CUT&RUNを用いた神経内分泌小細胞肺がん細胞株におけるヒストン修飾および転写因子結合部位のゲノムワイドマッピング

サマリー

ヌクレアーゼを用いた最適化された標的下切断および放出法と、次世代シーケンシング(CUT&RUN-seq)プロトコルが、神経内分泌小細胞肺がん細胞株に対して記述されています。この技術は、SCLCの病理生物学におけるエピジェネティックおよび転写脱調の研究を可能にするため、さまざまなヒストン修飾および転写因子(例:E2F7)結合部位のゲノムワイドマッピングを可能にします。

要約

クロマチンリモデリングタンパク質および転写因子(TFs)は、小細胞肺がん(SCLC)の腫瘍生物学において重要な役割を果たします。ヒストン翻訳後修飾(PTM)およびTF結合部位のゲノム全体特性評価は、SCLCのより深いメカニズム理解や治療的介入の標的指名につながる調節DNA要素や遺伝子経路の特定に不可欠です。ヌクレアーゼを用いたターゲット下の切断と放出、続いて次世代シーケンシング(CUT&RUN-seq)は、特定のヒストン修飾をマッピングし、細胞ゲノ ム内の多様な タンパク質のDNA結合プロファイルを決定する強力な手法です。CUT&RUNでは、タンパク質A/Gに融合した微小球核酵素(MNase)が、クロマチン関連タンパク質のゲノム位置 に抗体を介して 誘導され、MNaseの活性化と切断により基礎となるDNA断片がバルククロマチンから放出されます。この局所的な消化により、配列決定に適した小さく遺伝子座特異的なDNA断片が生成されます。

ここでは、SCLCにおけるヒストン修飾H3K4me3(活性または開放プロモーター関連)およびH3K4me1(活性エンハンサー関連)、および転写因子E2F7のプロファイリングに関する詳細なプロトコルを示します。このプロトコルは、通常、大きな核、わずかな細胞質、懸濁中の非接着凝集体として特徴づけられる神経内分泌(NE)SCLC細胞株モデルに最適化されています。

概要

ヒスターン翻訳後修飾(PTM)と転写因子(TF)は遺伝子発現の中心的な調節因子です。アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化などのヒストンPTMは、主にN末端の尾部に存在し、クロマ^{チン構造1,2}に影響を与えます。がんでは、ヒストンPTMがしばしば調節不全を起こし、がん遺伝子の異常な活性化や腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングを引き起こします³。TFはプロモーターやエンハンサーの特定のDNA配列に結合して標的遺伝子を活性化または抑制し、しばしばクロマチンのリモデリングを調整するヒストン修飾酵素をリクルート^します。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HATs)、ヒストン脱アセチルラーゼ(HDAC)、メチルトランスフェラーゼ(HMT)など、ヒストンマークを書き出し、消去し、読み取る酵素は、がんで変異や調節が乱れることが多いため、治療的標的として魅力的な^5。

SCLCでは、エピジェネティックな変化と系統決定転写因子(LDTFs)が腫瘍生物学の主要な推進因子です^。遺伝的変異とは異なり、DNAメチル化やヒストン修飾を含むエピジェネティックな変異は、基礎となるDNA配列を変えることなく遺伝子発現を調節します。これらの修飾は腫瘍抑制遺伝子を沈黙させたり、がん遺伝子を活性化したりすることで、SCLCの攻撃的な行動を助長します。例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼKMT2Dは、大規模な実世界のSCLC患者コホート7で12.9%の変異頻度で頻繁に変異^し、ヒ ストンH3リジン4単一メチル化(H3K4me1)を引き起こします。これはゲノムの活性増強領域に関連するマークです。SCLCは分子的に多様な疾患です。SCLCは、4つのLDTFの差異発現に基づいて分子サブタイプに分類されます:アカエテス・スキュートホモログ1(ASCL1)、神経原性分化因子1(NEUROD1)、イエス関連タンパク質1(YAP1)、POUクラス2ホメオボックス3(POU2F3)。ASCL1およびNEUROD1を含む神経内分泌(NE)サブタイプは、SCLC症例の約70〜80%を占めます⁸。したがって、さまざまなSCLCサブタイプにおける異なるヒストンPTMおよびTF結合部位の分布とプロファイルを調査することで、治療的介入に脆弱なサブタイプ特異的遺伝子プログラムの解明が可能となります。

