直流電場下でのヒト脂肪由来幹細胞の年齢依存的な電気誘導性の可視化

Summary

少数の女性ドナーのコホートでは、加齢によりhADSCの電気安定移動が減少しました。DCEFは遺伝子発現を変化させ(上行747、下行624)、ナトリウム輸送/チャネルGO項およびPI3K-Akt KEGG経路を豊かにし、因果関係を確立せずに加齢に関連した電気走行性への関与を示唆しました。

Abstract

ヒト脂肪由来幹細胞(hADSC)は組織再生と創傷治癒に極めて重要であり、その指向的な移動はこれらの治療効果を発揮するための前提条件です。電場(EF)は創傷修復中の細胞移動を導く重要な手がかりとしてよく知られていますが、hADSCの電気的特性、特にドナー特性(例:年齢)がこの挙動やその基礎となる分子メカニズムをどのように調節するかについては、まだ十分に理解されていません。この知識のギャップは、hADSCの再生医療における最適な応用を制限しています。本研究では、まずhADSCにおける電気誘導性の存在を検証し、その電圧依存性を確認しました。すなわち、100〜200 mV/mmの直流電場(DCEF)下で、hADSCはアノードに向かって方向性に移動し、より強いEF強度は移動の方向性と速度の両方を向上させました(0 mV/mm制御時とは対照的です)。次に、200 mV/mm DCEF刺激後にRNAシーケンシング(RNA-seq)を用いて、若い女性ドナー(27.00 ± 4.58歳)および高齢女性ドナー(62.33 ± 4.04歳)のhADSCを比較しました。トランスクリプトミクス解析により、高齢hADSCにおいて747のアップレギュレーション遺伝子と624基のダウンレギュレーション遺伝子が確認され、電気走行に重要な生物学的プロセス・経路(ナトリウムイオン膜貫通輸送、電圧ゲートナトリウムチャネル活性(GO項)、PI3K-Aktシグナル伝達経路(KEGG経路)に富む差異発現遺伝子(DEGs)が確認されました。機能的には、高齢hADSCはDCEF刺激下の若いhADSCと比較して、陽極移動(累積距離、ユークリッド距離、直接性の減少)を有意に減少させました。本研究はhADSCにおける年齢依存的な電気走行性の初の証拠を提供し、ドナーの年齢が電気攻撃能力の低下と相関していることを示しました。さらに、ナトリウムチャネル活動の調節不全やPI3K-Aktシグナル伝達がこの加齢による低下の背景にある可能性を示しています。これらの発見はhADSC電気誘導の潜在的な調節メカニズムを示し、hADSCベースの治療(例:最適なドナー選定やナトリウム/PI3K-Akt経路の標的化)を組織再生と創傷治癒の改善に向けた新たな知見を提供します。

Introduction

脂肪由来幹細胞(ADSC)は強い自己更新能力と顕著な再生能力を持っています。適切な誘導条件下で、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などに分化^{することができます。}パラクリンシグナル伝達を通じて、ADSCは血管やリンパ管の生成を支援できます^2,3、瘢痕形成の抑制4、^{免疫調節効果を示す}5。したがって、ADSCは再生医療における細胞ベースの治療に理想的な種子細胞と考えられています。

ADSCの機能は、ドナーの年齢、体格指数、性別など、細胞療法における潜在的な有効性に影響を与えるさまざまなドナーの特徴によって影響を受けます。⁶.高齢ドナー由来のADSCは、より顕著な加齢特性を示し、脂肪生成分化の可能性、骨形成分化の可能性、^{移動能力の}低下を示します^7,8,9。さらに、ケラチノサイト増殖を促進し、体の自己修復機構を刺激する能力も低下します¹⁰。

細胞指向移動は創傷治癒と組織再生における重要な生理学的メカニズムであり、電場(EFs)は細胞移動の誘導と創傷修復の促進に重要な役割を果たします¹¹。例えば、上皮バリアが損傷すると、内因性電場が即座に発生し、傷口が治癒して上皮バリア機能^{が回復する}まで持続^します。指向性細胞移動を導く信号の一つとして、電気信号は接触抑制、機械的力、化学安定性因子など他の共存信号よりも優先度が高いことが示されています^15,16。創傷治癒や組織再生を促進するために、薬物や人体内の内因性電場を増強または模倣する外部電気刺激装置など、いくつかの方法が開発されています(^17,18)。細胞が電場勾配に従って移動する能力は電気タキシスと呼ばれます。in vitroの研究では、多くの異なる種類の細胞が電場内で指向移動を行うことが示されています。哺乳類の頭蓋神経冠細胞、ヒトアストロサイト、ヒト乳がん細胞など、アノードに向かって移動する細胞もあります(19,20,21)。他の細胞は陰極に移動し、例えばヒトの腎管上皮細胞、ヒトの皮線維芽細胞、ヒト好中球^22,23,24などがあります。ADSCは直流(DC)電場でアノードに向かって移動するように誘導され、長時間の培養条件下では、細胞の^{生存能力を維持し}つつ、外因性パルス電流がADSCのアノードへの方向性移動を効果的に促進することが示されています。現在、ヒト脂肪由来幹細胞の電気走行特性に関する研究は乏しく、その電気的特性を調節する根本的なメカニズムも完全には解明されていません。

