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研究記事

カルセオラリオサイドAによるPI3K/Akt/Nrf2経路の調節による膠質腫におけるフェロプトーシス誘導

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DOI：

10.3791/69643

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2025年12月30日

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1Department of Pediatric Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Pediatric Surgery, Weifang Peoples Hospital, 3Department of Burn, Weifang Peoples Hospital

この記事について

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サマリー

本研究は、カルセオラリオサイドAの膠質腫における治療的可能性を探り、PI3K/Aktシグナル伝達を阻害しNrf2分解を促進することで、フェロプトーシスを誘導し、in vitro および in vivoの両方で腫瘍進行を抑制する能力を示しています。

要約

本プロトコルは、カルセオラリオサイドA(CaA)がグリオーマモデルにおけるホスファチジルノシトール3-キナーゼ(PI3K)/プロテインキナーゼB(Akt)/核因子エリスロイド2関連因子2(Nrf2)経路のフェロトーシス誘導および調節に与える影響を調査するための実験ワークフローを示します。これらの手法には、CaA治療後の細胞生存率、増殖、化学感受性を評価するために、U251およびU87ヒトグリオーマ株を用いた一連の細胞ベースのアッセイが含まれます。フェロプトーシスに関連する変化は、活性酸素種(ROS)、グルタチオン(GSH)、マロンジアルデヒド(MDA)、不安定な鉄レベルを測定し、さらにグルタチオンペルオキシダーゼ4(GPX4)、システイン/グルタミン酸抗ポーターサブユニット(xCT)、フェリチンなどのフェロプトーシス関連タンパク質の発現をウェスタンブロットで測定することで評価されます。経路関与を評価するために、プロトコルではqRT-PCR、ウェスタンブロット、免疫沈殿を用いたNrf2発現およびユビキチン化のアッセイを詳細に行っています。Nrf2の過剰発現実験も含め、フェロプトーシス調節におけるその役割を確認する。さらに、このプロトコルでは、U87細胞を皮下に埋め込み、その後腹膜内CaA投与を用いて生体内腫瘍の増殖と毒性を評価するマウス異種移植モデルの使用も示しています。主要臓器の組織学的解析は全身の安全性を評価するために行われます。さらに、分子ドッキングはCaAとPI3K p110αサブユニット(PIK3CA)との直接結合を予測するために用いられます。これらの手法は、フェロトーシスのメカニズムやグリオーマ研究における天然化合物の治療効果を検証するための再現可能な枠組みを提供します。

概要

膠腫、特に高悪性度の膠芽腫は、急速な増殖、治療抵抗性、悪い予後を特徴とする、最も致死性の高い脳腫瘍の一つです。近年では、テモゾロミドなどの伝統的な化学療法薬や、クルクミン2、レスベラトロール3、エピガロカテキンガレート4などの天然化合物など、さまざまな抗グリオーマ薬が検討されています。これらの薬剤は、アポトーシスの誘導、血管新生の抑制、酸化ストレス経路の調節など、複数のメカニズムを通じて効果を発揮します。しかし、多くの化合物は生体利用能の低さや不完全なメカニズム特性評価などの制約に直面しています。これは、抗腫瘍活性を確認するだけでなく、基礎となる薬理学的メカニズムを体系的に解明する包括的な方法論の重要性を強調しています。このような機構的ワークフローを確立することは、新規抗グリオーマ化合物の開発を発見から前臨床検証まで加速させる上で特に重要です。

この目標を支援するため、現在では多くの研究が高度な計算および実験ツールを統合し、機構的解像度5,6を向上させる。AlphaFold3や分子ドッキングなどの構造ベースの薬剤設計や人工知能(AI)モデルは、有望な薬物-標的相互作用の特定を前例のない速度と精度で促進しています 7,8。これらのツールは、結合親和性の予測や、実験室での検証前に潜在的な分子標的を特定することで、実験手法を補完します。同時に、経路ベースの機能性アッセイ、ライブセルイメージング、高分解能プロテオミクス技術の登場により、酸化ストレス応答、シグナル伝達カスケード、フェロプトーシス9,10,11などの細胞死モダリティなど、複数の調節軸にわたる新化合物の細胞への影響を評価することが可能になりました。

