細胞外フラックスアッセイを用いた一次ミクログリアにおける解糖系の研究

サマリー

このプロトコルは、一次マウスのマイクログリアにおける代謝再プログラミングを定量化するために解糖系ストレステストを費用対効果の高い方法で行います。分離および炎症刺激後、新たに調製されたpH調整試薬を用いて細胞外酸性化速度(ECAR)を測定し、その後タンパク質正規化を施して解糖分解シフトの正確かつ再現性のある評価を可能にします。

要約

ミクログリアは中枢神経系の常駐マクロファージ細胞であり、生理学的および病理的な兆候に応じて代謝プログラムを動的に変化させます。これらの代謝の変化を理解することは、炎症における役割を明らかにするために非常に重要です。ここでは、細胞外フラックス分析装置を用いた解糖ストレス検査を用いて、新生マウスの脳皮質から分離した一次ミクログリアの解糖プロファイルを評価する詳細なプロトコルを示します。このアッセイにより、乳酸などの低pHに関連する解糖活性の指標であるECARのリアルタイム測定が可能になります。私たちのアプローチは、培養されたミクログリアを異なる条件下で治療し、代謝経路が炎症促進刺激を含むさまざまな刺激にどのように変化するかを調べることを含みます。私たちの研究室は、グルコース、オリゴマイシン、2-デオキシグルコース(2DG)など異なる試薬の新鮮なストック溶液を製製し、経路の異なる側面を標的にしつつ、各試薬のpHを慎重に調整して実験の正確性と再現性を確保しています。この方法は一次ミクログリアにおける解糖系の調査に強力な基盤を提供し、炎症性や疾患関連条件下での機能状態の洞察を提供します。

概要

中枢神経系の細胞は、正常^な状態や疾患の状態に応じてエネルギーの生成方法を変えます^1,2。主要な代謝経路の中で、解糖作用と酸化リン酸化(OXPHOS)は免疫細胞機能を調節する主要な経路であり、それぞれ炎症促進および抗炎症状態に対して強力かつ即時の反応を行うために行われます。したがって、免疫細胞は炎症信号と機能状態に応じて代謝経路を切り替え^{ることができます5。}ミクログリアは骨髄系と同様に代謝的に機能に結びつき、代替代謝燃料として異なる経路に迅速に適応し、代謝柔軟性を示します^6,7。ミクログリアは炎症中に急速な代謝再プログラムを行い、解糖系の強化が炎症促進状態の重要な代謝シグネチャー^{となります8.}したがって、代謝表現型に対する細胞依存性を特定するアッセイは、さまざまな条件下での機能状態を調査することを可能にします。現在のプロトコルでは、一次ミクログリアが炎症促進状態における解糖作用の増加に依存しているかどうかを明らかにすることを目指しています。そのため、解糖ストレステストのアッセイを定期的に実施しています。シーホースXFe24アナライザー(細胞外フラックスアナライザー)は、不死化細胞株や形質転換細胞のECAR測定に広く使われていますが、一次ミクログリアは細胞収量の制限、付着特性の変動、培養条件に対する高い感度など独自の技術的課題を抱えており、代謝測定を混乱させることがあります。さらに、ECARのリアルタイム測定を提供し、エンドポイントラクトレートアッセイだけでは捉えられない複数の時点で乳酸駆動の解糖作用を正確に評価することを可能にします。細胞外フラックスベースの代謝プロファイリングは、細胞の生体エネルギー特性を特徴づける代謝研究で広く採用されており、このプロトコルは活性化中の細胞の代謝シフト、疾患モデリング、薬物試験の研究に適しています。読者は一次細胞内で動的かつ高解像度の解糖分解測定の必要性に基づいて適合性を判断できます。