私たちは、勾配直流電場(DCEF)下で若年女性ドナーと高齢女性ドナーのhADSCにおける年齢依存的な電気戦略の違いを体系的に調査し、トランスクリプトミクス解析を用いてナトリウムチャネル活性およびPI3K-Aktシグナル伝達に関わる基礎メカニズムをさらに明らかにした初めての研究者です。本研究では、DCEFがhADSCsに与える影響を検討しました。RNAシーケンシングと差異遺伝子豊富解析を用いて、DCEF刺激後の若年および高齢女性ドナーから派生した2つのhADSCグループの遺伝子発現プロファイルを比較し、年齢に伴う転写の違いを特定しました。私たちは、ドナーの加老がhADSCの電気的特性応答性を損なうと仮説を立て、この加齢による低下はナトリウムチャネル活性の変化やPI3K-Aktシグナル伝達と関連していると考えました。

Protocol

組織採取前に全参加者からインフォームドコンセントが取得されました。本研究は中国医科大学第一附属病院倫理委員会(承認番号:[2018]2018-110-2)により承認されました。組織採取前に全参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました

hADSCの分離と文化
組織採取: 中国医科大学第一附属病院形成外科で実施された通常の選択的脂肪吸引手術中に、ヒト腹部脂肪組織サンプルが採取されました。すべてのドナーは健康な女性ボランティアで、美容的腹部脂肪吸引を受けており、研究目的で追加の外科的介入は行われていません。組織標本は、誤嚥直後に手術外科医が無菌条件下で採取し、30分以内に氷の上で滅菌容器に入れて検査室に移されました。

サンプルサイズ: 本研究には合計6名のドナーが含まれ、3名の若年ドナー(年齢:27.00歳±4.58歳)と3名の年長ドナー(年齢:62.33歳±4.04歳)が含まれていました。

組織処理: 脂肪組織断片を50 mLの円錐形チューブに移し、1,800 x g で4°Cで3分間遠心分離し、上部油相を慎重に吸引して過剰な脂質を除去します。組織ペレットに0.2%のコラーゲンナーゼIV(最終量:脂肪組織1gあたり5〜10mL)を加え、チューブを37°Cの水浴またはインキュベーターに45分間置きます。消化中は10〜15分ごとにチューブを優しくかき混ぜて、コラーゲナーゼと組織の均一な接触を確保してください。消化後、低グルコースDMEMを10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足して反応を終了させます(中和培地とコラーゲン酵素溶液の体積比=1:1)。

注意:コラーゲナーゼを扱う際は、使い捨て手袋、白衣、安全ゴーグルを着用して皮膚や目を合わせないようにしてください。試薬は生物安全キャビネット(BSC)で準備・使用してエアロゾル汚染を防ぎ、漏れた場合は直ちに75%エタノールで拭き取り、汚染物質は生物廃棄物として処分してください。

細胞分離: 中和化された消化混合物を1,200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞にペレットを送ります。上清液を廃棄し、ペレットを赤血球溶解バッファー(155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM EDTA、pH 7.4、1粒あたり2-3 mL)で再懸浮させ、室温(22-25°C)で5分間培養して残留赤血球を溶解します。細胞懸浮液を200μmのストレーナーで順次ろ過し、未消化の組織残渣を除去して単細胞懸濁液を得る。

細胞数計: シード前に、ヘモサイトメーターで細胞数を定量化しました。簡単に、hADSCを0.25%トリプシン-EDTAで分離し、培養培地に再懸浮させ、0.4%のトリパンブルー溶液と1:1で混合しました。生存可能な細胞(染色されていない)は、光学顕微鏡下でノイバウアー血液細胞計を用いて手動で数え、総生存細胞数は細胞数/mL = (平均計数細胞 × 希釈係数 x 10⁴)として計算されました。

