クルクミン(CUM)は、AKT/Wnt/β-カテニン軸を抑制することで膠芽腫(GBM)の進行を抑制します。本プロトコルは、CUMがGBMにおける悪性進行を阻害する分子メカニズムを調査し、CUMがこの経路を調節することでCUPがどのように誘導するかを評価する方法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
クルクミン(CUM)は膠芽腫(GBM)の悪性行為を調節することができます。本研究は、CUMがAKT/Wnt/βカテニンシグナル伝達経路を通じてGBMの進行を誘導することでGBMの進行を抑制するかどうかを調査します。最適なクルクミン濃度はMTTアッセイを用いて決定されました。A172およびU251細胞はCUM、AKT阻害剤MK-2206、Wnt阻害剤LGK974、Elsm-Cu(エレスクロモール+CuCl2)で処理されました。細胞増殖、移動、侵入、アポトーシスは、カルボキシフルオレセイン・スクシニミジルアミノエステル染色、スクラッチアッセイ、トランスウェルアッセイ、フローサイトメトリーをそれぞれ用いて評価しました。ミトSOX蛍光、タツノオトシゴ代謝解析、免疫蛍光、Cu2+ 検出、ウェスタンブロッティングを用いてミトコンドリア酸化ストレスおよびカプロプトーシスを評価しました。AKT/Wnt/β-カテニン軸はTCF/LEF1レポーターキットとウェスタンブロッティングを用いて解析されました。GBM異種移植モデルが確立され、5週間にわたりガヴェージでCUMを投与しました。腫瘍増殖、クープロプトーシス、およびAKT/Wnt/βカテニン経路タンパク質発現に対するCUMの効果が評価されました。細胞はin vitroで10μMおよび20μM CUMで処理されました。CUM治療は増殖、移動、侵入を抑えつつ、酸化ストレスとキュプロプトーシスを促進しました。また、CUMはWnt/β-カテニンシグナル活性を抑制しました。経路阻害により活性酸素種(3.7倍)およびCu2+ (3.1倍)のレベルが増加し、ジヒドロリポアミド・アセチルトランスフェラーゼの発現が減少し、悪性行動を抑制しました。ヌードマウスでは、CUMは腫瘍の増殖を有意に抑制し、キュプロプトーシスを促進し、AKT/Wnt/β-カテニン軸の活性化を阻害しました。私たちの結果は、CUMがAKT/Wnt/β-カテニンシグナル伝達を抑制し、キュプロプトーシシスを促進し、GBMの進行を妨げることを示しています。
概要
膠腫は中枢神経系(CNS)で最も多く見られる原発性頭蓋内悪性腫瘍です1。グレード4のグリオーマは通常、膠芽腫(GBM)を指し、予後は悪い2。GBMは非常に侵襲性の高い脳腫瘍で、中枢神経系悪性腫瘍の約50%を占め、中央値生存期間は3年未満です。悪性腫瘍の発生率が高く再発率が高いことで知られています(4.5)。現在、GBM治療は主に手術に依存し、放射線療法、化学療法、その他の包括的な治療法を補完しています6。免疫療法、バイオセラピー、ナノ医療などの新興治療戦略は前臨床試験で顕著な成果を上げています7,8ですが、全体の5年生存率は依然として4.3%にとどまります。最も一般的に使われている化学療法の治療法は、よく知られたStupp療法です。しかし、未メチル化MGMTのGBM患者では、全体の生存率は有意に延長されません。したがって、新しい治療戦略を探ることは患....
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プロトコル
すべての動物処置は、実験動物の人道的ケアと使用に関する確立された機関基準に準拠して実施され、機関動物倫理委員会によって正式に承認されました。可能な限り動物の不快感や苦痛を減らすための措置が講じられました。
化学化合物、染料、生物サンプルを用いた作業は、潜在的なリスクを軽減するために確立されたバイオセーフティの実践に従って行われました。パラホルマルデヒド、銅系試薬、DHEなどの潜在的に危険な物質は、手袋、マスク、安全メガネなどの適切な個人用防護具を用いて取り扱いました。使用済み試薬や汚染された使い捨て品などのすべての廃棄物は、指定されたバイオハザード容器に分類され、その後、機関および環境安全規則に則った認可された有害廃棄物管理サービスによって処理されました。全体的な実験設計は 図1に示されています。
図1
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結果
GBM細胞の生存能力の阻害と誘発された細胞死
まず、2時間、48時間、72時間のCCM介入後にNHA細胞の生存率に有意な変化は見られず(図2A)、これは使用されたCUM濃度が正常細胞に毒性影響を与えないことを示しました。対照的に、GBM細胞株(A172、U251、LN229、SHG-44)は、1 μM≥CUM濃度で有意に生存率が低下しました(P < 0.05-0.001)(図2B-E)。これらの結果に基づき、1μMおよび2μM CUMと4時間の曝露時間が後続の実験に選択されました。CUM処理後、A172、U251、LN229、SHG-44細胞のIC50値はそれぞれ21.62、37.99、66.11、49.2 μMでした(図2F)。そのため、A172およびU251細胞がさらなる研究のために選ばれました。CUMはA172細胞(3........
