MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

サマリー

本記事では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてSARS-CoV-2疑似型粒子を生成する方法論と、それを用いたエントリー阻害剤の同定について説明しています。これらのプロトコルは、組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質と小分子化合物アルビドールという2種類のエントリー阻害剤を用いて実証されています。

要約

SARS-CoV-2ウイルスは、2019年の出現以来、世界中で多大な病気と死亡の負担をもたらしてきた新興の人獣共患病原体です。ウイルスの侵入や潜在的な抗ウイルス化合物を評価するための安全でアクセスしやすいプラットフォームは、新興変異株に対する継続的な創薬に不可欠です。本記事では、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現しルシフェラーゼレポーター遺伝子を持ったマウス白血病ウイルス(MLV)ベースの擬似型粒子を生成する高度に最適化されたプロトコルを説明し、バイオセーフティレベル2条件下でのウイルス侵入の研究を可能にします。記述された方法は、最適化された細胞株の使用、コスト効率の高い試薬を用いた高いトランスフェクション効率、高効果な偽ウイルスの生成、感染力の滴定によるスクリーニングアッセイの最小ウイルス入力を決定する方法を詳細に示しています。代表的な結果は、感染細胞で非感染対照群と比較して強健なルシフェラーゼ活性を示し、対照のスパイクレスおよびVSV-G偽ウイルスはアッセイ特異性を裏付けています。さらに、このシステムはウイルス侵入に対する抑制効果の定量化やMTT生存可能性アッセイを用いた細胞毒性の評価を通じて、化合物スクリーニングを支援します。総じて、この再現可能かつ拡張可能なプロトコルは、新規ウイルス侵入阻害薬の中〜高スループットスクリーニングの信頼できるプラットフォームを提供し、抗ウイルス候補の同定やSARS-CoV-2の侵入メカニズム研究の進展に貢献しています。

概要

2019年末に発生した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、世界的なパンデミックを引き起こし、世界中で数百万人が死亡しました。また、感染力や免疫逃避の可能性を高める新たな変異株によって脅威となり続けています^。SARS-CoV-2はコロナウイルス科の包膜付きRNAウイルスであり、三量体スパイク(S)糖タンパク質を利用して、アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)受容体に結合し、TMPRSS2および他の宿主プロテアーゼ^2,3によるプロテオリシス活性化を受けることで宿主細胞への侵入を媒介します。COVID-19症状を管理するためにいくつかの治療法が開発されていますが、ウイルス変異株の継続的な進化と急速な発生は、ウイルスの侵入を研究し、感染初期段階を標的とした新しい抗ウイルス化合物を評価するための安全かつ拡張可能なシステムの緊急性を浮き彫りに^{しています。}

SARS-CoV-2ウイルスは、その高い感染可能性のため、一部の^{地域でバイオ}セーフティレベル3の病原体5に分類されています。したがって、再現実験室の作業には高封じ込めBSL-3施設が必要であり、このウイルスを用いた科学研究の多くの研究室が困難になっています。疑似型ウイルスベースのシステム(偽ウイルス(PVs)とも呼ばれるシステムは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)研究所でのウイルス侵入研究を可能にする実用的な代替手段を提供し、世界的な研究活動のアクセス拡大を図ります⁶。SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つ擬似型粒子は複製性がなく、ウイルスの侵入評価や小分子阻害剤のスクリーニングに安全な代替物として機能^{します7。}これらの粒子はルシフェラーゼや蛍光リポーター遺伝子を搭載するように設計され、感染細胞内のリポーターシグナルを測定することで感染を迅速かつ定量的に検出することが可能です。マウス白血病ウイルス(MLV)またはレンチウイルスの骨格を基盤としたシステムは、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、エボラウイルスなどの感染解析に広く用い^{られています。}