細胞培養: ろ過細胞を5 x 10³ cells/^cm ²の密度で培養培地(低グルコースDMEM + 10% FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)で播種し、37°Cで5%_CO2と共に培養します。培地は2〜3日ごとに交換し、非接着細胞を除去し最適な培養条件を維持します。その後の実験で使用されたすべてのhADSC(細胞特性解析(表面マーカー検出、三系統分化アッセイ)、DCEF刺激、移動および形態解析、老化・増殖アッセイ、RNAシーケンスなどは、パッセージ3から5に位置していました。

hADSCの特徴付け
細胞表面マーカーの発現:細胞を70%のコンバーシティまで培養し、その後0.25%トリプシン-EDTAで接着細胞を解離(37°Cで3分間インキュベーク)。細胞懸濁液を300 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を廃棄し、細胞ペレットを1x PBS(容量:1-2 mL)で再懸浮させます。1サンプルあたり1×10個^の5細胞(1×1×PBSに再懸濁)を100μLで抽出し、指定された希釈で蛍光共役抗体を加えます:抗CD44(1:50)、抗CD90(1:100)、抗CD29(1:50)、抗CD73(1:50)、および抗CD105(1:20)^1,4,7。蛍光分子の消滅を防ぐため、抗体-細胞混合物を4°Cの暗闇で30分間培養します。培養後、1,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を完全に吸引します。ペレットを1-2 mLの1x PBSに再懸浮させ、再び1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清液を捨て、この洗浄を2回繰り返して結合していない抗体を除去します。最後に、細胞ペレットを200μLの新鮮な1x PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで蛍光データを取得し、FlowJoソフトウェア(v10)で定量解析を行います。ゲートワークフローは標準的なMSC表現型付け手順に従っていました。FSC-SSCゲートでデブリを除外し、サイズと粒度に基づいて主細胞集団を選択し、その後FSC-A対FSC-HおよびSSC-A対SSC-Hのプロットを用いたダブルト排除を行い、単一細胞イベントを確実にしました。次に、トリパンブルー陽性またはPI陽性の死細胞を除外するために生細胞ゲートが行われました。単一染色対照群には蛍光ゲートが施され、染色されていない対照群はCD29、CD44、CD73、CD90、CD105(陽性マーカー)、CD34、CD45(陰性マーカー)の閾値を設定しました。代表的なゲートプロットをエクスポートし解析し、hADSCの同一性を確認しました。

微分ポテンシャル
脂肪形成分化: P3生成hADSCを85%のコンフルエンシーで0.25%トリプシンEDTAを用いて採取し、24ウェルプレートに1×10⁵セル密度でシードし(完全なDMEM培地を使用)、37°Cで5%_CO2 で培養し、再び85%のコンフルエンシーに達するまで培養します。誘導時には、脂肪生成分化キットを使用し、マニュアルに従ってキットA(脂肪生成誘導剤)とB成分B(脂肪形成維持剤)を再構成し、最初の3日間は成分Aを使用し、その後1日間は成分Bに切り替えます。このサイクルを3週間繰り返します。染色の場合は、誘導培地を吸引し、細胞層を破壊しないよう1xPBSを3mLで優しく洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で20分間固定し、その後0.3%オイルレッドO溶液(60%イソプロパノールで調製)で室温で15分間培養します。細胞を1倍PBSで3回洗浄して余分な染色を除去し、その後倒立光学顕微鏡で脂質滴を20倍画像化します。

骨形成分化: hADSCを12ウェルプレートに1×10⁵細胞密度でシードし、細胞が85%の合流に達したら、骨形成分化キットを用いて誘導します。低グルコースDMEM(最終濃度:10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1 μMデキサメタゾン、10 mM β-グリセロリンリン酸)で、キットA(骨生成誘導剤)および成分B(骨生成サプリメント)を再構成します。 0.05 mM アスコルビン酸-2-リン酸)を使い、3週間にわたり3日ごとに培地を更新します。染色時は、4%PFAで室温で15分間固定し、その後PBS1で3回洗浄し、その後2%アリザリンレッドS溶液(pH4.2、脱イオン水で調製)で室温で30分間培養します。細胞を1倍のPBSで3回洗浄して結合していない染色を除去し、その後位相差顕微鏡でカルシウム沈着結節を20倍画像化し、ImageJソフトウェアを使ってアリザリンレッドS陽性結節の面積を測定して石灰化を定量化します。