グルコースは解糖によってピルビン酸に代謝され、細胞質内で乳酸に変換されるか、ミトコンドリアでCO₂と水に変換されます。グルコースが乳酸に変換されると、陽子が細胞外空間に放出され、中質酸性化が起こります。細胞外フラックス分析装置はこの酸性化をECAR⁹として定量化します。解糖ストレス試験では、細胞をまずグルコースおよびピルビン酸フリー培地で培養し、その基準値ECARを記録します。最初の注射では飽和した量のグルコースが届き、細胞は解糖によってピルビン酸に代謝され、ATP、NADH、水、陽子を生成します。プロトン放出の増加はECARを上昇させ、これは「解糖系」を反映しています。次にオリゴマイシンが添加され、ミトコンドリアのATP合成を阻害し、細胞は解糖系のみに頼らざるを得なくなります。この陽子勾配の変化はさらにECARを増加させ、細胞の最大解糖能力として測定されます。最後に、グルコース類似体である2DGが導入されます。この薬は競争的にヘキキナーゼを阻害し、解糖作用を阻害し、ECARを低減します。この減少は、以前のECARが解糖系に依存していたことを裏付けています。最大解糖能力と解糖レベルとの差が解糖予備量を定義します。グルコース付加前の初期ECARは、他の細胞過程からの非解糖酸性化を表しています(図1)。

細胞外フラックス分析装置を用いて解糖系ストレステストを実施しました。生のECAR値は分析のためにExcelにエクスポートされました。各疾患について、基礎ECAR(グルコース追加前)、解糖作用(グルコース注射後)、解糖能力(オリゴマイシン治療後)に対応する時間点を特定しました。各段階内の関連時点および4つの技術的複製からのECAR値を平均化し、解糖作用はグルコース追加後のECAR増加量として計算されました。グリコール分解能力はオリゴマイシン追加後のECAR増加として計算されました。解糖予備は2DG注射後のECAR減少として計算されました。これらの平均値を用いて、グループ間の代謝反応を比較しました。

一方、酸素消費率(OCR)やミトコンドリア機能を評価するためには、ミトコンドリアストレステスト(Agilent)が標準的なアプローチであり、基礎呼吸、ATP連鎖呼吸、プロトン漏れ、最大呼吸、余呼吸能力、非ミトコンドリア呼吸などのパラメータを測定します。これらの測定は、特定のミトコンドリア阻害剤であるオリゴマイシン(ATPシンターゼ阻害剤)、FCCP(カルボニルシアン化物-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン)、最大呼吸を駆動するアンカプラー、ロテノン/アンチマイシンA(複合体I/III阻害剤)を順次注入することで得られ、ミトコンドリアの健康状態とバイオエナジーティクスの定量的評価を可能にします ^10,11,12,13.したがって、ECARアッセイとOCRアッセイは異なる条件下で行われます。

プロトコル

すべての動物処置はカナダ動物ケア協議会のガイドラインに従って行われ、ニューファンドランド記念大学の動物ケア委員会からプロトコル番号22-01-DKのもとで承認を受けています。

1. 実験開始前の準備

1. Ca²⁺ およびMg²⁺を含まず、10 mM HEPESを1x HBSSに加えて解剖溶液を準備します。
2. 消化液(脳2〜3人分)を1 mLの2.5%トリプシン(ストック10倍、希釈なし)、2 mLの解剖液、200 μL DNase I(1 mg/mL)を組み合わせて準備します。
3. DMEMに10%のFBS、1xグルタマックス、1xの抗生物質/抗菌剤を補足して混合グリア培地を準備します。
4. DMEMに10%FBS、1xグルタマックス、1xMEM NEAA、1xピルビン酸ナトリウム、1xペニシリン/ストレプトマイシンを補足してミクログリア培地を準備します。

2. 混合グリア培養のプレート(図2A)