これらのプロトコルでは、MilletとWhittaker⁸の報告に基づき、3プラスミド系を用いたMLVベースのPV生成を記述します。使用されたプラスミドには、MLVコア遺伝子gag-pol(pCMV-MLVgagpol)をコードするパッケージングプラスミド、リポーター遺伝子ルシフェラーゼをコードするトランスファーベクター(pTG-Luc)、そして元の武漢Hu-1変異に対応するSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質を発現するプラスミドが含まれます。さらに、偽ウイルスは水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV-G)を用いて生成され、後に潜在的なヒットの対比スクリーニングとして利用されます。偽ウイルスはHEK293由来細胞で産生され、hACE2およびTMPRSS2を安定的に発現する感受性の高い細胞への感染に用いられます。トランスフェクション効率はまず緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドを用いて評価されます。その後、最適化されたトランスフェクション条件を用いて、これら3つのプラスミドを共トランスフェクトし、その後得られたウイルスの滴定によってPVが生成されます。適切な量のPVを用いて、96ウェルプレートでウイルスの侵入を阻害できる化合物をスクリーニングするためにアッセイが行われます。このプロトコルは分岐ポリエチレンニミン(PEI)をコスト効率の良いトランスフェクション試薬として利用し、手順の実装を容易にします。

プロトコル

1. 分枝ポリエチレンインミン(PEI)を用いたHEK293T由来細胞の高効率トランスフェクション

注意:バイオセーフティキャビネット内のすべての工程は標準的な無菌技術およびBSL-2手順を用いて実施してください。HEK293T由来細胞を用いてトランスフェクションおよび偽型ウイルスの生成を行います。この方法では細胞を培養処理した6ウェルプレートにトランスフェクトします。PEIストック溶液は、Yangら(2017^{)によって}以前に説明された通りに調製されます。偽ウイルスを生成するためのトリプルトランスフェクションを行う前に、高いトランスフェクション効率(70〜80%以上)を確保するために、最適なPEIプラスミドDNA比率を最適化することが望ましいです。この最適化は、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドのトランスフェクションを行い、その後蛍光顕微鏡で蛍光細胞の割合を確認することで行われます。この最適化のために、プラスミドDNAを1ウェルあたり2.5 μgに一定に保ち、1〜20 μLの範囲で複数のPEIを検査します。以下は、これらのロット細胞とPEIに最適な条件です。6ウェルプレート上で、1ウェルごとに5μLのPEIストック溶液(1 mg/mL)と2.5 μgのGFP発現プラスミドを1ウェルに置きます。

1. 6ウェルの組織培養プレートに7.5 x 10⁵ 個のHEK293由来細胞を、全培地(DMEM-C:Dulbecco's Modified Eagle's Mediumに10%熱不活化胎児用牛血清(FBS)、20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエタネスルホン酸(HEPES)、100 IU/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を1ウェルあたり2mLの種子。
   注意:細胞シーディング時には、組織培養板を円を描くように動かさないようにしてください。これはウェルの中心部で細胞凝集を引き起こし、細胞分布の不規則さを引き起こし、結果的にトランスフェクション効率の低下につながる可能性があります。6ウェルプレート1枚で1つの実験に十分で、そのうち1つは細胞対照(非形質染色済み)として、残りのプレートは複数のPEIプラスミドDNAの検査用です。
2. 細胞を37°Cで5%のCO₂で一晩培養します。翌日、セル同士が約50〜60%の合流率であることを確認してください。
3. トランスフェクション当日には、無菌の1.5mLマイクロ遠心分離チューブでPEIプラスミドDNA複合体を準備します。
   1. 各ウェルごとに、50μLの還元血清培地に5μLのPEIストック(1 mg/mL)を含むPEI溶液チューブと、同じ培地の50 μLに2.5 μgのGFP発現プラスミドを含むDNA溶液チューブを1本準備します。
   2. 複数の井戸をトランスフェクトする場合は、それに応じて溶液のスケールアップが可能です。各チューブを渦で短く混ぜて5秒間回転させます。チューブは室温(RT)で10分間培養します。
4. このインキュベーション中は、6ウェルプレートの各ウェルから培地を慎重に取り出し、細胞単一層の破壊を防ぎます。1mLの完全トランスフェクション培地(DMEM-T、DMEM-Cと同じですが抗生物質なし)に慎重に置き換えてください。
5. トランスフェクション複合体を準備しろ。10分間の培養後、50μlのDNA溶液チューブをPEI溶液チューブに加えます。ピペットで上下に6回素早く混ぜ、RTで正確に3分間培養します。直ちに各対応する井戸のセルに複素をドロップごとに加えていきます。
6. プレートの縁をパラフィルムと遠心分離機で1,000 x g で30分間、ブレーキなしでRTでスイングローターとプレートバケットを使い、密封します。
7. 遠心分離後、パラフィルムを優しく除去し、37°C、5% CO₂で3時間培養します。
8. インキュベーション後、各ウェルからトランスフェクション培地を優しく取り出し、1ウェルあたり2mLの予熱済みDMEM-Cをゆっくりと入れ替えます。
9. 37°Cで5%のCO₂を含んで48時間培養します。
10. 蛍光顕微鏡を用いてGFP発現によるトランスフェクション効率を評価する。蛍光細胞の周波数は70〜80%以上であるべきです(図1)。これはセクション2の次の手法の効率性にとって非常に重要です。