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ディスカッション
GBMの再発率はその悪性生物学的特徴と関連しています36。CUMは酸化ストレス、アポトーシス、オートファジー、転移、浸潤、主要な分子標的を調節することで抗GBM効果を発揮します37。本研究では、細胞レベルの実験により、CUMがGBM細胞死亡率を有意に増加させ、増殖、コロニー形成、移動、侵入を抑制することが示されました。これは以前の報告と一致する結果です。
クプロプトーシスはGBM30,38を含む様々ながんの進行と関連しています。バイオインフォマティクス解析により、CUMが肝細胞がん39におけるキュプロプトーシスに影響を与える可能性が示唆されていますが、GBM細胞でキュプロトソーシスを誘導する能力はこれまでの研究.......
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開示事項
著者たちは利益相反がないと宣言しています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1%の結晶バイオレット染色溶液 | サービスバイオ | G1014 | 標識セル |
| 4% パラホルムアルデヒド | ビヨタイム | P0099 | 細胞や組織を修復する |
| AKT阻害剤(MK-2206) | Selleck.cn、上海、中国 | S1078 | 特定AKT阻害剤 |
| 抗体(一次抗体および二次抗体) | ABclonal Technology(中国武漢) / abcam(ケンブリッジ、英国) / Servicebio(中国、武漢) / Beyotime(中国、上海) / Cell Signaling(マサチューセッツ州ダンバース、アメリカ合衆国) | A8814、ab32572、GB25303、ab15580、ab108257、ab246917、A8814、AF6708、AA326、4060、ab219412、280376、9322、ab97051、ab229025 | タンパク質発現レベルの検出 |
| 細胞アポトーシス検出キット | サービスバイオ、武漢、中国 | G1021 | アポトーシスの検出 |
| 細胞痕跡CFSE染料 | インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、アメリカ合衆国 | C34570 | 細胞増殖検出 |
| 化学発光イメージングシステム | Bio-Rad、カリフォルニア州ヘラクレス、アメリカ合衆国 | ケミドック XRS+ | 超高感度のタンパク質検出 |
| Cu2+比色測定キット | エラブサイエンス、武漢、中国 | E-BC-K300-M | 腫瘍組織およびGBM細胞におけるCu2+の検出 |
| CuCl2 | シグマ・アルドリッヒ、ダルムシュタット、ドイツ | 751944 | クプロプトーシス誘導器 |
| クルクミン(CUM) | 上海ソースリーフ、中国上海 | S19245 | ポリフェノール化合物 |
| DHE検出キット | ベヨタイム、上海、中国 | S0063 | ROSレベルの検出 |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | サービスバイオ | G4101-2 | MTTアッセイ用の溶媒 |
| ECL開発者 | サービスバイオ | G2161 | ウェスタンブロットに使用 |
| エレスクロモール | Selleck.cn | S1052 | クプロプトーシス誘導器 |
| フローサイトメトリー | BDバイオサイエンシズ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国 | BD FACSアリアIII | 細胞死およびCFSEアッセイに使用 |
| 蛍光顕微鏡 | オリンパス、東京、日本 | IX73 | 免疫蛍光、ROS、TUNEL、DHE、MMPアッセイに使用 |
| 膠芽腫細胞株A172(RRID: CVCL_0131)、U251(RRID: CVCL_0021)、LN229(RRID: CVCL_0393)、SHG-44(RRID: CVCL_6902) | Punosai Biotechnology有限公司、中国・武漢 | CL-0012、CL-0237、CL-0578、CL-0207 | ヒト膠芽腫細胞株 |
| GraphPad Prism 9.0 ソフトウェア | グラフパッド・ソフトウェア有限責任会社 | バージョン9.0 | 統計解析 |
| ImageJ 1.53kソフトウェア | 国立精神衛生研究所 | バージョン 1.53k | 統計的計算 |
| JC-1の動作解決策 | ソラルビオ、北京、中国 | M8650 | MMPの検出 |
| オスのBALB/cヌードマウス | スラックキングダ実験動物有限公司、湖南省、中国 | マウス実験 | |
| マイクロプレートリーダー | バイオテック、バーモント州、アメリカ合衆国 | ELX-800 | OD450 nmの測定 |
| 顕微鏡 | オリンポス | BX53 | 細胞スクラッチテスト、トランスウェル実験、免疫組織化学アッセイに使用 |
| ミトソックスプローブ | サーモフィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ合衆国 | M36008 | ROS検出に使用 |
| ミトトラッカー レッド CMXRos | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | M7512 | 生細胞におけるミトコンドリアの特異的標識 |
| MTT検知キット | サービスバイオ | G4101-1 | 細胞生存能力の検出 |
| 正常なヒト脳のアストロサイトNHA細胞(RRID:CVCL_B0DK) | 華拓バイオテクノロジー有限公司、中国・深圳 | HTX2408 | 対照実験用の細胞株 |
| 核タンパク質抽出キット | ビヨタイム | P0027 | 核タンパク質抽出 |
| タツノオトシゴ細胞エネルギー代謝分析装置 | アジレント、そしてnbsp;北京、中国 | シーホースXF | OCR検出に使用 |
| TCF/LEF1ルシフェラーゼリポーターキット | バイオラボテクノロジー株式会社、北京、中国 | Wnt/&β;-カテニンシグナル伝達経路の活性の検出 | |
| TUNEL検出キット | ビヨタイム | C1088 | 腫瘍組織におけるアポトーシスの検出 |
| Wnt阻害剤(LGK974) | Selleck.cn | S7143 | 特定Wnt阻害剤 |
参考文献
- Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
- Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
- Sahoo, ....
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