシードされ、その付着と増殖によって測定されたインピーダンス(細胞指数(CI)²¹として報告されます。CAR T媒介による殺菌後、標的細胞は殺され剥離され、インピーダンス²⁰が急激に低下します。このリアルタイムの読み取りにより、追加のラベルや試薬を必要とせずに、数時間から数日にわたって細胞毒性の継続的な評価が可能です²²。CAR T細胞は非接着であるためインピーダンス信号に寄与せず、エフェクターとターゲットの読み取りをクリーンに分離できます^。データは継続的に記録されるため、研究者はCAR T細胞を繰り返し移植し新鮮な腫瘍標的細胞に曝露する多輪刺激プロトコルを実施し、殺菌能力の進化を直接測定^{できます。}これはCAR T細胞が生 体内 で繰り返される抗原遭遇を模倣し、細胞毒性能力の機能的読み取りを提供します。

このインピーダンスベースの連続殺人アッセイは、前臨床環境でCAR T細胞の機能を評価する研究者、例えば構成概念の最適化、機能比較、ポテンシー試験などに最適です。このプロトコルにはxCELLigence RTCAシステムとE-Plate 96の使用が必要です。付着型腫瘍モデルに広く適用可能ですが、固定や結合戦略なしの懸濁培養には直接適していません。インピーダンス測定だけでは標的細胞の準拠と生存可能性のみを反映するため、CAR T細胞の活性化、増殖、枯渇動態を完全に特徴づけるためには、フローサイトメトリーやサイトカインアッセイなどの補完解析が推奨されます。プロトコルには、これらの追加測定のために細胞や上清液の採取を可能にする指定された手順が含まれており、CAR T細胞の機能をより包括的に評価することを可能にします。

プロトコル

注:このプロトコルはE-Plate 96向けに最適化されており、xCELLigence RTCAシステムが必要です。付着した腫瘍細胞は、CAR T細胞追加時に対数成長相に達するために、一晩かけてシードされます。腫瘍細胞株や種子密度によっては、この間隔を6〜9時間に短縮し、同日のエフェクター追加が可能です。後者のワークフローが実行されると、プロトコルで記載された日ごとの名目上のタイムラインが変更され、ユーザーはそれに応じてスケジュールを調整しなければなりません。共培養は48時間維持され、その後CAR T細胞を新たにプレートした腫瘍細胞に移す必要があり、xCELLigence機器上で2つのプレート位置を行い、腫瘍細胞のプレートとエフェクターの追加を交互に行います。CAR T細胞は、機関の標準作業手順(SOP)または確立されたプロトコルに従って生成されるべきです。簡単に言えば、末梢血T細胞は承認された倫理基準のもとで単離され、適切なバイオセーフティ条件下で導入され、フローサイトメトリーまたは同等のQCアッセイでトランスダクションの効率と生存可能性が評価されます。CARトランスダクション効率が20%未満の場合は、効率が低下すると未遺伝子導入細胞による背景殺死や非特異的殺菌の増加が起こり、腫瘍の成長曲線が歪む可能性があるため、xCELLigenceアッセイは実施すべきではありません。すべての細胞取り扱いは、層流フード内の無菌条件下で行うべきです。培地は検査室の標準に従うか、供給者の推奨に従って使用することができます。特に指定がない限り、細胞は37°Cの加湿大気で5%のCO₂を含んで培養されます。CAR T細胞に最適化されていますが、この方法は他の懸濁エフェクター細胞や接着標的にも適用可能です。

1. 準備とブランキング(1日目)