軟骨性分化: 250,000 hADSCを500 x g で4°Cの15 mL円錐形チューブで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成し、チューブに500 μLの完全なDMEM培地を加え、37°Cで5%_CO2 と共に一晩培養してペレットを安定化させます。翌日、軟骨形成分化キットを用いて誘導し、キットA(軟骨誘導剤)を_CO2非依存培地(最終濃度:1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10 ng/mL TGF-β3、50 μg/mL アスコルビン酸-2-リン酸、100 μg/mL ピルビン酸ナトリウム)で再構成し、培地を3日ごとに優しく更新します(ペレットを乱さないように)。誘導3週間後、細胞ペレットを室温で4%PFAで30分間定着し、固定剤を吸引し、0.1%(w/v)トルイジンブルーO溶液(0.1 M酢酸ナトリウムバッファー、pH4.0で調製)を室温で15分間インキュベートし、染料を吸引し、脱イオン水でペレットを3回洗い流して余分な染料を除去します。 その後、明視野顕微鏡(20倍)で画像を撮影し、ImageJソフトウェアを用いてトルイジンブルーO染色の平均光学密度(OD)を測定して硫酸化プロテオグリカンの蓄積を定量化します。

注意:4%PFA(有毒かつ腐食性の試薬)を扱う際は、蒸気の吸入や皮膚・目への接触を避けるために使い捨て手袋、白衣、安全ゴーグルを着用し、完全に排気フード内で作業してください。接触があった場合は、すぐに流水で15分間すすいで医療機関を受診してください。有害廃棄物処理では、使用済みPFAおよびPFA汚染物質(例:ピペットチップ、プレート)を専用の化学廃棄物容器(PFA廃棄物)に収集し、生物廃棄物と混ざり合わないように管理する施設の有害廃棄物プロトコルに従って処分してください。

エレクトロタクシスチャンバーアセンブリ:10cmのペトリ皿の蓋に、中心線の反対側に直径0.75cmの穴を2つ開け、皿の縁から1cm離れた位置に設置します(天井と塩の橋を設置するため)。ペトリ皿の底部の中心線に沿って、各端から4cmの位置に、長さ≤cm、幅≤1cm)の薄い真空グリースを塗布します(図1A)。滅菌された細かい鉗子を使い、各グリースパッチに1cm×2cmの無菌ガラスカバースリップを当て、優しく押して密閉を確実にします(カバースリップの破損を避けてください)。図1B-C)。各カバースリップの上にさらに薄く真空グリースを塗り、次に2枚目の滅菌済み1cm×2cmのガラスカバースリップをグリースに直接置いてダブルカバースリップスタックを作ります。2つのカバースリップ間がしっかり密閉されるように優しく押します(媒体漏れを防ぎ、図1D)。カバースリップスタックの左上角から最も近い皿の端へ、反対側のスタックの右下角を最も近い端につなぐ斜めの線に沿って、真空グリースを塗布して連続したバリアウォールを形成します。壁は皿の底にしっかり密着して(隙間がなく)、高さ約2cm、幅約0.5cmであるべきです(図1E)。組み立て済みのチャンバーをUV光で20分間滅菌し(微生物汚染除去)、その後室温で滅菌状態で保存し、使用まで保管します(図1F)。

DCEF刺激: 細胞シーディング用の滅菌ガラススライドを10cmのペトリ皿に入れ、37°Cで5%の_CO2 で一晩培養してスライドを前処理(細胞付着促進)します。スタインバーグ溶液を、10xストック溶液10mLをddH_2O(滅菌;最終濃度:58 mM NaCl、0.67 mM KCl、0.44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O、0.83 mM MgSO₄7H₂O、10 mM HEPES、10 mM HEPES、pH 7.4)で希釈して準備します。準備したスタインバーグ溶液20mLに0.3g寒天を加え、電子レンジで20秒加熱して寒天が完全に溶けて溶液が透明になるまで加熱し、その後すぐにカスタムガラス塩橋に熱いアガーとスタインバーグの混合物を充填し、室温で固化させます。固化後、塩橋をUV光で15分間滅菌し、2つのビーカー(それぞれ30 mLのスタインバーグ溶液を含む)をUV光で15分間滅菌します。プレコンディショニング済み滅菌スライドにP3生成hADSCを2 x 10⁴ cells/cm²の密度でシードし、37°Cで5%_CO2 を含んで24時間培養して細胞の接着を促します。 次に、細胞シードされたスライドを組み立てた電気走行チャンバーの滑走路に移し、無菌のサイドスライドで固定します(動きを防ぐため)。滑走路を3cm×2cmのガラスカバースリップを真空グリースの上に置き、優しく押して密閉を確実にし、上部カバースリップの縁に追加のバリアを塗ってバリアを形成して(中程度の蒸発を防ぐ)ことで滑走路を密閉します。チャンバーの貯蔵庫に_CO2非依存培地(10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補給;1リザーバーあたり5〜8 mL)で満たし、ペトリ皿の蓋の穴から滅菌した寒天塩ブリッジを挿入します(一方の端はチャンバーの媒質貯蔵庫に浸し、もう一方の端はスタインバーグ溶液入りビーカーに浸します)、そしてビーカーをAg/AgCl電極を介して電源に接続して安定した直流を供給します。2 V/cmの直流電場(DCEF)を4時間かけて適用し、デジタルマルチメーターで15分ごとに電圧を監視(必要に応じて一定の電界強度を維持できるように調整)、ソフトウェア(5倍の対物レンズ、明視野モード)で4つのランダムな電場で5分ごとにセル移動のタイムラプス画像を撮影します。