グリオーマ生物学に関与するシグナル伝達経路の中で、ホスファチジルノシトール3-キナーゼ(PI3K)/プロテインキナーゼB(Akt)および核因子エリスロイド関連因子2(Nrf2)経路は、腫瘍成長、酸化還元恒常性、治療抵抗性に関与する役割から特に注目されています12,13。PI3K/Aktシグナル伝達はグリオーマ細胞の生存、増殖、代謝適応を促進し、Nrf2は抗酸化反応のマスター調節因子として機能し、鉄細胞死を抑制します14。これらの経路の持続的な活性化は治療回避に寄与し、薬理学的介入の標的として魅力的です15。経路解析の従来の手法には、全タンパク質およびリン酸化タンパク質のウェスタンブロッティングや、遺伝子発現解析のためのqRT-PCRが含まれます。しかし、Nrf2シグナル伝達の詳細な解析には、タンパク質の安定性、核転座、ユビキチン化などの翻訳後修飾を評価する追加のアッセイが必要です。これらの多面的な検出戦略は、特定の化合物が酸化還元調節やフェロプトーシス制御をどのように妨害または強化するかを理解する上で不可欠です。

カルセオラリオサイドA(CaA)はヒドロキシシンナム酸誘導体であり、PI3K/Aktシグナル伝達を同時に阻害し、Nrf2のプロテアソーム分解を促進することで、フェロプトーシス感受性を高める二重機構を提供します。この二重標的戦略は、抗酸化防御の下流で作用するエラスチンやRSL3のような既存の薬剤に比べて再現性や機構的深さを向上させる可能性があります。本プロトコルは、CaAの薬理学的メカニズムを調査するための統合的な実験的アプローチを提示しており、分子ドッキングによるPI3K結合部位の特定、免疫ブロッティングおよび免疫沈殿によるNrf2発現およびユビキチン化の検出、そして活性酸素種(ROS)、グルタチオン(GSH)、マロンジアルデヒド(MDA)などのフェロプトーシスマーカーが含まれます。さらに、異種移植マウスモデルを用いてCaAの治療効果と全身安全性を評価しています。この包括的なワークフローは、抗がん剤の作用機序を研究するための再現可能かつ有益なプラットフォームを提供し、特にシグナル経路の変調と細胞死の調節の統合に重点を置いています。

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プロトコル

細胞培養と処理
マウスのHT22神経細胞およびヒトグリオーマU87およびU251細胞株を、10%胎児用牛血清と4 mM L-グルタミンを補足したDulbecco's Modified Eagle Mediumで、37°Cの加湿条件下で5% CO₂で培養しました。実験の一貫性を効率化するために、すべての細胞処理は標準化され、ここに説明されています。この節では、各処理群で使用される特定の条件と対応する下流アッセイについて説明します。

CaA治療:
HT22細胞はCaA濃度(0、0.1、0.5、1、10、50、100、250、500μM)を72時間にわたり増加させて処理しました。U87およびU251グリオーマ細胞は、ほとんどの実験で5、20、または50μMのCaA濃度で24時間処理され、時間経過研究では50μMで0、6、12、または18時間で処理されました。これらの処理は以下の解析で用いられました:システイン/グルタミン酸抗ポーターサブユニット(xCT)、グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPX4)、フェリチン(FTH1)、グルタミナーゼ、およびラパマイシン(mTOR)/真核生物初期因子4B(EIF4B)のPI3K/Akt/哺乳類標的(総およびリン酸化レベル)、Nrf2およびケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap1)に対するリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR);2′,7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いたROS測定;GSHおよびMDAの定量化;フェロオレンジベースのFe2+ 検出;5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)増殖アッセイ;コロニー形成アッセイ;3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)細胞生存能力アッセイ。