1. プレート準備
   1. Eプレート96の各ウェルの底に50μLの腫瘍培地を加えます。
      注:井戸の底を傷つけないよう注意してください。これはプレートを傷つける恐れがあります。
   2. Eプレートをインキュベーターに入れ、測定用の同じ機械スロットに位置します。
   3. Eプレートを37°Cで30分間培養し、適切なアッセイ温度とpHに合わせます。
2. 計器のセットアップ
   1. その間に RTCA Software Pro (バージョン2.6.1)を起動し、実験を保存するファイルパスを選択してください。
   2. 「RTCAオペレーター」欄に実験名を入力して保存してください。
   3. 測定する井戸を選択します。
   4. セル名はセルタブで、処理タイプは処理タブで割り当てます。
3. 測定スケジュール
   1. 以下のステップでスケジュールを設定しましょう:
      ステップ名 = 空白 ;スイープ数 = 1 ;区間 = 1 ;持続時間 = 0:00
      ステップ名 = 腫瘍細胞 ;スイープ数 = 250-300;インターバル=15分;持続時間 = 最低24時間
      ステップ名= 治療; スイープ=最大2500;インターバル=5分;所要時間 = 最低72時間
   2. 「適用」を押して、どのステップにも自動が選択されていないことを確認してください。
4. ブランキングステップ
   1. Eプレートを37°Cで30分間インキュベーションした後、 PLAY/RUN を押してブランクステップを開始します。
   2. ソフトウェアがステップを 完了(DONE )とマークするまで待ちます(約1〜2分)。
   3. 細胞シーディングを始める準備ができたときだけ、クレードルを解除し、Eプレートを取り外してください。

2. ラウンド1:腫瘍細胞シーディング(1日目)

1. 腫瘍細胞のシーディング
   1. 各ウェルごとに適切な培地50μLに腫瘍細胞を懸液液で準備します。
   2. インキュベーターからEプレートを取り出し、細胞を三つに分けて種まけます。
2. 開始測定
   1. すぐにEプレートを機械に戻し、クレードルをロックしてください。
   2. 最初の測定の5〜10分前にEプレートの温度とpHを均等にし、その後 PLAY/RUN ボタンを押して測定を開始します(スケジュールのステップ2= 腫瘍細胞)。
   3. 細胞の付着を促すためにEプレートを一晩培養してください。正規化されていない細胞指数(CI)を監視してください。CIがログ相成長段階に入ったら、次のステップに進みます。この段階は使用する細胞株に依存し、シードされた細胞の数によって影響を受けることがあります。BxPC3セル(ATCC CRL-1687)は1ウェルあたり20,000セルでシードされ、ログフェーズ成長は通常6〜18時間後に到達しました。

3. ラウンド1:CAR T細胞治療(2日目)

1. T細胞の調製とシード
   1. 膨張サイトカインを含まないヒトT培地(例:IL-2、IL-7、IL-15など)で、100 μL/ウェルで必要な数のCAR T細胞を準備します。
      注:CARトランスダクション効率は実験開始時に一度測定されます。望ましいエフェクター対標的(E:T)比は、最初にプレートされた腫瘍細胞に対するCAR⁺ T細胞の数に基づいて設定されます。例えば、50%のCAR⁺T細胞と20,000個のBxPC3腫瘍細胞で1:1のE:T比率の場合、合計40,000個のT細胞をプレート付けする必要があります。したがって、E:T比は連続殺人アッセイ開始時の初期条件を指します。追加の測定が行われない限り、後のラウンドでのE:Tの変化は不明のままです。T細胞の増殖や生存率の変化、すなわちE:T比の変化も連続殺人データの指標の一部とみなされます。Tセルがラウンドごとに分割されている場合、E:Tは比例して再計算されます(例:ラウンド3後に1:1分割すると、最初の2:1のE:Tはラウンド4では1:1に減ります)。ラウンド間のE:Tダイナミクスに関心がある場合は、CAR %やエフェクター機能の中間測定のためにオプションの追加ウェルをメッキすることも可能です。磁気分離によって抗CD3/CD28 T細胞刺激ビーズを除去することで、非特異的な殺菌を減らすことができます。また、T細胞は刺激後5日から20日の間(通常は対数成長期)に使用し、細胞をサイトカインで増殖させるのがアッセイの前日ではなく少なくとも2日前に行うことが推奨されます。
   2. トランスダクション効率解析に基づき、未トランスデューションT細胞と混合して、実験群間のCARトランスダクション効率を最低共通パーセンテージに調整します。
      注意:すべての基が同じトランスダクション効率を持つ場合は調整は不要です。CAR⁺の割合が異なる場合、プレートを塗るT細胞の数が計算され、各グループは同じ実効数のCAR⁺細胞とCAR^細胞 から開始します。これは、E:T比と腫瘍シーディングに基づく目的のCAR⁺細胞数を100倍にし、各グループごとに測定されたCAR⁺パーセントで割り、必要に応じて未遺伝子導入のT細胞を追加して総T細胞数に一致させることで行われます。例えば、あるグループが50%のCAR⁺ T細胞を持つ場合、40,000個のT細胞がプレート化されます(20,000 CAR⁺ + 20,000 CAR^-)。一方、60%のCAR⁺細胞を持つグループは33,333個のT細胞をプレート化して20,000個のCAR⁺細胞を提供し、最初のグループの合計40,000個のT細胞数に合わせるために6,667個の未移植T細胞を追加します。
   3. 必要に応じて、サイトカインや化合物処理を検討する場合は、ヒトT細胞培地と目的のサイトカインまたは化合物を最終濃度の11倍で20μL加えます。この容量は、各ウェルにすでに存在する標準の200μL(ブランキング用50μL、腫瘍細胞シーディング用50μL、T細胞増殖用最大100μL)に加えられます。メーカーによると、E-Plate 96は1井戸あたり最大243 μL±5 μLの容量をサポートしており、このようなオプション処理としては220 μLの容積が許容範囲内です。
2. T細胞のシーディングと測定
   1. Tセルを追加する準備ができたときだけ、クレードルを解除してEプレートを外してください。
   2. 種子処理T細胞は腫瘍細胞に直接付着します。
   3. クレードルを測定装置内にロックし、RTCAソフトウェアでステップ2を中止します。
      注意:ステップ2が中止されない場合、システムは前のステップの測定を続け、そのステップが完了するまで停止しないため、データポイントが失われます。
   4. ステップ2が 完了とマークされるまで待ちましょう。
   5. 再生 /実行 ボタンをクリックしてステップ3(治療)を開始し、 OKをクリックしてプロンプトを確認しましょう。
      注意:取り扱い後(例:シードや細胞移植後)に15〜30分間の平衡期間を設けてから次の測定ステップ(ステップ3.2.5の前)を始めることで、成長曲線の温度やpH変動による初期の偏向を最小限に抑えることができます。