2. SARS-CoV-2スパイク型およびVSV-G偽型偽ウイルス粒子の生成

注:この方法はセクション1と同じ手順を用いていますが、GFPプラスミドの代わりに、偽型ウイルスを生成するために必要な3つのプラスミドと共トランスフェクトし、最適なトランスフェクション条件で高いトランスフェクション効率を確保します。また、プロトコルは6ウェルプレートのHEK293T 6ウェル由来細胞を使用し、以下の3つの条件を満たすのに十分です:a) 非トランスフェクト細胞(1ウェル)、b) MLVパッケージングプラスミドとルシフェラーゼリポータートランスファーベクターのみを用いた細胞(1ウェル、スパイクレス偽ウイルス)、c) これら2つのプラスミドとスパイク発現プラスミドをトランスフェクトしてSARS-CoV-2疑似型ウイルスを生成する細胞(4ウェル)。ここで使用されたスパイク発現プラスミドはSARS-CoV-2武漢株のスパイクをコードし、PVsでタンパク質を効率的に提示できるように配列修飾を含んでいます。スパイクレス偽ウイルスは、感染後の段階で、許容細胞へのスパイク依存性の侵入を検証するためにコントロールとして必要となる。同様に、VSV-G-PVは同じ実験設計を用いて生成され、後に潜在的な阻害化合物の対策スクリーニングとして使用されます。より大きな偽ウイルスの体積が必要な場合は、プロトコルを6ウェルプレート2枚に拡大することもでき、これはプレート遠心分離にも実用的である可能性があります。

1. トランスフェクションの前日に、第1節で説明した通り、2つの6ウェルプレートに、由来HEK293T細胞をシードします。一方のプレートはスパイク-PV生成用に、もう一方はVSV-G-PV用に使います。
2. トランスフェクション当日には、 表1に示されたようにステップ1.3に従ってトランスフェクションミックスを準備します。
   注:PEI溶液は^{以前報告された}通りに調製されています。pCMV-MLVgagpolおよびpTG-LucのプラスミドはMilletとWhittaker⁸から取得されました。プラスミドpVSV-GはGeeら(2020年)¹³ページから取得されました。すべてのプラスミドは、エンドトキシンを含まない高品質なプレップとして事前に準備されるべきです。市販のmaxiprepキットを使用することが推奨されており、最後に低結合の0.2μmシリンジフィルターによる滅菌ろ過が行われます。
3. セクション1で説明した通りに各チューブを混合し、RTで10分間培養します。
4. この培養中は、6ウェルプレートの各ウェルから培地を慎重に取り出し、細胞単分子層の破壊を防ぎます。各ウェルに予熱済みのDMEM-T培地1mLをゆっくりと入れ替え、培地がウェルの壁に沿って流れ、直接細胞に当たらないようにします。
5. セクション1で説明したトランスフェクション複合体を準備し、前述のプロトコルを用いて細胞をトランスフェクトします。
6. トランスフェクション後の48時間の培養後、上清液を採取し、50mLの無菌円錐形遠心分離機チューブに移し、290 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 細胞フリーの上清液を採取し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)無菌0.45μmのトップボトルフィルターユニットでろ過します。1 mLのアリコートを準備し、-80°Cで保存します。
   注:擬似型粒子は数か月間-80°Cで安定しています。感染力を保つために、繰り返しの凍結・融解サイクルは避けてください。