1. 1日目:
   1. C57BL/6Cマウスから出生後日(P0)〜P2の子を採取し、立体顕微鏡で皮質を採取し、髄膜を除去します。その後、皮質を解剖液で小さな破片に切り離し、15 mLの円錐形チューブに移します。組織がチューブの底に沈むのを待ちます。
   2. 解剖液をデカントし、2〜3脳ごとに3mLの消化液に置き換えます。2mLの血清学ピペットで組織を優しく解離します。
   3. チューブをインキュベーター内のローターに37°Cで置き、2mLの血清学ピペットで8分ごとにトリチュレートし、合計約24分間混合します。
   4. 組織消化後、細胞を室温(RT)で300 x g で5分間遠心分離します。その後、上清液を捨て、ペレットを5mLの混合グリア培地に再懸濁させます。
   5. 18Gの針を5mLの注射器に使い、細胞をトリチーし、その後70μmのナイロンセルストレーナーに通します。採取した細胞を再び300 x g で5分間RTで遠心分離します。
   6. 最初はペレットを1 mLの混合グリア培地に再懸浮させ、細胞凝集を除去するために複数回トリチーを行い、その後さらに高容量で再懸濁し、1つのT75フラスコに最大12 mL(1フラスコあたり2〜3個の脳皮質を推奨)にします
      注意:フラスコにポリ-D-リジンやその他の試薬をコーティングする必要はありません。
2. 2日目は培地全体を変え、新しい混合グリア培地を加えます。
3. 3日目には、約3^分の 2の培地を新しい混合グリア培養基に置き換えます。さらに7日間、合計10日間の増殖を待つ。
   注:この時点でアストロサイト層が観察可能です。
4. 6日目には培地の3分の2を新しい混合グリア培地に置き換えます。合流したアストロサイト層の存在を確認してください。

3. 純粋な一次ミクログリアの取得(図2A)

注:10日目頃には、星状細胞層の上に浮かぶ小さな丸い細胞が見えます。これらは主にミクログリアです(図2B)。

1. フラスコを250rpmで37°Cで2時間振る。 浮遊細胞を含む培地全体を15mLの円錐形チューブに集め、遠心分離機で300 x g で10分間処理します。
2. ペレットをミクログリア培地に再懸濁し、細胞外フラックス分析装置の細胞培養マイクロプレートで1ウェルあたり約250,000個の細胞をプレートします。
   注:3つのT75フラスコから1mLあたり約300万〜400万個の細胞が得られます。細胞培養プレートにポリDリジンやその他の試薬をコーティングすることは必須ではありません。
3. マイクロプレートを5%_CO2 で30〜45分間培養します。その後、培地を再度交換して純粋なミクログリア培養を得て、まだ浮遊している可能性のあるオリゴデンドロサイトを除去します。細胞は翌日には治療の準備が整います(図2C)。
4. 細胞シーディングから「背景」対照群として指定された4つのウェルは除外します:各行に1つずつ(図3C)。これらの井戸はアッセイ媒体を受け取ります。
   注意:未使用の井戸には無菌水またはPBSで充填し、培地の蒸発を防ぎ、細胞を固定された行や列ではなくランダムなパターンでプレートを配置してプレートベースの変動を最小限に抑えてください。

4. 炎症促進刺激による原発性ミクログリアの治療

1. 11日目に細胞を100 ng/mLのリポ多糖(LPS)で24時間処理します。位置影響を排除するために、対照井戸とLPS処理井戸をランダム化します。
   注意:処理期間は実験条件によって異なり、事前の最適化が必要です。

5. 実験実施前日の細胞外フラックスアッセイの準備

1. 11日目には、すべてのウェルの校正プレート(24ウェル形式;細胞外フラックス分析キット)に1mLのキャリブラントバッファーを追加します。プレートは_CO2なしで37°Cの一晩中保管してください。
   注:校正プレートは4つの注入井戸で構成されています。解糖ストレス試験では、グルコースをポートAに加え、オリゴマイシンをポートBに加え、2DGをポートCに注入します( 図4A参照)。
2. グルコースと2DGストック溶液を準備する
   1. グルコース – 細胞外フラックスアッセイ培地2mLに90mgのグルコースを溶解します(材料表)。最初は約1.9 mLに溶解し、翌日1N NaOHでpHを調整しても最終体積が2 mLを超えないようにします。これはモル濃度を維持するために重要です。
   2. 2DG – 細胞外フラックスアッセイ培地2 mLに328 mgを溶解します。
      注意:グルコースと2DGは2Dgの両方を4°Cの温度で一晩保存してください
3. 30〜40mLのアッセイ培地を50mLの円錐形チューブに分け、翌日のアッセイのために4°Cで保存します。

6. 細胞外フラックスアッセイ(12日目)