リプロキスタチン-1(Lip1)の共治療:
細胞は50 nmM Lip1で2時間前処理され、その後50 μM CaAを加えました。これらの条件はMTTアッセイ(0、24、48、72時間)で用いられました。コロニー形成の分析;EdUアッセイ;アネクシンV/PIアポトーシスアッセイ(20 nMシスプラチン有無)。

MG132の併治療:
細胞は10μM MG132単独または50μM CaAと併用して24時間処理しました。これはNrf2タンパク質の安定化(全および核)のためのウェスタンブロット法に適用されました。ユビキチン化Nrf2およびKeap1に対する免疫沈降(IP)アッセイ。

シスプラチンの共治療:
細胞は20 nMシスプラチン単独または20 μM CaAと併用して24時間処理されました。これらの治療法は、Annexin V/プロピジウムヨウ化物(PI)アポトーシスアッセイで使用されました。

Nrf2 過表現:
細胞は2.5 μg Nrf2 過剰発現プラスミドまたは空ベクターをトランスフェクション剤を用いて18時間トランスフェクトし、その後50 μM CaAで24時間処理しました。この状態はxCT、GPX4、FTH1、グルタミナーゼのウェスタンブロッティングに用いられました。ROS、MDA、GSHアッセイ;細胞内鉄のためのフェロオレンジ染色。

ワークフロー図(補足図S1)は上記の実験条件と対応する解析をまとめています。この図は、各治療プロトコルを特定の下流アッセイと視覚的に結びつけ、明確さと再現性の向上を目指しています。

細胞生存率の評価
細胞の生存可能性は、前述の従来のMTT比色法を用いて評価されました。HT22、U251、U87の細胞は96ウェル培養プレートにプレートされ、接着を促すために一晩培養されました。処理期間終了後、各ウェルに15μLのMTT溶液を導入し、プレートは37°Cで4時間培養されました。 その後、培地を廃棄し、形成されたホルマザン結晶を溶解するために150μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えました。その後、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmで吸収が記録されました。高い吸収度値は細胞生存率の向上を示し、吸収度の低下は細胞毒性の影響を示唆します。

EdU組み込みアッセイ
DNA合成および細胞増殖の評価のために、EdU組み込みアッセイは前述のEdUイメージングキットを用いて実施されました。簡単に、U251およびU87のグリオーマ細胞を24ウェルプレートにシードしました。処理後、細胞はEdU(最終濃度10μM)でインキュベートされ、さらに24時間培養されました。培養工程の後、細胞は4%パラホルムアルデヒドで固定され、その後0.5%トリトンX-100で透過され、キットの指示に従って染色されました。EdU陽性細胞(増殖細胞)の割合は蛍光顕微鏡で定量され、全4′,6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)染色核に正規化されました。

コロニー形成アッセイ
コロニー形成アッセイでは、U251およびU87のグリオーマ細胞を3.5cmの皿に低密度(1皿あたり500細胞)でプレートしました。処理後、培養培地は新鮮で薬物を含まない培地に交換され、細胞はさらに14日間コロニー形成のために維持され、培地交換は3日ごとに行われました。得られたコロニーはその後、4%のパラホルムアルデヒドを用いて固定され、0.1%の結晶バイオレットで染色され、顕微鏡で手動で数えられました。直径75μmを超えるクラスターはコロニーとして評価されました。各実験は3回ずつ行われ、3回繰り返しました。このアッセイは、長期的な増殖能力を評価するための一般的なプロトコルに従っていました18。コロニーは密な円形のクラスターとして現れるべきです。コロニーが少なく小さいことは増殖能力の低下を示唆しています。

細胞アポトーシスの評価
アポトーシス細胞死は、前述のFITCアネクシンVアポトーシス検出キットを用いて評価されました。U87およびU251グリオーマ細胞は、染色前に20 μM CaAの有無にかかわらず24時間にわたり20 nMシスプラチンで処理されました。フェロプトーシス阻害実験では、細胞に50 nM Lip1を2時間前処理し、その後20 μM CaAと20 nMシスプラチンでさらに24時間共処理しました。所定の処理後、細胞は300 × g、5分で採取され、製造元の指示に従ってAnnexin V-FITCおよびPIで染色されました。標識後、サンプルはフローサイトメーターで検査されました。データ取得はFL1(FITC)およびFL2(PI)チャネルを使用して行われ、スペクトルの重複を最小限に抑えるための補償設定が適用されました。その後、アネクシンV陽性細胞の割合を計算し、アポトーシスの度合いを決定しました。

ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロッティングは確立された手順に従って行われました。指示された処理後、細胞はプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーに溶解され、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質レベルを測定しました。Nrf2細胞内分布を評価する実験では、製造元の指示に従い、市販の核抽出キットを用いて核および細胞質タンパク質を抽出しました。

各サンプルから合計40μgのタンパク質を10%SDS-PAGEゲルに分離し、その後PVDF膜に移しました。膜は、室温で1時間PBSTで調製された5%無脂肪ミルク(PBS含有0.1%トゥイーン-20)でブロッキングし、その後4°Cで一次抗体を用いた一晩の培養が行われました。 洗浄後、HRP結合二次抗体(1:5,000)を37°Cで1時間かけて適用し、増強化学発光(ECL)システムを用いて信号を検出しました。

xCT、グルタミナーゼ、GPX4、FTH1の発現レベルを、負荷制御としてグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用いて測定しました。リン酸化タンパク質(p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-EIF4B)はそれぞれの総タンパク質レベルに対して定量され、総タンパク質はGAPDHに対して正規化されました。核Nrf2はラミンBに正規化されました。予想される転帰には、Nrf2およびp-PI3K/Akt/mTOR/EIF4Bの線量および時間依存性減少、CaA処理細胞におけるフェロプトーシス関連マーカーのダウンレギュレーションが含まれます。

ユビキチン化アッセイでは、細胞をMG132(10μM)でCaA(50μM)有無にかかわらず24時間処理しました。溶解後、タンパク質複合体は抗Nrf2抗体または抗Keap1抗体を用いて免疫沈殿されました。正常ウサギのIgGは陰性対照として用いられました。免疫沈殿物は抗ユビキチン抗体でプローブされ、ユビキチン化型を検出するために、全溶解液のNrf2およびケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap1)レベルもプローブされて入力を確認しました。

RNA抽出と定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)
RNA抽出およびqRT-PCRは標準プロトコルに従って実施されました。簡単に言えば、U87およびU251のグリオーマ細胞は、50 μM CaAの有無にかかわらず、異なる期間(6時間および18時間)で処理されました。総RNAは逆転写によって単離され、cDNAに変換されました。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)は、リアルタイムPCRプラットフォーム上でSYBR Green qPCRマスターミックスを用いて実施されました。相対的な遺伝子発現は2-ΔΔCt計算を用いて決定しました。Nrf2、Keap1、およびハウスキーピング遺伝子GAPDHに用いられたプライマー配列は以下の通りです。

Nrf2 フォワード、5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 逆、5′-GGAATGTGTGCCCAAAAGCTG-3′

キープ1 フォワード、5′-CAACTTCGCTGAGGAGGGGGC-3′;
キープ1 リバース、5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH フォワード、5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH 逆方向、5′-AGCCTTCTACATGGTGTGAAGAC-3′

Nrf2トランスダクション
U251およびU87グリオーマ細胞は、脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いてNrf2過剰発現プラスミドまたは対応する空コントロールベクターで一時的にトランスフェクトされました。この手法は従来の一時的トランスフェクション法に基づいていました。簡単に言うと、細胞は6ウェルプレートに1ウェルあたり3×10⁵細胞の密度でシードされ、一晩培養されてトランスフェクション時に約70〜80%のコンフルエンスを達成しました。各ウェルごとに、2.5 μgのプラスミドDNAを125 μLの還元血清培地に希釈し、5 μLのトランスフェクション試薬と混合しました。別途、3.75μLのトランスフェクション試薬をさらに125μLの還元血清培地に希釈しました。希釈されたDNAおよびトランスフェクション試薬の混合物を組み合わせ、優しく混合し、室温で10〜15分間培養して複合体形成を可能にしました。得られたトランスフェクション複合体(総体積250μL)は、新鮮な完全培地中の細胞を含む各ウェルにドロップ段階で添加されました。