ゲノム全体レベルでヒストンPTMや配列特異的調節タンパク質の結合部位を特定する伝統的な方法は、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq⁾⁹です。しかし、ChIP-seqは多数の入力細胞を必要とし、ゲノム全体で高い背景情報が得られることが多いです。その結果、ChIP-seqは真の信号とノイズを区別するために標的タンパク質の高い濃縮を必要とし、効果的なデータ解析のために深いシーケンスが必要です。さらに、ChIP-seqで用いられるホルムアルデヒド架橋はエピトープを隠し、偽陽性^{結合部位を生成する}ことができます。ヌクレアーゼを用いたターゲット下の切断と放出、続いて次世代シーケンシング(CUT&RUN-seq)は、未保存細胞内でヒストンPTMおよびTF結合部位をその場でマッピングするための高解像度の代替手段です。この方法では、透過性細胞を対象のクロマチン関連タンパク質を標的とした抗体でインキュベートし、その後Protein A(G)-微小球核酵素(MNase)融合タンパク質と結合します。対象タンパク質の両側にある標的DNA消化を高カルシウム・低塩条件下で誘導し、特定のDNA断片を放出して精製します。精製されたDNA断片はバーコードシーケンスライブラリの構築に用いられ、これらは高スループットシーケンスのためにプールできます(11,12,13,14)。ChIP-seqと比較して、CUT&RUNは入力として有意に少ない細胞数を必要とし、背景ノイズを低く、架橋アーティファクトを避け、シーケンスリード数も少なくて済みます。これにより、がんにおける動的クロマチン状態をコスト効率よく研究するのに特に適しています。

CUT&RUN技術は、ヒストン修飾、TF結合部位、クロマチン関連複合体を含むクロマチン相互作用タンパク質のゲノム位置を調査するために開発され、エピジェネティックな調節構造を明らかにしています(^11,12)。この技術により、エンハンサー・プロモーター構造、転写ネットワークの調節、発生および疾患進行中のクロマチン状態動態の詳細な解析が可能になりました¹⁵。がん研究において、CUT&RUNはヒストンマーク^16,17およびがん転写因子の占有率を正確にマッピングし、系統特異的な調節プログラムや潜在的な治療標的の特定^{に役立ちます。}さらに、CUT&RUNはCD8+ T細胞¹⁷を含む細胞内および組織サンプル^18,19においても即座で実施可能です。

SCLCサブタイプにおけるPTMおよび転写因子E2F7結合部位のゲノム位置を検出するため、4つのSCLC NE細胞株モデル(H146およびDMS79(ASCL1サブタイプ)、およびH446およびH82(NEUROD1サブタイプ)にCUT&RUN-seqを適用しました。これらはKMT2D変異の有無にかかわらず含まれます。主にKMT2Dによって触媒される増強剤関連修飾であるヒストンマークH3K4me1と、ASCL1の補因子であることが示されたE2F7をプロファイル^{化しました。}活性プロモーターに関連するヒストンマークH3K4me3は正の対照群を担当し、IgGは陰性対照群を担当しました。

ここでは、SCLC NE細胞株の詳細なCUT&RUNシークシーク手順を提示します。これは、市販のCUT&RUNキット( 材料表参照)、SkeneとHenikoffのオリジナル研究^11、12、13、そして私たち自身の実験室最適化に基づいています。

プロトコル

注意:このプロトコル(図1)は、通常非準拠型の集合体や浮動クラスターとして成長するSCLC NE細胞株におけるCUT&RUN-seqの手順を段階的に示しています。

1. 細胞培養

1. 細胞株DMS79(ASCL1サブタイプ)、H146(ASCL1サブタイプ)、H82(NEUROD1サブタイプ)、H446(NEUROD1サブタイプ)を、13mLのRPMI-1640培地に胎児用牛血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(材料 表参照)を補足した75mLフラスコで維持します。細胞を培養盤で37°C、_CO25%で培養します。
   注:本研究で使用されたすべての細胞はATCCから購入され、短タンデム反復プロファイリングで認証されています。