4. ラウンド2:腫瘍細胞シーディング(3日目)

1. ステップ1.1および1.4で説明されている新しい96ウェルのxCELLigence Eプレートを準備します。
2. ステップ2で説明した通り、新鮮な腫瘍細胞に種をまきます。
3. 細胞の付着を促すためにEプレートを一晩培養してください。

5. ラウンド2:CAR T細胞を2つ目のEプレートに移す(4日目)

1. 各ウェルの内容物を多チャネルピペットを用いてU型底96ウェルプレートの対応するウェルに移します。Eプレートの下部の電極には触れないように注意してください。
2. 室温で遠心分離機で400 g ×5分間加熱します。
3. 上澄液を慎重に吸引し、必要に応じて酵素結合免疫吸着検査(ELISA)のために保持してください。
4. 細胞ペレットを膨張サイトカインなしの新鮮培地100μLに再懸濁させます。
   注意(任意):T細胞は分割可能(例:50 μL = 1:2分割)し、フローサイトメトリーなどのさらなる解析に利用可能です。XCELLigence殺菌アッセイ中のT細胞の分裂は増殖を調整します。疲労が明らかになるまでのサイクル数を減らすのに役立ちます。2と4の割り比をテストすることが推奨されます。
5. 2回目の腫瘍Eプレートに100μL/ウェルT細胞を追加し(1:2分割時は50μL)、培地および該当する場合はサイトカイン/化合物が完全に補充されるようにします。

   

6. 連続殺人検査の継続(5日目から10日目以降)

1. 48時間間隔で追加ラウンドを行って、48時間間隔で追加で4番と5番を繰り返します。
2. xCELLigenceの読み取りやELISAやフローサイトメトリーなどの補助アッセイを用いて各段階で殺菌活性とT細胞の持続を監視します。

7. データ収集およびEプレート取り扱い

1. 希望の測定時間が終わったら、ソフトウェアで STOP ボタンを押します。
2. エフェクターセル付加時点に正規化され、非平均化されて解析ソフトウェア(R、GraphPad Prism など)で正確な平均±SEMプロットを図るためのエクスポートデータ。必要に応じて平均されたデータセットをエクスポートしてください。
3. Eプレートのロック解除と取り外してください。実験をソフトウェアでリリースしてください。
4. 追加解析(例:ELISA用の上清液やフローサイトメトリー用の細胞採取)のために、Eプレートを洗浄またはインキュベーターで保管してください。