注意:電気機器を使用する際は、電源と電極を乾燥させ、感電を避けるために非導電面に置くことを必ず確認してください。電極の接続・取り外し時には絶縁手袋を着用し、設定調整前に電源を切り、電気部品に漏れがある場合はすぐに電源を切り、75%エタノールに浸した吸収性の紙で拭き取ってください。本研究では、電気泳動チャンバーの厚さを最小化し約1mmに保つことに加え、チャンバー両端で多点電圧測定を行うことで、電場強度の変動を10%以内に制御しました。この条件下では、培養領域内の電場分布はほぼ均一である^{と考えられ}ます。

移動と形態解析
ライブイメージング: DCEF刺激下のhADSCでは、タイムラプス画像シーケンス(5分間隔)をImageJソフトウェアにインポートし、Manual Trackingプラグインを使って開始点(t=0)から刺激終了点(t=4時間)までの4つの独立したフィールドにわたる100セルを手動で追跡し、平均移動速度(μm/min)と方向性(D/T比、D = 開始点から終了までの直線距離)を計算します。 T = 総経路長)を用いて、ケモタキシスツールプラグイン(ImageJ)を使用しています。

追跡: 電気光学的挙動を定量化するために以下の移動パラメータを計算します:指向性(Σcosθi/n、θiはセルの変位ベクトルと電場の方向(EF)の角度、nは追跡セルの総数で、-1から1の範囲で、1に近いほどアノード指向移動が強いことを示します)、累積距離(刺激期間中に各セルが通過した総経路長、 μm)、追跡速度(累積距離を刺激時間で割ったμm/h)、およびユークリッド距離(各セルの直線の開始から終了までの変位(μm、純移動を反映)です。

形態計測: DCEF刺激後、室温で4% PFAを20分間固定し、1xPBSで3回洗浄、室温でPhalloidin-TRITC(1xPBSに1:500希釈、24ウェルプレート用200μL)で細胞骨格を染色し、DAPI(1μg/mL、1xPBS;体積): 1ウェルあたり100μL)を5分間投与します。細胞は蛍光顕微鏡で20倍倍率で画像化され(代表的な高解像度画像は40倍で撮影されました)。ファロイジン-TRITCは励起波長540-555 nm、発光波長565-580 nmで可視化され、DAPIは励起波長358-405 nm、発光波長420-480 nmで撮影されました。次にImageJで以下の形態パラメータを測定します:長軸(最大フェレット直径、セル周囲の任意の2点間の最長距離)、垂直長(セルの長軸に垂直な幅)、および垂直性(sinα、セルの長軸とEF方向の角度α、値が高いほどEFとの整合性が高いことを示します)。

老化および増殖アッセイ
SA-β-Gal染色: 老化検出キットを使って、明視野顕微鏡(20倍対物レンズ)で老化細胞(青色染色細胞)を特定します。6ウェルプレートに種P3生成hADSCを2×10⁵ セル密度で設置し、80%の濃度まで培養し、培地を吸引し、1xPBSで優しく3回洗浄、1ウェルごとに1mLの固定液(キット付属)を加え、室温で15分間培養、1xPBSで3回洗浄して残留固定液を除去します。 1ウェルごとにSA-βガロン染色作業液0.5mL(キットマニュアルに従い50μLのSA-βガロン基質と450μLの染色バッファーを混合して作成)、蒸発防止のため透明膜でプレートを密封し、37°Cで16〜18時間(_CO2 曝露はpH変化や酵素活性抑制)を控えた。 翌日、1井戸あたり≥10個のランダムフィールド(10倍の目標値)の明視野画像を撮影し、青色(SA-β-gal⁺)セル数と総セル数を数え、老化セルの割合を(SA-β-gal^+セル 数/総セル数)×100として計算します。