1. 12日目に、あらかじめ作られたグルコース2DG、アッセイ培地を37°Cで温めます。 グルコースと2DG、およびアリクォートされたアッセイ培地のpHを、1N NaOHを段階的に(例:5 μL、次に10 μL)加えて7.4に調整します。
2. pHが7を超えるまで一時的に均一に混合するための渦を起こします。
   注意:pH指示シートの使用は、pHの継続的なモニタリングのために推奨されます。
3. pH調整されたアッセイ培地2mLに10mMオリゴマイシンのストック溶液2 μLを加えます。
   1. 10mMオリゴマイシンのストック溶液製剤:10mgのオリゴマイシン小瓶を1mLの無菌DMSOに再構成し、濃度は10 mg/mLにし、-80°Cで保存して再使用します。
4. インキュベーターから細胞を取り出します(ステップ4以降)、培地を1.5mLのマイクロ遠心分離チューブで採取し、300 x g で5分間遠心分離します。
5. 上清液を採取し(細胞やゴミを除去するためにペレットを捨てる)、乳酸測定のために-80°Cで保存します。これはステップ8で説明されています。
6. 細胞が浮かばないように、pH調整済みアッセイ培地1mLで非常に優しく洗浄してください。
7. アッセイ媒体を廃棄し、pH調整済みアッセイ媒体500μLを加え、_CO2なしの37°Cで45分から1時間培養します。
8. その間、必要な阻害剤をすべて細胞外フラックス分析装置のキャリブレーションプレートに各ポートに追加してください。すべてのウェルで左上ポートAに55 μLのグルコース、右上ウェルのポートBに60 μLのオリゴマイシン、左下ウェル(背景ウェルを含む)にポートCに65 μLの2DGを投与します( 図4A参照)。
   注意:各工程での体積増加はモル濃度を維持するために必要であり、グルコースとオリゴマイシンの事前添加によって体積が増加します。
9. 阻害剤を追加した後、Agilent Seahorse Waveソフトウェアを使って解糖ストレス試験を設定します(図3参照)。その後、指示が出たらキャリブレーションプレートを実行してください。
   注意:キャリブレーションプレートを機械に入れる前に、プレートのトップカバーとプレート間のピンクカバーを外してください。この段階では、pHおよび_O2 センサーのテストと品質管理が行われます。
10. 校正が終わると、機械は校正プレートのアンロードと培養プレートのロードを促します。
    1. ステップI:アッセイテンプレートの選択(図3A)
       1. Waveソフトウェアを開き、テンプレートセクションから実験に適したアッセイテンプレートを選択します。
       2. この場合、細胞外フラックス分析装置で 「XF解糖ストレステスト」 を選択してください。
    2. ステップII:グループと注入戦略の定義(図3B)
       1. グループ定義タブに行き、実験グループ(例:バックグラウンド、コントロール、LPS)を作成してください。
       2. 各ポートに注入する化合物(例:グルコース、オリゴマイシン、解糖ストレス試験用の2DG)を選択して注入 戦略 を定義します。これらの設定はソフトウェアがデフォルトで設定しているので、適切に確認してください)。
    3. ステップIII:プレートマップにグループを割り当てる(図3C)
       1. プレートマップビューを開き、グループ名(例:Background = 黒、Control = 緑、LPS = 赤)をプレートレイアウトにドラッグして各グループにウェルを割り当てます。
       2. 正確な正規化のためにブランクウェル/バックグラウンドウェルが指定されていることを確認してください。
    4. ステップIV:プロトコルの設定(図3D)
       1. プロトコルタブで、測定サイクルと注入をプログラム します 。解糖ストレス試験の典型的な手順には 、非解糖酸性化、 糖酵→測定のグルコース注入(ポートA)、解糖能力測定のオ リゴマイシン注入(ポートB)、 解糖能力測定→ 2-DG(ポートC)注入 →解糖予備の測定が含まれます
       2. 各注入後の 測定サイクル 数を定義し、タイミングを調整します(例:3分混合3サイクル、2分待ち、3分測定)。
          注:実験ではソフトウェアのデフォルト設定を使用しています。
       3. アッセイを実行する前に 総アッセイ時間 を確認してください。
    5. ステップV:正規化(図3E)
       1. Waveソフトウェア内の標準化オプション(例:タンパク質含有量、細胞数、その他の利用可能な方法)を用いて、ビシンコニン酸(BCA)アッセイから得られたタンパク質濃度値とデータを正規化します。タンパク質濃度の測定値は表1に示されています。
          注:ECAR測定後のBCAアッセイ用タンパク質単離プロトコルは、以下のステップ7で説明されています。