CO₂インキュベーターで37°Cで18時間の培養後、トランスフェクション培地は新鮮な培養培地に置き換えられました。その後、細胞に対してウェスタンブロッティング、ROS分析、MDA/GSH定量、鉄蓄積研究などのアッセイが行われました。このプロトコルは広く受け入れられている一時的な遺伝子発現手順に従い、トランスフェクション後24〜48時間以内に堅牢なNrf2発現を可能にします。

細胞内鉄の測定
細胞内のFe2+ レベルは蛍光指示器FerroOrangeを用いて測定されました。Briefでは、U251およびU87のグリオーマ細胞を24ウェルプレートにシードし、CaAの濃度(5、20、50μM)で処理しました。Nrf2過剰発現がフェロプトーシスに与える影響を評価するため、U87およびU251細胞にNrf2発現プラスミドまたは空ベクターをトランスフェクトしました。18時間後に培地を交換し、細胞は50μMCaAで24時間処理されました。その後、細胞は血清フリー培地で1μMのフェロオレンジに曝露され、37°Cで30分間インキュベートされてから分析されました。培養後、細胞を洗浄し、TRITCフィルターセット(励起~543 nm、放出560-600 nm)を用いた蛍光顕微鏡で観察しました。オレンジ色の蛍光強度が上昇すると、細胞質内に局在する不安定なFe2+のレベルが増加していることを示します。この方法は、確立された蛍光プローブを用いた鉄アッセイ23を応用したものです。

GSHおよびMDAの測定
細胞内GSHおよびMDAレベルは、標準化された評価プロトコルに従って測定され、酸化ストレスを評価する24。Briefでは、U251およびU87のグリオーマ細胞を24ウェルプレートにシードし、CaAの濃度(5、20、50μM)で処理しました。Nrf2過剰発現がフェロプトーシスに与える影響を評価するため、U87およびU251細胞にNrf2発現プラスミドまたは空ベクターをトランスフェクトしました。18時間後、培地を交換し、細胞を50μMのCaAで24時間処理しました。その後、細胞をRIPAバッファーで溶解し、BCAタンパク質定量キットを用いて総タンパク質濃度を測定しました。その後、GSHおよびMDAの含有量は、製造元のプロトコルに従い市販の検出キットを用いて分析されました。

ROSアッセイ
細胞内ROS生成は、確立されたプロトコル25に従い蛍光プローブDCFH-DAを用いて評価されました。Briefでは、U251およびU87のグリオーマ細胞を24ウェルプレートにシードし、CaAの濃度(5、20、50μM)で処理しました。Nrf2過剰発現がフェロプトーシスに与える影響を評価するため、U87およびU251細胞にNrf2発現プラスミドまたは空ベクターをトランスフェクトしました。18時間後、培地を交換し、細胞を50μMのCaAで24時間処理しました。その後、細胞を37°Cで5μM DCFH-DAで1時間処理し、その後PBS洗浄で余分な染料を除去しました。蛍光信号はFITCフィルター(励起488nm、放出525nm)を装備した逆型蛍光顕微鏡で可視化され、画像を撮影して解析しました。緑色蛍光の強度が上昇すると、細胞内ROSレベルが上昇します。

動物実験
すべての動物実験は、米国国立衛生研究所(NIH)の『実験動物のケアと利用に関するガイド』の推奨事項に厳密に従って実施されました。このプロトコルは摰芳人民病院の施設動物ケア・利用委員会により承認番号[2025SDL579]となりました。グリオーマ異種移植モデルを作成するために、2×10個6個の U87細胞を0.2mLのPBSに再懸浮させ、4週間齢のオスのBALB/cヌードマウスの左脇腹に皮下接種しました。腫瘍の発生を7日間放置した後、マウスは3つのグループ(n=8群)にランダムに割り当てられました:未治療対照群、CaA処理群(2.5mg/kg)、CaA群(2.5mg/kg)とLip1群(10mg/kg)の併用群です。治療は14日間連続で毎日腹膜内注射を施しました。腫瘍の寸法は3日ごとにキャリパーで測定され、体積は以下の式で計算されました:体積=(長さ×幅²) / 2。21日目にすべてのマウスが安楽死され、腫瘍を切除して写真撮影を行い、さらなる解析を行いました。