	SARS-CoV-2スパイクPV(井戸ごとの数値)について	VSV-G-PV(井戸ごと)について	スパイクレスPV(井戸ごとの)について
PEIの解決策:
PEI(1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
還元血清培地	45 μL	45 μL	45 μL
プラスミドDNA溶液:2
pCMV-MLVgagpol	0.79μg	0.79μg	0.79μg
pTG-luc	0.92μg	0.92μg	0.92μg
pUNO1スパイク	0.79μg	-	-
pVSV-G	-	0.79μg	-
還元血清培地	50μLまで	50μLまで	50μLまで

表1:PV生成のためのトランスフェクション混合物の調製。

3. SARS-CoV-2およびVSV-G偽型粒子の滴定

注:このステップは、生成された偽型粒子が感染性であることを確認し、化合物スクリーニングなどの後続用途に必要な最小有効体積を決定するために不可欠です。この滴定は、新しい偽ウイルスのバッチごとに行うべきです。この目的のために、SARS-CoV-2感染に非常に感受性の高い細胞(HSI細胞)には、偽型ウイルスの量が減少して感染します。スパイク-ヒトACE2相互作用やVSV-Gと他の細胞受容体による偽ウイルスの侵入は、72時間後にルシフェラーゼ活性を検出することで発光アッセイで監視されます。

1. トランスデュクション前日に、96ウェルの組織培養プレート上で50μLの完全培地(DMEM-C)に2.5×10個^のHSI 細胞を1ウェルあたりシードします。検査用の偽ウイルス量ごとに3つのウェルを用意し、感染用のウェル、スパイクレス偽ウイルス、非感染細胞用のウェルも含めてください。プレートを37°Cで5%のCO₂で一晩培養します。
2. 転用当日には、各偽ウイルスバッチのアリコートを1つ解凍し、氷でテストし、逆転で優しく混合します。スパイクレスコントロールのアリコートも1つ含めてください。各井戸に直接偽ウイルス製剤(100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8μL)を加えます。DMEM-Cで全井戸の体積を150μLに調整してください。
3. プレートをパラフィルムで密封し、遠心分離機で2,500× g で45分間RTで、ブレーキなしで密封します。
4. パラフィルムシールを外し、37°C、5%のCO₂で72時間培養します。
5. 培養後は製造元の指示に従ってルシフェラーゼアッセイの準備をしてください。ルシフェラーゼ基質(-80°Cで保存)と5倍ルシフェラーゼアッセイ溶解バッファー(-20°Cで保存)を解凍し、RT(10-15分)で平衡化します。
6. ルシフェラーゼアッセイ溶解バッファーを滅菌水で1倍に希釈します。最低3mLを準備してください。
7. 各ウェルの上清液を多チャンネルピペットでゆっくり慎重に吸引し、排出します。
8. マルチチャネルピペットを使って各ウェルに1x溶解バッファー30μLを加えます。プレートを150回転/分のプレートシェーカーに10分間、RTで置きます。倒立顕微鏡で完全な溶解を確認します(すべての細胞は溶解しており、肉眼検査では区別できない状態です)。
   注意:基板添加直後にマイクロプレートリーダーを準備し、一貫性を確保し信号減衰を防ぐために、すぐに発光検出を行うようにしてください。
9. 溶解液を不透明な白色の96ウェルプレートに移します。
10. 各ウェルに50μLのルシフェラーゼ基質を加え、プレートを円を描くように動かして短時間混合します。プレートをルミノメーターに入れて発光を測定します。
11. 得られたデータを分析してください。
    1. 制御系が期待される発光値を与えるか確認してください。感染していない細胞が非常に低い背景発光値を示すことを確認してください。
       注:スパイクなし偽ウイルスに感染した細胞は、感染していない細胞レベルの値を示すべきであり、スパイク提示性偽ウイルスの量が減少する細胞は、線量依存の高い発光値を示すべきです(図2)。VSV-G-PVによって生成される発光値は、スパイクPVよりも通常、約1〜2桁の高くなります。
    2. その後のスクリーニングでは、感染していない細胞の少なくとも100倍から1000倍のシグナルを生成する偽ウイルスの量を選択します。