7. データの定量化および正規化のためのセルの収集

1. 細胞外フラックスアッセイが完了したら、培養プレートを取り外し、直ちにタンパク質抽出を進めるか、タンパク質抽出の準備まで-80°Cで保存してください。
   注:タンパク質アッセイは異なる処理条件下で値を正規化することを可能にします(これはデータを正規化する方法の一つであり、唯一の方法ではありません)。
2. 即時のタンパク質分離のために、アッセイ培地をウェルから取り出し、500μLのRT PBS(1回)で一度洗浄します(細胞単層の破壊を最小限に抑えるために穏やかなワンウォッシュが推奨されます)。
3. この過程で剥離する可能性のある細胞を採取するには、プレートを300 × g で1回5分間遠心分離し、PBSを廃棄し、得られたペレットをRIPAバッファーに再懸浮させて正確な総タンパク質測定を確保します。
4. 各ウェルに約75〜100μLのRIPAバッファーを加え、プレートをシェーカー(低〜中回転)に30分(RT)置きます。その後、内容物を新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   注意:RIPAバッファーを1.5mlマイクロ遠心分離機チューブに移す前に、ウェル内で十分にトリチレートし混合してください。
5. マイクロ遠心分離機チューブをRTで約30分間キュベートし、細胞の適切な溶解を行います。この間、遠心分離機を4°Cまで予冷します。
6. 細胞を16,000 x g で4°Cで15分間溶除します。 ペレットは細胞の破片が含まれているので捨ててください。
7. 上清液を採取し、BCAアッセイ(または他の推奨方法)を用いてタンパク質定量を行います。すぐに進行するか、すべてのアッセイ培地を取り出した後に-20°C(短期保存)または-80°C(長期保存)で溶解液を保存してください。
8. サンプルを-20°Cまたは-80°Cで保存した後の再開後は、氷で約20〜30分間解凍し、短時間渦巻きや回転を繰り返し、標準的なBCAプロトコルを続けます。
9. または、ヘモサイトメーターやフローサイトメーターを使って1ウェルあたりの細胞数をカウントし、正規化戦略に統合する方法もあります。その場合、アッセイ終了後すぐに約100〜200μLのトリプシン(事前に37°Cまで温めて)を加え、37°Cで5分間培養します。トリプシンの効果を中和するために、100〜200μLの10%FBSを加えて細胞を採取します。
   1. 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清液を取り除き、ペレットを約1 mLの10% FBSに再懸浮させてからヘモサイトメーターでカウントします。または、4%のPFAで15分間固定した後、フローサイトメトリーに基づく細胞計数を行うことも可能です。
      注意:すぐに細胞数を進める場合は、PFAベースの固定は必要ありません。
10. 各ウェルで、ステップ7.8のタンパク質濃度またはステップ7.9.1の細胞数とECAR値を正規化し、ステップ6.10.5.1と同様に Wave ソフトウェアを用います。得られる値は解糖ストレス試験アッセイの正規化値です。
11. 結果とグラフを「エクスポート」オプションから「グラフパッドプリズム」オプションと「Excelシートで各データポイントの数値」を組み合わせて生成し、定量化します。
    注:細胞培養プレートでは、4つの指定ブランクウェルの選択は柔軟で、実験者が設定可能です。デフォルトのブランク配置は図3Cに示されています。