Ki67免疫染色
SA-βガル染色後、染色液を吸引し、細胞を1倍PBSで2回洗浄し、0.1%トリトンX-100(1倍PBSで調製、1mL/ウェル)で細胞膜を透過させて室温で10分間、非特異的抗体結合を5% BSA(1倍PBS、1mL)で室温で1時間遮断します。その後、細胞は抗Ki67一次抗体(1%BSA/PBSに希釈1:200、1ウェルあたり500μL)を4°Cで一晩培養しました。翌日、細胞は1回のPBSで3回洗浄され(各5分)、結合していない一次抗体を除去し、Alexa Fluor 488 488結合二次抗体(1%BSA/PBSに1:500希釈、1ウェルあたり500μL)を室温で暗闇で1時間培養しました。細胞は再び3回1x PBSで洗浄され、DAPI(1 μg/mL in 1x PBS; 200 μL / Well)で5分間カウンター染色されました。蛍光画像は蛍光顕微鏡で20倍倍率で撮影され(代表的な高解像度画像は40倍で取得)。Alexa Fluor 488標識されたKi67⁺ 細胞は、励起波長485-495 nm、発光波長515-545 nmで可視化され、DAPI染色核は励起波長358-405 nm、放出波長420-480 nmでイメージングされました。増殖細胞の割合は次のように計算されました:(Ki67⁺ 細胞数 / DAPI⁺ 核系数)×100。

注意:一次抗体および二次抗体を扱う際は、汚染を防ぐためにBSC内で作業し、繰り返しの凍結融解サイクルを避けるために抗体を一度使い量に分け、抗体汚染物質(例:ピペットチップ、プレート)を専用のオートクレーブ可能な生物廃棄物袋に集め、廃棄前にオートクレーブ消毒で滅菌してください。

hADSCの年齢依存的電気走行分析: DCパルス電源を使用して、0 mV/mm(コントロール)、100 mV/mm、200 mV/mmの3つの強度のDCEFを生成し、ライブセルワークステーションを用いて細胞移動をリアルタイムで観察・記録し、各EF強度に対して、若年および高齢女性ドナーからのhADSCの陽極移動能力を累積距離測定して定量的に比較します。 ユークリッド距離、追跡速度、指向性を測定し、グループごとに3つの独立した生物学的複製を用いて結果の信頼性を確保します。ImageJ(NIH)の手動トラッキングおよびケモタキシスツールプラグインを用いて、電気戦線移動パラメータを定量化しました。個々の細胞は4時間の刺激期間全体を手動で追跡し、以下のパラメータが標準的な方法で計算されました:累積距離:記録期間中に各細胞が移動した総経路長。ユークリッド距離:セルの開始位置と終了位置の間の直線距離。履帯速度:累積距離を総追跡時間(μm/h)で割ったものです。指向性:各変位ベクトルと電場ベクトル間の角度(θ)の平均余弦として計算されます(値は-1から1の範囲で、1に近い値は強い陽極移動を示します)。

RNAシーケンス
RNA抽出と調製: 氷入り容器をUV光の下で15分間滅菌し(RNAの安定性を保つため)、その後の手順はすべて氷の上で行います。hADSCシード入りガラススライド(1 cm x 2 cm)を電気誘導チャンバーから無菌ペトリ皿に移し、3 mLの氷で冷たい1x PBSで細胞を3回洗浄します(PBSを優しく加え、軽く攪拌し、残留培地を除去するために完全に吸引します)、その後各スライドに1 mLのTRIzol試薬を加え、室温で20分間培養して細胞を完全に溶解します(溶解液が細胞層全体を覆うように)。溶解液をRNaseフリーの1.5 mL遠心分離機チューブに移し、クロロホルム0.2 mLを加え、15秒間強く渦巻いて相分離を誘導し、その後15分間氷上で培養し、その後12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 これにより、溶解液は3層に分けられます:RNAを含む上部水相、中間層のタンパク質層、そして下部有機相です。上部水相(≈ 0.5 mL)を新しいRNaseフリーチューブに慎重に移し(中間層には触れないように)、イソプロパノール0.5 mLを加え、RNAを沈殿させるために優しく渦巻き、氷上で10分間培養、その後12,000 x g で遠心分離機で4°Cで10分間加熱します。RNAはチューブの底に白いペレットを形成します。上清液を廃棄し、RNA純度を改善するためにイソプロパノール沈殿を1回繰り返し、上清液を完全に吸引し、RNAペレットを室温のBSCで5〜10分間自然乾燥させます(過度乾燥は溶解度を下げるため避けてください)、RNAペレットをDEPC処理水30μLに再懸濁し、溶解を助けるために55°Cで10分間培養します。 分光光度計を用いてA260/A280比率(目標:1.8-2.0)を測定してRNA純度を定量化し、RNAナノチップでRNA完全性を評価します。ターゲット:RNA完全性番号[RIN]>8.0、適格なRNAサンプルはシーケンスまで-80°Cで保存します。