2. 細胞透過化

注:適切な細胞透過化は、抗体、pAG-MNase、消化されたタンパク質-DNA断片が自由に細胞内外に拡散できるようにするために不可欠です。新しい細胞株でCUT&RUNプロトコルを開始する前に、効果的な透過化のための理想的なディジトニン濃度を決定するための最適化を行う必要があります。CUT&RUNプロトコルでは、95%以上の透過性(細胞の95%が「死んでいる」)を達成するための最低濃度を用いるべきです。

1. 5%のジトニンストック、プロテアーゼ阻害剤、スペルミジンを氷に置き、完全に解凍させます。
2. 表1に従ってウォッシュバッファーを準備し、バッファーを氷の上に保管してください。
3. 5%ストックのうち10μLを990μLのウォッシュバッファーと混ぜて、0.05%のディトニン作業液を準備します。ボルテックスでよく混ぜて氷の上に置いてください。
4. 前の溶液を逐次希釈して各チューブの最終体積1mLに希釈し、ディトニン(0.05%、0.01%、0.0001%)を生成します。次の希釈に進む前に、それぞれの希釈をボルテックスする。同時に、ウォッシュバッファーで0.05%ジメチルスルホキシド(DMSO)制御(合計100μL; 表2参照)を準備します。
   注:ジトニンとDMSOは有害化学物質です。注意して取り扱い、すべての廃棄物は適切にラベル付けされた有害廃棄物容器にし、蓋がしっかり閉められて処分してください。
5. すべてのディジトニン希釈溶液とDMSOコントロールは使用されるまで冷やしておきましょう。
6. 必要な細胞数は、通過条件の数に1回の試験に必要な細胞数を掛けて算出します。ピペッティングの変動に対応するためにさらに20%を加えます(例:5×10個^5セルの 5個の条件下で、約1.2 x 5 x 5 x 10個の⁵セルを準備)。
7. 600 × g で遠心分離し、室温(RT)で3分間必要な培養細胞数を採取します。ペレットを1×PBSの600μL(100μL、1条件プラス20%)で再懸濁させます。
8. PBS再懸濁細胞100μLを5本の1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに分けます。1本はディジトニン濃度ごとに、もう1本はDMSOコントロール用です。
9. チューブを600 × g で3分間RTで遠心分離します。
10. 上澄液を慎重に除去し、各ペレットを対応するディジトニンまたはDMSOコントロールバッファー50μLに再懸濁します。
11. サンプルをRTで10分間培養します。
12. 処理した細胞10μLとトリパンブルー10μLを混ぜ、10μLを細胞計数スライドに載せます。
13. 細胞カウンターを使って、生存可能な細胞(染色されていない)と生存不能で透過性の陽性細胞(染色された青色)を定量します。
14. トリパンブルー陽性細胞の割合が最も高いディトニン濃度を特定します。この濃度を下流のCUT&RUN実験に使ってください。DMSO対照が正常な健康細胞培養に典型的な生存能力を維持していることを確認しましょう。

3. カット&ランの順番

注:このプロトコルの試薬は5回の反応に対応しており、ピペッティング損失を考慮して追加されています。材料および機器の一覧については、 材料表を参照してください。各CUT&RUN実験には少なくとも2つの独立した生物学的複製が推奨されます。