8. オプション:再利用用のEプレート洗浄

注:この任意のステップにより、xCELLigence E-plateの再利用が可能となり、実験コストを削減できます。再利用は、Eプレートの電気的特性が実験を通じて安定し、個々の井戸が許容基準範囲内に入るまで維持される場合にのみ推奨されます。特に水酸化ナトリウム(NaOH)を取り扱う際は、すべての安全手順を守ってください。洗車後にEプレートを目視で点検し、電極の潜在的な故障を検出してください。

1. Eプレートの底面に触れずに、Eプレートの中身をすべて廃棄してください。
2. 各井戸を200μLの脱イオン水で3回洗浄します。
3. 各ウェルに0.1 M NaOHを200 μL加えます。
   注意:NaOHは腐食性があります。地域の安全ガイドラインを遵守していることを確認してください。手袋、コート、安全ゴーグルを着用してください。安全キャビネットに1MのNaOHを扱います。NaOHの廃棄物は水を流しながらシンクに捨てて、適切な希釈を確保しましょう。濃縮酸と塩基を混ぜてはいけません。酸に水を加えないでください。酸から水への反応だけです。
4. Eプレートは室温で5分間孵化します。
5. 各井戸を脱イオン水で少なくとも3回洗浄し、残留NaOHをすべて除去してください。
6. Eプレートをティッシュで軽く叩いて乾かし、その後自然乾燥させます。
7. バイオセーフティキャビネット内またはUV照射装置内で、少なくとも1時間UV光の下でEプレートを滅菌してください。
   注意:Eプレートは井戸が真上を向くように位置してください。UVライトはプラスチックウェルの底を通しません。

結果

プロトコルの成功裏の実行により、腫瘍細胞の生存率およびCAR T細胞の細胞毒性を時間経過とともに反映する再現可能なインピーダンスベースの読み取り結果が得られます。細胞増殖および細胞毒性は市販のRTCAシステムを用いて評価されました。データは正規化セル指数(NCI)として表され、各時点のCIを選択した正規化時刻のCIで割って計算されました。正規化時間はエフェクタセルの追加直前に設定されます。クリアランスまでの時間は、エフェクタ添加後にNCIがゼロになるまでの区間として定義されます。NCIはRTCAソフトウェアによって計算され、GraphPad Prismなどの統計ソフトウェアを使って、殺菌率やクリアランスまでの時間などのさらなる解析のためにエクスポートできます。細胞毒性の動態を可視化するために代表的なNCI曲線が作成されました。計算原理の詳細は^{他の場所で}入手可能です。

代表的な実験では、第二世代CARと追加のキメラ性サイトカイン受容体(CCR)を組み合わせたCAR T細胞が、BxPC-3膵臓がん細胞と共培養した際、複数ラウンドの腫瘍挑戦...

ディスカッション

本プロトコルは、xCELLigence RTCAプラットフォームを用いて、複数回の抗原曝露におけるCAR T細胞介在細胞傷害を評価する方法を記述しています。インピーダンスによる腫瘍細胞の生存可能性の縦断的測定を可能にすることで、このアプローチは反復的な細胞毒性応答(連続殺害と呼ばれる)をラベルなしで連続的な形式で捉えます。このプロトコルは、連続する腫瘍細胞の再挑戦に応じてT細胞エフェクター機能がどのように変化するかを監視し、機能持続性、早期消耗、全体的な殺菌動態などのパラメータに関する洞察を提供します(図1)。

再現性とデータの品質を確保するためには、いくつかの手続き的側面が重要です。まず、井戸内でのピペッティングは、井戸底部の微小電極表面を損傷しないよう慎重に行う必要があります。次に、ブランキングステップは電気的な基準を確立し、セル添加前に機能しない井戸を特定します。ブランキング中に追加のウェルを含めることが推奨されます。なぜなら、不安定なインピーダンス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BxPC3	ATCC	CRL-1687
Eプレート96	アジレント	300600910
RTCAソフトウェアPro(Basic)	アジレント	該当なし	バージョン 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (複数プレート)	アジレント	該当なし