4. スパイク-PVを用いた偽ウイルス侵入阻害の化合物スクリーニング

1. 第3節で説明した通り、50μLの完全培地(DMEM-C)に1ウェルあたり2.5×10個^のHSI 細胞をシードしました。37°C、CO₂5%で一晩培養します。
   1. 化合物と偽ウイルスの1列から11列、対照群12列を含むプレート設計を考えます。12列では、ウイルス制御(偽ウイルスのみ)に4つのウェル、未感染・未処理の細胞に4つのウェルを割り当てます。
2. 翌日、試験対象化合物の連続希釈(1:3)を、50μM(感染時の最終濃度:50、16.6、5.5、1.8、0.6、0.2、0.06μM)からDMEM-C(0.5%DMSOを含む)で準備します。
   1. 便宜のため、希釈は別の96ウェルの「希釈プレート」で準備し、まず連続希釈を行い、その後細胞を含むプレートに50μLの移送を行います。
   2. 化合物の数が非常に多い場合、数百点以上の場合、この最初の希釈系列を約4ポイントに減らし、各希釈点に1つのウェルを使い、プレスクリーニングを検討します。次に、同じ濃度50μMから開始し、3回の複製で7点連続希釈(1:3)でポテンシャルヒットを再テストします。
3. 化合物の希釈が準備できたら、マルチチャネルピペットで細胞培地を優しく吸引し、対応するウェルに50μLの化合物希釈を加えます。37°C、CO₂5%で1時間培養します。12列のコントロールはDMEM-Cのみを追加してください。
4. 化合物を除去せずに、各井戸に50μLの完全な培地中に、同じ濃度の化合物を含む偽型SARS-CoV-2偽ウイルスを各井戸に加えます。プレートをパラフィルムで密封してください。
5. プレートを2,500 × g でブレーキなしで45分間RTで遠心分離し、その後パラフィルムを除去して37°C、5%_CO2 で72時間培養します。
6. 第3節で説明したルシフェラーゼベースの感染性定量を進めてください。
7. データ分析を行う。
   1. ルネッセンス値をスプレッドシートにエクスポートし、データをフォーマットして後続のデータ分析やグラフ作成ソフトに取り込むことができます。
   2. 各濃度点の平均値と平均バーの標準誤差をプロットした棒グラフを準備します。また、陽性(PV単独)および陰性対照(非感染細胞)から得られた値もプロットします。
      注:アッセイ結果は、1) 感染していない細胞で非常に低い値を示し、2) PV対照群が高い値を示し、3) 阻害(すなわちアルビドールまたはhACE2-Fc)が用量依存的に感染抑制を示す陽性コントロールを示す場合に有効とみなされます(図3A, B)。
   3. 次に、未知の化合物が生じる値を観察し、阻害があるかどうか、そして用量依存的な効果があるかどうかを判断します。もしそうなら、これらの化合物にさらなる確認的分析を加えます。
      注意:潜在的なヒットのさらなる確認については、次の手順に従ってください。まず、ステップ4.2で提案されたように潜在的なヒット化合物を再テストします。線量反応効果が確認された場合は、同じ希釈系列を用いてVSV-G-PVsを感染させたカウンタースクリーニングを実施します。この検査は、侵入阻害がスパイク-ACE2相互作用に特異的であるか、感染細胞内でルシフェラーゼ産生の後の段階での干渉によるものではないかを確認するために重要です(図3A, B)。ここで陽性化合物はVSV-G-PVに対して阻害活性を示すべきではありません。もしそうであれば、同じ濃度の濃度を細胞生存性アッセイ(MTTアッセイ、セクション5に示す)を用いて細胞毒性を検査すべきです。まとめると、潜在的なヒット化合物はSARS-CoV-2スパイク-PVの阻害を示し、VSV-G-PVsの阻害は全くないか、あるいはより弱い、細胞の生存能力の阻害はないか、少なくともかなり弱いものであるべきです。発光データを用いて線量応答曲線を調整することで、PVの阻害に対する半最大阻害濃度(IC₅₀)と生存可能性アッセイから半最大細胞毒性濃度(CC₅₀)を推定できます。CC₅₀ / IC₅₀ の比率は選択性指数(SI)を計算するために用いられ、これは正の化合物の潜在的な有用性を示す重要な指標です。線量反応曲線の解析およびIC₅₀ およびCC₅₀ の推定のために、非常に詳細な手順^{が記載されています}。