1. 1日目
   1. CUT&RUNバッファ準備
      1. 表3に記載されている通り、プリウォッシュバッファー、25倍プロテアーゼ阻害剤、1Mスペルミジンを組み合わせて洗浄バッファーを準備します。
      2. 表3に従って5%のジジトニンを洗浄バッファーに加えて細胞透過バッファーを準備します。
      3. 表 3に記載された適切なディジトニン濃度で、EDTAを0.4 μLの細胞透過化バッファー100 μLに加えて抗体バッファーを準備します。用意したバッファーを氷の上に置きます。
      4. 残った細胞透過バッファーは2日目に使用するため4°Cで保存してください。
   2. コンカナバリンA(ConA)ビーズの活性化
      1. ConAのビーズサスペンションを優しく再サスペンドし、均等に分布させます。
      2. ビーズの懸濁液55μL(サンプルあたり11μL)を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      3. ビーズが完全に分離するまでチューブを1.5 mLの磁気ラックに置き、ピペットで上清液を除去します。
      4. すぐに500μLの氷冷ビーズ活性化バッファー(1サンプルあたり100μL)でビーズを2回洗います。各洗浄ごとに優しくピペットでビーズを再懸垂させ、洗う間に磁気ラックで上清液を捨てます。
      5. 最終洗浄後、上清液を取り除き、活性化ビーズを55μL(サンプルあたり11μL)の氷冷ビード活性化バッファーに優しく再懸濁させます。
      6. 8ストリップのチューブセットの各チューブに10μLのビーズを分散させ、チューブを氷の上に保管します。
   3. 細胞を収穫し、活性化ビーズに結合させる
      注:細胞の生存率は信号と背景比に重要です。しかし、SCLC NE細胞株の生存率は、細胞入れ替わり率が非常に高く、懸浮状態の中〜大型集合体として成長することを好む傾向があるため、70%〜90%と変動します。
      1. 37°Cのインキュベーターから細胞を取り出し、顕微鏡で検査して品質を確認します。
      2. 細胞懸濁液を50mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機で1,000〜1,2× 00g の湿度で5分間RTで投与します。
      3. 円錐形チューブから培地を吸引し、細胞ペレットを1×PBS20mLですすいでいます。
      4. 再び遠心分離し、PBSを吸引し、ペレットの大きさに応じて37°Cでアキュターゼで3〜5分間消化します。
      5. 消化を終えるためにPBSを5mL+10%FBSを加えます。血清学的ピペットで優しく上下にピペットすることで、単細胞懸濁液を得られます。
      6. 細胞を1,000〜1,200 g ×で5分間遠心分離し、上澄液を捨てて細胞ペレットを5 mLのPBSに再懸浮させます。
      7. 開始細胞の数を数え、細胞の生存性と完全性を確認しましょう。
      8. 反応数に反応あたりの細胞数を掛けて必要な細胞数(5×10⁵)を計算します。ピペッティング誤差を考慮して20%の余分を加えます(例:6×5×10×⁵ )。計算された細胞懸浮液を1.5 mLチューブに移します。遠心分離機は600 x gで、RTで3分。
         注意:バックアップとして少なくとも1つの追加リアクションを準備してください。
      9. 細胞をRTウォッシュバッファーで1回の反応で5×10個の密度で再懸浮させ、1回の反応あたり100μLを使い、均一な懸濁を確保するために優しく徹底したピペッティングを行います。600 x gの遠心分離機で3分間RTで加熱します。ピペットで上澄液を除去します。
      10. 洗う手順(ステップ9)をもう一度繰り返します。
      11. 8ストリップセットの各チューブに100μLの洗浄細胞を割り当て、10μLの活性化CoAビーズを含む。ピペットで優しく混ざり、ミニ遠心分離機で素早く回してスラリーを集めます(ビーズは沈殿してはいけません)。
      12. ビーズ細胞スラリーをRTで10分間培養し、細胞がビーズに結合できるようにします。
      13. チューブを0.2 mLのチューブ磁石ラックに置き、スラリーが透明になるまで待ち、ピペットで上清液を除去します。細胞がビーズに結合していることを確認するために、上清液を10μL残しておきましょう。残った上澄液を捨て、次のステップに素早く進みましょう。
      14. 磁石からチューブを外してください。各反応にすぐに50μLの氷冷抗体バッファーを加え、優しくピペットでビーズを再懸浮させます。
      15. 上清液10μLと抗体バッファーに再懸濁した細胞/ビーズ懸濁液10μLを10μLのトリパンブルーと混合し、細胞カウンタースライドに負荷をかけます。
      16. セルカウンターで分析してください。上清液にほとんどビーズや細胞が含まれておらず、ビーズと細胞の混合物にはビーズに囲まれた透過性のある細胞が含まれていることを確認します。
          注意:Cells CoAビーズの結合適合性を確認することが重要です。
   4. 透過性と抗体結合