8. 培養上清液からの乳酸測定

1. ステップ6.5から12日目に採取し、−80°Cで保存した上清液アリコートを氷上で徐々に解凍します。
2. 製造元のプロトコルに従い、L-乳酸アッセイキットをフルオメトリックモードで測定してください。
   注:蛍光測定モードは比色測定法よりもはるかに感度が高いです。
3. 提供された乳酸標準を連続希釈して、0から0.1 nmol/wellの範囲の校正曲線を生成するために標準を準備します。
4. サンプルと標準を透明な96ウェルマイクロプレートに二重追加し、乳酸酵素混合液を含む反応混合物と蛍光プローブを各ウェルに加えます。
5. 光を遮って30分間RTで孵化させます。励起/発光波長を535/587 nmに設定した蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を測定します。
6. 標準曲線から試料中の乳酸濃度を計算し、pMとして表します。未治療(対照)およびLPS処理済み一次ミクログリアの上清からの乳酸レベルは表2に示 されています。

結果

細胞外フラックスベースの解糖ストレス試験は、一次ミクログリアの解糖プロファイルを測定することに成功しました。このアッセイは基礎解糖系、すなわちグルコース注入後の解糖、オリゴマイシン注入後の解糖能力、2DG注入後の解糖系阻害を測定します。本実験では、対照群(未治療)とLPS処理済み一次微膠質細胞を比較しました。対照群とLPS処理ミクログリアの間で24時間後にわずかな形態変化が観察されました(図2D-E)。 LPS処理されたミクログリアは、未処理対照群と比較して解糖作用(図4D、H)および解糖能力(図4E、I)を有意に増加させ、ECAR値の上昇(図4C、G )が示すことが示されました。すべての時点の平均値...

ディスカッション

神経炎症中の微膠細胞応答は、これらの細胞が機能状態のエネルギーおよび生合成的要求を満たすことを可能にする深い代謝再配線を伴います。細胞外フラックスベースの解糖ストレス試験は、解糖フラックスを感度かつリアルタイムで測定する方法を提供し、一次ミクログリアが炎症促進条件下でどのように代謝を適応させるかを解析することを可能にします。本研究では、一次マウスのミクログリアを用いて、古典的炎症刺激(LPS)への曝露後の解糖活性を評価し、マイクログリア代謝に関連する代謝シフトの洞察を提供しました。

本研究結果は、一次マイクログリアにおける解糖機能の強力な代理指標としてのECARの有用性を強調しています。LPS治療によりECARが増加し、代謝が解糖系へシフトしていることを示しました。これは、炎症時に解糖系の強化を促進する炎症性小膠細胞の代謝再プログラミングがこれまでに報告されていることと一致します¹⁴。このような代謝スイッチングは、TNF-αやIL-6のような炎症性メディエーターの産生...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1M HEPESソリューション	シグマ・オルドリッチ	H0887
1回のHBSS	Gibco	14175-079
2.5% トリプシン	Gibco	15090-046
2DG	ミリポールシグマ	D6134
抗生物質/抗菌薬など;	ギブコ	15240-062
D & ndash;(+)グルコース、無水およびnbsp;	熱科学	A16828.36
DMEM	ギブコ	11965-092
DNase I	ミリポールシグマ	11284932001- ロッシュ
FBS	フィッシャーブランド	FB12999102
グルタマックス	Gibco	35050-061
L-乳酸キット	アブカム	AB65330
LPS	シグマ・オルドリッチ	L4391
MEM NEAA	Gibco	11140-050
オリゴマイシンA	ミリポールシグマ	495455
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15240-062
pH指示ストリップ	フィッシャーブランド	13-640-516
シーホース XFe24	アジレント・テクノロジーズ	該当なし	一般名:細胞外フラックス分析装置
Seahorse 24 V7 PS細胞培養マイクロプレート	アジレント・シーホース	100777-004	一般名:細胞外フラックス細胞培養マイクロプレート
シーホース分析XFキャリブラントバッファー(pH 7.4)	アジレント・シーホース	100840-000	一般名:細胞外フラックスキャリブラントバッファー
タツノオトシゴアッセイ XF DMEM 媒体(pH 7.4)	アジレント・シーホース	103575-100	一般名:細胞外フラックスアッセイ培地
シーホース細胞外フラックス分析キット	アジレント・シーホース	102342-100	一般名:細胞外フラックスキャリブレーションプレート
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360-070