RNAシーケンシングとKEGG経路解析
CaA曝露後の転写変化をプロファイリングするためにRNAシーケンシングが行われました。RNAの完全性は、Illuminaプラットフォームでのシーケンス前にマイクロボリュームUV-VIS分光光度計とキャピラリーベースの電気泳動システムを用いて確認されました。クリーンリードはHISAT2でヒト参照ゲノム(GRCh38)にマッピングされ、遺伝子発現はFPKMとして定量されました。DESeq2を用いて差異発現遺伝子を同定し(FDR < 0.05, |log₂FC| ≥ 1)、機能的濃縮はKEGG経路解析(調整P < 0.05)で評価されました。

分子ドッキング解析
分子ドッキングを用いてCaAとPI3K/Akt経路の相互作用を予測しました。ヒトPI3K触媒サブユニットp110α(PIK3CA)の結晶構造は、タンパク質データバンク(PDB ID: 8BFU)から取得されました。CaAの構造はPubChemから取得され、分子モデリングソフトウェアを用いてエネルギー最小化されました。分子ドッキング調製ソフトウェアを用いて、PIK3CA構造からすべての水分子と非必須配位子を除去し、水素原子を追加しました。PIK3CAのアクティブサイト(既知のバインディングサイト座標に基づく)を中心にドッキンググリッドが定義され、ドッキングアルゴリズムが用いられました。CaAの結合上位の結合ポーズは結合親和度(kcal/mol)に基づいて選定され、主要な相互作用を調べました。水素結合や疎水性接触などのタンパク質-リガンド相互作用は、分子可視化ソフトウェアと2次元相互作用マッピングツールで可視化されました。

安全性と廃棄物処理
DMSO、蛍光染料(DCFH-DA、フェロオレンジ)、固定剤などの化学試薬を用いたすべての実験は、適切な個人用防護具(PPE)(手袋や安全ゴーグルを含む)を着用したフームフード内で行われました。DMSOおよび蛍光プローブは皮膚を貫通する能力と細胞毒性の可能性があるため慎重に扱われました。ピペットチップ、培養皿、手袋などの汚染物質は指定された有害廃棄物容器に処分されました。動物組織や死骸は生物有害廃棄物として処理され、機関のバイオセーフティ規制および地域の環境ガイドラインに従って焼却または高解滅菌処理されました。

統計解析
すべての結果は標準偏差±平均(SD)として示されます。2つのグループ間の差異は、両側の学生t検定を用いて評価されました。複数群を対象とした分析では、一方元ANOVAと適切な事後比較(例えばTukey検定)を適用しました。p値が0.05未満であることは統計的有意性の指標と見なされました。

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結果

CaAによるU251およびU87細胞の増殖抑制および化学感受性のin vitro
図1A はCaAの構造を示しています。まず、正常なマウスのHT22神経細胞およびヒトのグリオーマU251およびU87細胞に対するMTTアッセイを用いてCaAの細胞毒性効果を評価しました。未処理細胞(0μM CaA)と比較して、CaAは72時間で100μM未満の濃度でHT22細胞の生存率に与える影響は最小限でした(図1B)。しかし、250μMおよび500μM CaAを72時間処理すると、HT22細胞の生存率はそれぞれ約40%と60%低下しました(図1B)。未処理の対照細胞(0 μM CaA)とは対照的に、CaAを72時間処理すると、U251およびU87グリオーマ細胞の増殖を用量依存的に有意に抑制しました。20μMおよび50μMでは、CaAはU87細胞でそれ...