      注:CUT&RUNの成功は、抗体が標的に対してどれだけ親和性を持ち、特定の実験条件下で特異的かに大きく依存します。以下のことを推奨します:1. CUT&RUNで検証済みの市販抗体を利用可能であれば使用してください。2. CUT&RUNで検証された抗体を持たない標的については、免疫蛍光(IF)で検証されたものを検討します。なぜなら、IF抗体は本来の細胞文脈でエピトープを認識するためであり、これはCUT&RUNにおける透過性細胞内の標的に抗体がin situ 結合するのと似ているからです。3. 3〜5種類の抗体を並行してテストし、特定の用途に最も効果的な抗体を特定します。
      1. K-MetStatパネルとピペットを素早く回して再サスペンドします。H3K4me3陽性およびIgG陰性対照群の反応に2μLのK-MetStatパネルを追加します。混合用のピペットとクイックスピンチューブ(オプション)。
      2. 各反応にH3K4me3、H3K4me1、IgG抗体をそれぞれ0.5 μg、さらに異なる由来のE2F7ポリクローナル抗体0.6 μgを加えます(表4)。8ストリップチューブにラベルを貼ってください。
      3. 各反応チューブを適切に混ぜるために優しくピペットを使いましょう。チューブキャップを上げたまま、4°Cの温度で一晩培養します。チューブを回転させたり反転させたりしないでください^。
2. 2日目
   1. pAG-MNaseの抗体への結合
      注意:ビーズが一晩で沈殿するのは正常であり、結果には影響しません。一晩の孵化後にビーズが塊状になったりベタベタになった場合は、優しくピペッティングして再び懸浮させてください。一貫性とスループットを向上させるために、マルチチャネルピペッティングが推奨されます。8ストリップチューブを使用する場合は、ConAビーズの乾燥を防ぐために、バッファーを1本ずつ取り外し・交換してください。
      1. マグネットスタンドを氷の上に置いてください。
      2. 8ストリップチューブを4°Cの培養から取り出し、素早く回転させて液体を集めます。
      3. スラリーが透明になるまでチューブをマグネットスタンドに置きます。慎重にピペットで拭き取り、上清液を除去します。
      4. チューブはマグネットスタンドに置いておく。200μLのコールドセル透過バッファーでチューブを2回洗浄します。ピペットで上清液を除去します。
      5. 磁石スタンドからチューブを取り出し、各反応にすぐに50μLのコールドセル透過バッファーを追加します。ピペットで優しくピペットでセルやビーズを再懸垂させます。
      6. 各反応に2.5μLのpAG-MNaseを加え、優しくピペッティングしてよく混ぜます。
      7. 反応をRTで10分間潜伏させます。
      8. チューブを素早く回して、スラリーがきれいになるまで磁石スタンドに戻します。ピペットで上清液を除去します。
      9. チューブをマグネットスタンドに置き、200μLのコールドセル透過バッファーで2回洗浄します。ピペットで上清液を除去します。
      10. 磁石スタンドからチューブを取り出し、50μLの冷たいセル透過バッファーに優しく再懸浮します。チューブを氷の上に置いてください。
   2. 標的クロマチンの消化と放出
      注意:アクセス可能なDNAの意図しないMNase切断を最小限に抑えるため、0°CでCa²⁺依存性消化を行うこと。¹²。大 腸菌(E. coli)などのスパイクインDNAを含め、全体のシーケンスリードの約0.5〜5%(理想的には~1%)を占めるように^します。スパイクインDNAはシーケンス深度の正規化に用いられ、特にシリーズ間のサンプル比較において重要です。例えば、ヒストン修飾酵素の抑制や遺伝的欠失後の全体的なヒストン修飾変化を評価する際にです。
      1. 8管ストリップ内の各反応に100 mM塩化カルシウム1μLを加えます(ステップ3.2.1.10以降)、氷上での処理。優しくピペットでビーズを完全に再懸浮させ、効率的な消化を確保してください。
      2. チューブを4°Cのヌターターで2時間孵化し、蓋を閉ざした端を高くします。
      3. 新しい1.5mLチューブでストップバッファーミックスを準備します。各反応ごとに、33μLのストップバッファーと1μLの 大腸菌 スパイクインDNA(0.5 ng)を組み合わせます。優しく渦巻きで混ぜます。
      4. 2時間のインキュベーション終了時に各反応に33 μLのストップバッファーを加えます。優しくピペッティングで混ぜます。
      5. 反応を37°Cの熱サイクラーで10分間孵育します。
      6. チューブを素早く回して底の内容物を集め、それを磁石ラックに置いて溶液が透明になるまで放置します。
      7. CUT&RUNで放出されたDNAを含む約84μLの上清液を、新鮮な1.5mLチューブに慎重に移します。
   3. DNA精製キットを用いたDNA精製( 材料表参照)
      注意:初回使用前に、DNA結合バッファーに6.9 mLのイソプロパノールを加え、DNAウォッシュバッファーには95%エタノール≥20 mLを加えてください。