5. MTTベースの細胞生存能力アッセイ

1. 96ウェルプレートのDMEM-Cを50μLで、1ウェルあたり2.5×10個^のHSI セルをシードします。プレートを37°C、CO₂5%で一晩培養します。翌日には細胞の合流率が約50%であることを確認してください。評価対象の化合物の濃度を考慮し、未処理の細胞、培地のみを含むブランクウェルを三重に準備します。PVエントリー阻害アッセイで評価された濃度と同じ濃度で潜在的なヒット化合物をテストします。
2. インキュベーション後、培地を慎重に取り出し、異なる濃度の化合物を含む100μLの完全な培地(0.5% DMSOで評価)に置き換えます。
3. 2,500 × g で45分間、ブレーキなしでRTで遠心分離し、37°C、5% CO₂で72時間培養します。このステップは、前節で行った通りセルを扱うためのもので、PVの追加を除きます。
4. DMEMを用いて0.5 mg/mLのMTT溶液を準備します。0.2μmのフィルターを通して滅菌し、暗闇で保ちます。
   注:3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム臭化物(MTT)は光に敏感です。暗闇の中で冷凍保存すべきだ。
5. 各井戸から培地を慎重に取り出し、100μLのMTT溶液に交換します。37°C、_CO2 5%で2時間培養します。
6. この培養中に、イソプロピルアルコール中に40 mM HClを含む溶解溶液を準備します。
7. マルチチャネルピペットでMTT溶液を慎重に除去し、各ウェル底部のフォルマザン結晶を乱さないようにしてください。
8. 各ウェルに100μLの溶解液を加えます。プレートをアルミホイルで包み、150rpmのプレートシェーカーに15分間置きます。
9. 570nmと630nmで吸収率を記録しました。
10. データ分析を行う。
    1. 光密度の生値を用いて、各ウェルごとに570nmで得られた値から630 nmで得られる値を差し引きます。次に、未処理のセルウェルの補正値を平均します。これらの未処理細胞は100%生存可能と考えてください。
    2. 次に、処理済みセルの値を未処理セルのウェルと比べて、次の式を用いて正規化します。
       生存可能性(%) =
11. 平均を表すバーでプロットの生存率は、平均の標準誤差±±重複します。データ分析およびグラフソフトウェアで実装された手法を用いて、未処理細胞対照群と異なる濃度での生存率を比較するためにさらに統計解析を行います。
12. 各濃度ポイントの平均を、非パラメトリックKruskal-WallisとDunnを用いたDMSOのみ処理細胞の平均値と比較してください(差はp値<0.05で有意とみなされます)。線量反応曲線をプロットし、OD値からCC₅₀を推定するには、報告手順^{を確認してください。}

結果

PVを生成するトランスフェクション法はいくつか報告されており、リン酸カルシウム¹⁵、脂質系法¹⁶、PEIなど、線形および分岐型の両方があります。本論文は、分岐したPEIを持つHEK293T由来細胞のトランスフェクションにより高効率なトランスフェクションが可能であることを示しており(図1)、通常は市販の脂質系トランスフェクション剤を用いたトランスフェクション法と比較されます(データ未掲載)。本条件で最適なPEI量に対応する代表的な結果が示されており、これは第1節で述べた条件における2.5 μgのGFP発現プラスミドに対してPEIストック溶液5μLに対応しています。しかし、新しいプラスミドとPEIのバッチごとに、この段階で最適化実験を行うことが推奨されており、複数のGFP発現プラスミド-PEI比率をテストし、プラスミド量を一定に保ち、1 mg/mLのストックから1 μLから20 μLまでの複数のPEIをテストすることが推...