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ディスカッション

CaAは、PI3K/Akt/mTOR経路とNrf2フェロトーシス防御機構という2つの重要な生存軸を独自に調節することで、膠芽腫において強力な抗腫瘍効果を示します。PI3K/Akt経路は、多形膠芽腫(GBM、最大88〜90%の症例で変異)において、PTENの喪失やRTK活性化によりしばしば過剰活性化され、増殖と治療抵抗性を促します。しかし、この経路を標的とするだけでは、GBMでは細胞抑制性や補償的機構を介してPI3K阻害を回避する傾向があるため、限定的なアポトーシスが得られています(26)。ここでCaAの二重作用は新規です。PI3K/Aktシグナル伝達を(PIK3CAへの直接結合による)阻害することで、重要なプロ増殖経路を抑制するだけでなく、抗酸化およびフェロトーシス保護遺伝子のマスター調節因子であるNrf2の分解も促進します27。この多角的なメカニズムにより、CaAはGBMの主要な防御であるがんシグナル伝達と酸化還元恒常性を崩壊...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Agilent 2100 Bioanalyzerカピラリーベース電気泳動システム
Annexin V-FITC アポトーシスキットRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)分子ドッキング準備ソフトウェア (ドッキングアルゴリズム)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3D分子モデリングソフトウェア
cDNA合成キットVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrangeプローブDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
フローサイトメーターBD BiosciencesFACSAriaIII Flow CytometryAnnexin V染色細胞を分析する機器
蛍光顕微鏡OlympusIX73FerroOrangeとDCFH-DAの蛍光を観察する機器
FTH1抗体Abcamab75973AB_1310150
GAPDH抗体Abcamab8245AB_2107448
GLS抗体Abcamab93434AB_10563527
GPX4抗体Abcamab125066AB_10972289
HT22マウス神経細胞株AddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIMEトランスフェクション試薬Polyplus-transfection114-07ポリマーベースのトランスフェクション試薬
Keap1抗体Abcamab139729AB_2732852
L-グルタミン (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+2D相互作用マッピングツール
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientificリピッドベースのトランスフェクション試薬
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
マイクロプレートリーダーThermo Fisher ScientificH1MMTTアッセイにおける吸光度測定機器 (490 nm)
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDropマイクロ容量UV-Vis分光光度計
Nrf2抗体Abcamab62352AB_945626
Nude BALB/cマウスVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM還元血清培地
PyMOL分子可視化ソフトウェア
QuantStudio 5リアルタイムPCRシステム
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol試薬Thermo Fisher15596026N/A
U251ヒトグリオーマ細胞株CLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87ヒトグリオーマ細胞株ATCCHTB-14CVCL_0022
ユビキチン抗体Abcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11抗体Abcamab175186AB_2715513