      1. 各上澄液に420μLのDNA結合バッファーを加えます。ボルテックスで一瞬、しっかり混ぜる。
      2. DNAクリーンアップカラムをその採集チューブに入れます。
      3. 各サンプルを対応するカラムに読み込みます。
      4. 遠心分離機は16,000 g ×30秒RTで使用。フロースルーを廃棄し、カラムを収集チューブに戻します。
      5. 各カラムに200μLのDNAウォッシュバッファーを加え、16,000 x g で30秒間RTで遠心分離機にします。フロースルーは廃棄し、カラムを収集チューブに戻します。
      6. 洗濯の手順を一度繰り返します。
      7. 再び16,000 x g で30秒間RTで遠心分離機をかけ、残留洗浄バッファーを完全に除去します。
      8. カラムをラベル付き1.5 mLチューブに移します。
      9. カラム中央の膜に直接12μLの溶出バッファーを塗布します。
      10. RTで5分間培養し、その後RTで16,000 × g で遠心分離して1分間DNAを洗い出します。
          注意:ここは安全な停止地点です。脱出したDNAは-20°Cで保存し、将来の処理のために保管します。
   4. カット&ランDNA定量および断片サイズ分布解析
      注意:dsDNA高感度アッセイキットを用いて蛍光計を定量してください。これは吸収力ベースの方法よりも二本鎖DNAの測定精度が高いです。
      1. 各サンプルのうち1μLを使用して、DSDNA高感度アッセイキット(材料 表参照)を使ってCUT&RUN DNA濃度を測定します。
      2. さらに1μLのDNAを用いて、切断された断片の存在とサイズ分布を評価します。製造元のガイドラインに従い、高感度DNAキット(材料 表参照)を使用して断片解析を行います(任意)。
         注:ヒストン翻訳後修飾(PTM)などの非常に豊富な結合タンパク質は、この段階で容易に検出できます。しかし、低存在量の転写因子は検出がより難しい場合があります。
   5. ライブラリ構築、断片解析、シーケンス
      注:dsDNA高感度アッセイキット定量により測定された≤5 ngのCUT&RUN DNAが、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの構築に使用されました。アダプターのダイマーを最小限に抑えるために、アダプターをIlluminaから1μLに減らし、アダプターのリゲーションを行います。ライブラリ構築中のPCRサイクル数は、入力量、ライブラリー収率、重複率に応じて調整可能です。標的ヒストン、PTM、転写因子に応じて異なるDNA精製磁気ビーズ(材料 表参照)のサイズ選択戦略が使用されることがあります。
      1. ライブラリーの構築は、キットメーカーの指示に従い、CUT&RUNライブラリー準備キット( 材料表参照)を用いて、わずかな修正を加えて作成されました。簡単に言うと、ライブラリ準備の推奨入力として5ngのCUT&RUN DNAが使用されました。5 ng未満のDNAはライブラリー準備にできるだけ多く使ってください。各サンプルにはi5およびi7のデュアルインデックスプライマーが使用され、多重シーケンスの成功を確実にしました。
         注意:ここは安全な停止地点です。DNAはさらに処理のために-20°Cで保存可能です。
      2. CUT&RUNライブラリーの濃度を、蛍光計とdsDNA高感度アッセイキットで測定します。CUT&RUN NGSライブラリのサイズ分布は、高感度DNAキットガイドに基づく高感度DNAキット(材料 表参照)または同等の毛細管電気泳動装置TapeStation(材料 表参照)を用いて決定されました。
         注意:CUT&RUNライブラリを希釈し、dsDNA高感度アッセイキットおよび高感度DNAキットの検出範囲内に濃度を落としてください。
      3. 分子索引と一意索引の均等に基づくプールライブラリ(40-46)。DNA精製による磁気ビーズのサイズ選択後、プールライブラリーのペアエンドシーケンス(100 bpリード長)をIllumina NovaSeq 6000システムでハーフSプライム(SP)用に、推定1,000万リードの読み取り深さで実施しました。
   6. CUT&RUNデータ解析
      1. カスタムパイプライン(図5A)を使ってCUT&RUNデータを解析します。FastQCで読書品質を評価してください。Cutadaptを使って読み取り開始時からアダプターシーケンスを削除してください。ペアエンドリードをヒトゲノム(hg38)および大 腸菌 リファレンスゲノムとBowtie2にアライメントします。Samtoolsを使って未マッピングのリードを削除してください。Picardで重複リードを削除し、Bedtoolsを使ってbedGraphファイルを生成してください。DeepToolsでbigWig(黒白)ファイルを作成します。IGVとDeepToolsを使ってデータを可視化します。総リード数を急増した大 腸菌 のリード数に正規化します。ピーク呼び出しはSEACR(CUT^&RUNのための疎リッチメント解析)を用いて行われます。