注意:トリゾールとクロロホルムは有毒で揮発性かつ発がん性があるため、ニトリル手袋、白衣、安全メガネを着用したまま、排気フード内でのみ取り扱い、蒸気の吸入を避け、皮膚にこぼしたらペーパータオルで拭き、石鹸と水で10分間洗い流してください。漂白剤や他の酸化剤と混ぜるのは有害ガスの可能性があるため注意してください。RNA抽出に関連する有害廃棄物処理においては、混合物、イソプロパノール上清液、汚染チューブを「RNA廃棄物」とラベル付けされた密閉された耐化学物質容器に収集してください(水性廃棄物や生物廃棄物と混ざり合わないでください)。そして、機関の有害廃棄物プロトコルに従って処分し、排水口に流出しないようにしてください。

データ前処理と品質管理: 製造元のプロトコルに従い、VAHTSのmRNA-seqライブラリープレップキットを用いてシーケンスライブラリーを準備します。オリゴ(dT)磁気ビーズでmRNAを濃縮し、二価陽イオンでmRNAを200〜300塩基の断片に分割し、ランダムヘキマーで第一鎖cDNAを合成し、その後第二鎖cDNAを合成し、末端修復を行い、Aテールを追加し、シーケンスアダプターをライゲートし、PCRでライブラリを増幅し、ビーズで精製します。シーケンスプラットフォーム上でライブラリをシーケンス(150 bpペアエンドリード)でシーケンスし、サンプルあたり約5,000万件の生リードを生成し、ソフトウェアで低品質リード(フレッド品質スコア<20の50%塩>基を除去)およびアダプターシーケンスをトリミングし、トリム後の後続解析のために約4,800万件のクリーンリード(Q30 > 90%)を保持します。

バイオインフォマティクス解析: Hisat2 v2.2.1ソフトウェアでクリーンリードをヒト参照ゲノム(GRCh38/hg38)にアラインメントし、アラインメント結果をBAMファイルとして保存します。htseq-count v0.13.5ソフトウェアで各遺伝子にマッピングされたリード数をカウント(Ensembl遺伝子注釈に基づく)。DESeq(2012)RパッケージのestimateSizeFacs関数を使って遺伝子カウントデータを正規化し、バッチ効果やシーケンス深度の違いを除去します。 また、nbinomTest関数(DESeqパッケージ)を用いて差分発現解析を行い、フォールド変化の閾値(FC)>2、調整p値(padj)0.05<用いて差分発現遺伝子(DEGs)を選択します。clusterProfiler v4.0 Rパッケージを用いて、細胞移動に関連する濃縮(例:細胞接着、細胞移動)、イオン輸送(例:ナトリウムイオン膜輸送)、シグナル経路(例:PI3K-Aktシグナル伝達経路)に焦点を当て、clusterProfiler v4.0 Rパッケージを用いて、DEGに対する遺伝子オントロジー(GO)濃縮解析(生物学的プロセス、分子機能、細胞成分)およびシグナル経路(例:PI3K-Aktシグナル伝達経路)を実施。pheatmap v1.0.12 Rパッケージを用いてDEGに対して教師なしの階層的クラスタリングを行い、ヒートマップ(行スケールzスコア)でサンプル間の遺伝子発現パターンを可視化します。

統計分析: すべての実験データは平均±標準誤差(平均±SEM)として提示され、各グループあたり少なくとも3つの独立した生物学的複製(n≥3)が存在します。学生のt検定を用いて2つのグループ(例:若年ドナーと高齢ドナー)間の差を比較し、一方移動分散分析(ANOVA)を行い、その後Tukeyの事後検定で3つ以上のグループ間の違い(例:異なるEF強度)を比較します。SPSS 23.0ソフトウェアを用いた統計解析を行い、統計的有意性を次のように定義します:*p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001。