ディスカッション

このMLVシステムの他のウイルスの疑似型生成における多様性は、エボラウイルス¹⁸、MERS-CoV⁸、SARS-CoV¹⁹、ラクロスウイルス²⁰、ハンタウイルス²⁰、ヴィスナウイルス²¹、アレナウイルス²²、インフルエンザウイルス²³など、他の重要なウイルスでも報告されています。これらの疑似型は、ウイルス^トロピズムの研究、^{遺伝子治療への}応用可能性、中和抗体の検出と定量^{化、ウイルス}侵入阻害剤の発見と特性評価など、多様な応用に非常に有用でした。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 & micro;m 低タンパク質結合シリンジフィルター	サーモ・サイエンティフィック	720-1320	シリンジフィルター(0.2 & μ;男性、13mm、PES、不妊)
0.25%トリプシン-EDTA 1X溶液	ギブコ	25200-056	トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド
0.45 & micro;m PVDFボトルトップフィルターユニット	アヴァントール	514-1045	ボトルトップ真空ろ過システム(PVDF、250ml、50mm、0、45およびマイクロ;m)
1.5 mL 無菌マイクロ遠心分離機チューブ	エッペンドルフ	30123611	セーフロック 真空管
100 X ペニシリン ストレプトマイシン溶液	コーニング	30-002-CI	ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、100倍
5 X ルシフェラーゼアッセイ溶解バッファー	プロメガ	E2650	プロメガ・ブライトグロー・ルシフェラーズアッセイシステムの一部
50 mL 滅菌円錐管	コーニング	352070	50 mL 高透明度PP遠心分離機チューブ、円錐形底、無菌
6ウェル組織培養プレート	サーモ・サイエンティフィック	140675	細胞培養処理マルチディッシュ
96ウェル組織培養プレート	サーモ・サイエンティフィック	168055	ナンク&トレード;MicroWell™96ウェル、ナンクロンデルタ処理済み、平底マイクロプレート
アルビドール塩酸塩	シグマ・オルドリッチ	SML0860
分岐ポリエチレンニミン、25 kDa	シグマ・オルドリッチ	408727
共焦点レーザー顕微鏡および(FV 3000)	オリンパス社	SKU:FV3000
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ	D8418
DMEM(ダルベッコ改良イーグルミディウム)含有:高グルコース、L-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	11995-065
胎児用牛血清(FBS)	ギブコ	26140-079	熱不活化(56°C、30分)
HEK293T由来細胞(Lenti-X 293T細胞株)	タカラバイオ	632180	HEK293細胞株の高度に形質移行可能なサブクローンの存在であり、ウイルスタンパク質発現の高レベルを支えます
HEPESバッファ	ギブコ	15630-080
感染に対して非常に感受性の高い細胞(293T-ACE2。TMPRSS2(mCherry)細胞系)	BEIリソース	NR-55293	ACE2およびTMPRSS2を安定的に発現するように修飾されたHEK293T細胞株
塩酸およびnbsp;	シグマ・オルドリッチ	H1758-500ML
逆位相差顕微鏡	オリンパス社およびnbsp;	SKU:2404040005
イソプロパノール	シグマ・オルドリッチ	I9516-500ML
ルシフェラーゼ基質	プロメガ	E2650	ブライトグロールシフェラーゼアッセイシステムの一部
発光検出を備えたマイクロプレートリーダー	アジレント・バイオテック	BTH1MG
MTT [3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物]	シグマ・オルドリッチ	M2128
不透明な白色96ウェルプレート	コーニング	3917	96ウェルのソリッドホワイトフラットボトムポリスチレンTC処理マイクロプレート
パラフィルム	ベミス	PM999
pcDNA3-EGFPプラスミド	アッドジーネ	13031	pcDNA3-EGFPはダグ・ゴーレンボック(Addgeneプラスミド#13031;http://n2t.net/addgene:13031;RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVガグポルプラスミド	-	-	ゲイリー・ウィッタカー博士よりご厚意で寄贈されました。
Ca2+およびMg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)	コーニング	21-040-CV	リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムなしの1倍
Promega PureYield プラスミド Maxiprep システム	プロメガ	A2393
pTG-Lucプラスミド	-	-	ゲイリー・ウィッタカー博士よりご厚意で寄贈されました。
pUNO1-SARS-CoV-2 スパイク(武漢)プラスミド	インビボジェン	P1スパイク
pVSV-Gプラスミド	アッドジーネ	138479	pVSV-Gはアキツ・ホタ(Addgeneプラスミド#138479;http://n2t.net/addgene:138479;RRID:Addgene_138479)
組換えヒトACE2-Fc融合タンパク質	インビボジェン	fc-hace2
還元血清培地(Opti-MEM)	ギブコ	31985-070	Opti-MEM還元血清培地