結果

典型的または「古典的」なSCLC NE細胞株は、大きな核、わずかな細胞質、そして非接着型集合体または懸濁したコンパクト球状の増殖が特徴です。NCI-H146やDMS79のようなASCL1高細胞株や、NCI-H82やH446のようなNEUROD1高細胞株は、この典型的なSCLC表現型を示します。すなわち、細胞質が乏しく、細粒状のクロマチンを持つ小〜中型細胞、そして主に非接着型集合体またはコンパクト球状体として増殖する傾向があります。NEUROD1高モデルはNEマーカーの発現を保持しますが、神経分化、細胞骨格の再構築、細胞移動に関連する転写プログラムにおいて強化されています。例えば、NCI-H82は大きく緩やかに結合した懸濁集体で成長し、H446は混合型で約80%が付着細胞、20%が懸濁細胞で、幹状の特徴と表現型可塑性の両方が際立っています(図2)。

Agilentチップを用いた断片解析を用いて、ヒストンマークH3K4me3およびH3K4me1のCUT&RUN...

ディスカッション

エピジェネティックな調節異常とLDTFsはSCLC腫瘍生物学の主要な推進要因です^。SCLCにおける特定のヒストン修飾およびDNA結合タンパク質のゲノム分布を特定することで、獲得された治療抵抗性や表現型可塑性の潜在的なメカニズムを明らかにできます。CUT&RUN-seqは、細胞や^{組織からヒ} ストンおよび非ヒストンタンパク質-DNA相互作用を高解像度でマッピングする強力な手法です。このプロトコルは、SCLC NE細胞株における従来のChIP-seqアプローチに代わる効果的かつ低コストな代替手段を提示し、治療介入に適した新しい遺伝子経路を特定することを目的としています。