Results

電場の適用はhADSCの方向移動を導き、その移動能力を高めます
抽出されたhADSCは典型的な間葉系幹細胞表面マーカー(例:CD29、CD44、CD90、CD73、CD105)を示し、三系統分化の可能性(脂肪形成性、骨形成性、軟骨性、図2A)は、hADSC識別の標準基準を満たしています。直流電場(DCEF)を0 mV/mm、100 mV/mm、200 mV/mmの強度で適用し、hADSCの電気攻撃応答を調査しました。電気刺激なしの対照群(0 mV/mm)では、hADSCはランダムな方向に移動しました。しかし、200 mV/mmの外因性DCEF刺激下では、細胞は陽極に方向性に移動しました(図2B)。さらに、電界強度が高まるほど陽極に向かって移動するhADSCの数も増加しました(図2C-D)。セル変位ベクトルと電場ベクトルの角度を定量化することで、電場強度の...

Discussion

組織損傷修復と再生の初期段階で、電場は微小環境に確立された最も初期の物理的手がかりの一つとして現れます。それらの方向性は、^{損傷部位への}細胞の動員と時空間的に相関しています。内因性電場は、上皮組織における偏極イオン輸送によって生じる経上皮電位に由来します。上皮障壁が破壊または劣化すると、電位は二次的に変化しますが、損傷していないまたは非老化領域はイオン輸送を維持し、上^皮表面に平行なDCEFを生成する電圧勾配が生じます。この状況では、損傷中心がカソードとして機能し、電場の重要な構成要素として機能します。ADSCは^{脂肪組織の}特定の幹細胞ニッチ内に存在します。増え続ける証拠は、ADSCが本来のニッチから動員され、皮膚修復や再生に参加できることを示唆しています^。本研究では、ADSCが外部DCEFに対して電気走行性を示すかどうかを調査し、皮膚再生中の内因性EFに対する応答性を評価する。私たちの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4°C/-20°C/-80°C冷蔵庫	ハイアル、中国	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
寒天	中国、フシ	10000561
Agilent 2100バイオアナライザー	アジレント・テクノロジーズ、アメリカ合衆国	G2939BA
アリザリン・レッド S	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	A5533
バイオセーフティキャビネット	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	1300 A2 1.5 m
CaNO3·4H2O	中国、フシ	10013960
遠心分離機	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	X4R Pro
CO2インキュベーター	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	フォーマステリサイクル3307
コラーゲナーゼタイプIV	バイオシャープ、中国	BS076
共焦点顕微鏡	ツァイス、ドイツ	LSM 900
直流パルス電源供給装置および	大道パワートロニクス(韓国)	DDP-500
デキサメタゾン	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	D4902
デジタルマルチメーター	フルーク、アメリカ合衆国	フルーク-175
DMSO	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	D2650
電子バランス	サルトリウス、ドイツ	BSA224S-CW
FBS	ギブコ、アメリカ合衆国	10270-106
フローサイトメーター	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	A24858
IBMX(1-メチル-3-イソブチルキサンチン)	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	I7018
インドメタシン	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	I7378
インスリン	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	I5500
倒立顕微鏡	ツァイス、ドイツ	アクシオ・オブザーバー7 / ACR
ITS-G	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	I3146
KCl	中国、フシ	10019318
KH2PO4	中国、フシ	10019320
リノール酸など;	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	L1376
ライブセルステーション	ライブセルインストゥルメント、韓国	チャムリド TC
低グルコースDMEM	ギブコ、アメリカ合衆国	11885084
MgSO4·7H 2O	中国、フシ	10019322
Na2HPO4middot;12H2O	中国、フシ	10019324
NaCl	中国、フシ	10019318
NanoDrop 2000分光光度計	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	ND-2000
オイルレッドO	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	O0625
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ、アメリカ合衆国	15140122
ピペット	エッペンドルフ(ドイツ)およびnbsp;	4920000061
SYBRプリミックス EX タック	中国のタカラ	RR420A
トルイジンブルー O	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	T3260
トリス	中国、フシ	10019326
トリゾル	ビヨタイム、中国	R0016
トリプシン-EDTA	ギブコ、アメリカ合衆国	25200056
直立顕微鏡	ツァイス、ドイツ	415200-0000-000
真空グリース	ダウ・コーニング、アメリカ合衆国	1597418
ビタミンC	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	A4544
浄水システム	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国	GenPure xCAD Plus UF-TOC
&β;-グリセロリン酸	シグマ・オルドリッチ、アメリカ合衆国	G9422