参考文献

  1. Bajwa, M. H., Anis, S. B., Yousaf, I., Shah, M. A. A 10-year survival-trend analysis of low-grade glioma and treatment patterns from an LMIC. Asian J Neurosurg. 18 (3), 533-538 (2023).
  2. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15 (1), 2769-2781 (2021).
  3. Karkon-Shayan, S., et al. Resveratrol as an antitumor agent for glioblastoma multiforme: targeting resistance and promoting apoptotic cell deaths. Acta Histochem. 125 (6), 152058(2023).
  4. Kuduvalli, S. S., et al. A combination of metformin and epigallocatechin gallate potentiates glioma chemotherapy in vivo. Front Pharmacol. 14 (1), 1096614(2023).
  5. Abdul Raheem, A. K., Dhannoon, B. N. Automating drug discovery using machine learning. Curr Drug Discov Technol. 20 (6), 79-86 (2023).
  6. Yang, J., et al. Automating biomedical literature review for rapid drug discovery: leveraging GPT-4 to expedite pandemic response. Int J Med Inform. 189 (1), 105500(2024).
  7. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  8. Desai, D., et al. Review of AlphaFold 3: transformative advances in drug design and therapeutics. Cureus. 16 (7), e63646(2024).
  9. Reinis, J., Reicher, A. Monitoring subcellular protein localization at scale in live cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (9), 673(2024).
  10. Kwon, Y. W., et al. Application of proteomics in cancer: recent trends and approaches for biomarkers discovery. Front Med (Lausanne). 8 (1), 747333(2021).
  11. Wang, X., Liu, Z., Ma, L., Yu, H. Ferroptosis and its emerging role in tumor. Biophys Rep. 7 (4), 280-294 (2021).
  12. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  13. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  14. Liu, Y., et al. Protein kinase B (PKB/AKT) protects IDH-mutated glioma from ferroptosis via Nrf2. Clin Cancer Res. 29 (7), 1305-1316 (2023).
  15. Su, H., Peng, C., Liu, Y. Regulation of ferroptosis by PI3K/Akt signaling pathway: a promising therapeutic axis in cancer. Front Cell Dev Biol. 12 (1), 1372330(2024).
  16. Song, L., Li, D., Gu, Y., Li, X., Peng, L. Let-7a modulates particulate matter (≤2.5 µm)-induced oxidative stress and injury in human airway epithelial cells by targeting arginase 2. J Appl Toxicol. 36 (10), 1302-1310 (2016).
  17. Liu, H., et al. Activation of PI3K/Akt pathway by G protein-coupled receptor 37 promotes resistance to cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer. Cancer Med. 12 (19), 19777-19793 (2023).
  18. Song, L., et al. miR-144-5p enhances the radiosensitivity of non-small-cell lung cancer cells via targeting ATF2. Biomed Res Int. 2018 (1), 5109497(2018).
  19. Song, L., et al. The Legionella effector SdjA is a bifunctional enzyme that distinctly regulates phosphoribosyl ubiquitination. mBio. 12 (5), e0231621(2021).
  20. Luo, J., et al. Acinetobacter baumannii kills fungi via a type VI DNase effector. mBio. 14 (1), e0342022(2023).
  21. Liu, K., et al. Trim27 aggravates airway inflammation and oxidative stress in asthmatic mice via potentiating the NLRP3 inflammasome. Int Immunopharmacol. 134 (1), 112199(2024).
  22. Song, L., et al. Legionella pneumophila regulates host cell motility by targeting Phldb2 with a 14-3-3ζ-dependent protease effector. Elife. 11 (1), e73220(2022).
  23. Gao, Z., Jiang, J., Hou, L., Ji, F. Lysionotin induces ferroptosis to suppress development of colorectal cancer via promoting Nrf2 degradation. Oxid Med Cell Longev. 2022 (1), 1366957(2022).
  24. Bai, X., et al. Maackiain protects against sepsis via activating AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Int Immunopharmacol. 108 (1), 108710(2022).
  25. Zhu, Y., et al. The protective role of zingerone in a murine asthma model via activation of the AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Food Funct. 12 (7), 3120-3131 (2021).
  26. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  27. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23 (1), 101107(2019).
  28. Cahuzac, K. M., et al. AKT activation because of PTEN loss upregulates xCT via GSK3β/NRF2, leading to inhibition of ferroptosis in PTEN-mutant tumor cells. Cell Rep. 42 (5), 112536(2023).
  29. Cai, J., et al. Fatostatin induces ferroptosis through inhibition of the AKT/mTORC1/GPX4 signaling pathway in glioblastoma. Cell Death Dis. 14 (3), 211(2023).
  30. Li, F. J., et al. System X(c)-/GSH/GPX4 axis: an important antioxidant system for the ferroptosis in drug-resistant solid tumor therapy. Front Pharmacol. 13 (1), 910292(2022).
  31. Guo, F., et al. Juglone induces ferroptosis in glioblastoma cells by inhibiting the Nrf2-GPX4 axis through the phosphorylation of p38MAPK. Chin Med. 19 (1), 52(2024).
  32. Tuncer, C., Hacioglu, C. Borax induces ferroptosis of glioblastoma by targeting HSPA5/NRF2/GPx4/GSH pathways. J Cell Mol Med. 28 (7), e18206(2024).

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Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

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