CUT&RUN-seqは通常、ChIP-seqに比べて背景ノイズが少ないです。しかし、バックグラウンド信号は依然として発生し、データ解析中にピーク呼び出しに悪影響を及ぼすことがあります。バックグラウンドリードを最小限に抑えるためには、最適な生存率を持つ細胞か...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>レジェント
RPMI-1640メディア	ギブコ・サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11875093	細胞培養培地
胎児用牛血清(FBS)	神経学	FBS002-HI	細胞培養培地の構成要素
1% ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ・サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122	抗菌薬、細胞培養の細菌汚染防止
トライパンブルー溶液、0.4%	ギブコ・サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15250061	トリパンブルー染色法を用いて自動細胞カウンターによる透過性評価に使用しました。
ロシュ cOmplete、EDTAフリーのプロイーズ阻害剤カクテル	ロッシュ	11873580001	プロテアーゼ阻害剤。ウォッシュバッファーの成分
5% ジジトニン	エピサイファー	21-1004	バッファコンポーネント バッファーのレシピはバッファシートで確認できます
ビーズ活性化バッファー	エピサイファー	21-1001	バッファコンポーネント バッファーのレシピはバッファシートで確認できます
コンカナバリンA(ConA)ビーズ	エピサイファー	21-1401	ConA共役常磁性微小球は、脂質膜結合を可能にするレクチン被覆磁性ビーズです
カット&RUN Kit	CUTANA ChIC エピサイファー	14-1048	CUT&の試薬RUN DNA生成
DNA精製キット	CUTANA エピサイファー	14-0050	反応イオンで上層から放出された標的DNA断片からDNAを抽出します。
カット&RUN ライブラリー準備キット	CUTANA エピサイファー	14-001	CUT&を生成します。RUN次世代シーケンシング(NGS)ライブラリ
DNA精製磁気ビーズ	アジャンコート AMPure XP ベックマン・カウルター	A63880	PCR製品のクリーンアップとサイズ選択(例:アダプター、ダイマー、プライマー除去)
大腸菌スパイクインDNA	エピサイファー	18-1401	一連のサンプルにわたるシーケンス読み取りのキャリブレーションに用いられます。例えば、治療済みと未治療の状態
pAG-MNase	エピサイファー	15-1016	一次抗体に結合すると、カルシウムによって活性化されると結合タンパク質の両側の標的DNA断片を切断します
PBS PH7.4 1倍	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)	10010-049	洗浄セル
プリウォッシュバッファー	エピサイファー	21-1002	バッファコンポーネント バッファーのレシピはバッファシートで確認できます
dsDNA高感度 アッセイキット	QubitTM サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Q32854	カット&RUN DNA定量
ストップバッファ	エピサイファー	21-1003	バッファコンポーネント バッファーのレシピはバッファシートで確認できます
高感度DNAキット	アジレント・テクノリギーズ	5067-4626	カット&RUN:DNAおよびNGSリブラ、クアタイフィケーションおよび断片サイズ分布解析
<ストロング>マテリアル<ストロング>
8ストリップ0.2mL PCRチューブ	エピサイファー	10-0009k	CUT&の管0.2mlチューブの磁気分離ラックに対応したRUN反応
LUNA 8チャンネルスライド	ロゴス・バイオシステムズINC	L72001	細胞数のスライド、nbsp;細胞の生存可能性と完全性のチェック
多チャネル試薬貯留槽	フィッシャー・サイエンティフィック	14-387-072	洗浄バッファー容器
DynaMagTM-2(磁気分離ラック)、1.5 mLチューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	12321D	ConAビーズは磁気分離ラックで貯蔵バッファーから分離され、その後1.5 mLマイクロ遠心分離機管内の活性化バッファー内で再懸濁されて活性化されました。
磁気分離ラック、0.2 mLチューブ	エピサイファー	10-0008	別々に立つこと...nbsp;ビーズ結合細胞、抗体、反応および洗浄バッファーからのpAG/MNase
エッペンドールリサーチと8チャンネルピペット、0.5-10 uL	エッペンドルフ	3125000010	吸引8ストリップ管のサンプル ワークフローを加速させるために、同等のマルチチャネルピペットを
エッペンドルフ Refrence 2 8チャンネルピペット、30-300 uL	エッペンドルフ	4926000050	吸引と洗浄のステップを高速化し、同等のマルチチャネルピペッター
<ストロング>装備
サイエンティフィック・インダストリーズ ボルテックス-ジーニー2ミキサー、可変速度、120V	フィッシャー・サイエンティフィック	50-728-002	ミニ遠心分離機とスピン
LUNA FX7自動セルカウンター	ロゴス・バイオシステムズINC	L70001	セルカウンター
ヌーテーティングミキサー	VWR	82007-202	ビーズのインキュベーションステップ(一晩の抗体培養、pAG-MNase消化反応)。
エッペンドルフ 6331 Nexus Gradient MasterCycler サーマルサイクラー	エッペンドルフ	6331	カット&RUN 次世代ライブラリの構築
量子ビット4フルオロメーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Q33226	DNA定量。
Agilent 2100バイオアナライザー	アジレント・テクノロジーズ	G2939A	CUT&の断片サイズ、濃度解析RUN DNAとCUT&RUN libraries, andnbsp;同等の毛細管電気泳動装置(例:Agilent TapeStation)
アジレント・テープステーション	アジレント・テクノロジーズ	G2992AA	CUT&の断片サイズ、濃度解析RUN DNAとCUT&RUN ライブラリ
イルミナ・ノヴァセクイション6000システム	イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国		プールされたCUT&のシーケンスRUN libraries