ショウジョウバエメラノガスターに対するキセノン麻酔による高気圧システムの検証

サマリー

大気圧では無害に見えるガスは、高気圧条件下でナルコシスのような行動を引き起こすことがあります。従来の高圧圧チャンバーは高価で労働集約的です。本研究は、4気圧以下の中圧力下でキセノンがショウジョウバエメラノガスターに与える影響を、簡単かつ低コストで検証する方法を提示します。

要約

高圧酸素条件下では、周囲のガス濃度が高いことで、さまざまな動物にさまざまな行動反応が引き起こされることがあります。これらの行動のかなりの部分は、まだ十分に理解されていない認知状態の変化を表しています。その代表的な例が全身麻酔です。全身麻酔(ナルコシス)における高気圧条件下でのいくつかのガスの行動影響は、医学における薬物の使用が非常に頻繁であるにもかかわらず、長年にわたり科学的課題となっています。キセノンは希ガスおよび麻酔剤として分類されており、人間の全身麻酔において最も安全な選択肢の一つと考えられています。しかし、標準気圧条件下ではハエを麻酔しません。ここでは、周囲圧力を最大~3気圧まで上げ、最も人気のあるモデル生物の一つである ショウジョウバエ・メラノガスター におけるキセノン麻酔の研究を可能にするシンプルな実験装置を確立しました。この実験装置は、他のガスやそれらが高圧条件下でどのように影響するかの研究をさらに容易にします。

概要

高気圧条件下の動物で観察された行動効果の極端な二端は、酸素によるけいれんと窒素による麻酔^です。興味深いことに、窒素や水素が無意識レベル以前の圧力値で、幻覚や記憶障害などの認知障害が報告されています。^3,4。キセノン、クリプトン、亜酸化窒素による麻酔は、過圧酸素条件下で報告^{されています。}

全身麻酔は医学の基盤であると同時に、非常に科学的に興味深い現象です。長く広く使われてきたにもかかわらず、いくつかの化学物質がどのように一時的に運動、記憶、痛み、意識の喪失を引き起こすのかについては、私たちの理解は限^{られています。}キセノンは希ガスであるため、麻酔剤の中で最も特質な存在として挙げられるかもしれません。麻酔として安全な選択肢とされており、迅速な誘導と回復、生理的混乱が最小限、術後の吐き気などの軽度の副作用のみが特徴^です。

麻酔の医学的重要性とキセノンの特異な化学的性質を踏まえ、本研究は単純な動物モデルであるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)を用いてキセノン誘発麻酔を調査することを目的としています。ショウジョウバエを用いて全身麻酔の研究が行われており、多くの提案されたセットアップや揮発性麻酔薬の使用が見られます 10,11,12,13。しかし、ショウジョウバエにおけるキセノン麻酔の報告はありません。正常気圧条件下では、キセノンはショウジョウバエ(一般にショウジョウバエ)に麻酔を誘発しません。この制限に対処するため、本研究は1気圧から約4気圧までの周囲圧力を制御できる高気圧システムを提案します。同様の疑問に答えるために高気圧室を用いた研究がいくつかあります(^14,15)。しかし、ほとんどの市販高圧チャンバーは頑丈で漏れにくい材料を用いていますが、容量が大きく(~3リットル)、運用が体系的に複雑かつ高価です。代わりに、この記事で説明する方法はシンプルで安価であり、さまざまな気体やその組み合わせの影響を探ることを可能にします。D. melanogasterやC. elegansのような小動物モデルに適したセットアップを提供します。

プロトコル

1. ショウジョウバエ・メラノガスター 製

1. CO2を用いて、各実験ごとに1〜3日齢のメス20匹とオス20匹のハエを採取します。
2. 選ばれたハエは実験前に少なくとも24時間、餌と一緒に小瓶に置き、温度は約22°Cで休ませます。

2. 麻酔投与

1. 実験用に、彼らの容器ガスシリンダーから漏れ防止ガスバッグへガスを移します。容器からバッグへのガスの直接輸送には、シリコーンチューブを使用します。
2. ポリプロピレン注射器に直径25mm(3.4mm)のシリコーンチューブを取り付けます。次にポリプロピレン注射器をガスバッグと三方向蛇口に接続します。分かりやすくするために、本文の残りの部分ではポリプロピレン注射器を注射器#1と呼びます。

3. 超気圧装置の組み立て(図1)

1. LEDライトテーブルをテーブルの横向き(テーブル面に対して長い水平のエッジ)に配置します。
2. インジェクションポンプをLEDライトテーブルの短い辺の一つに設置し、ポンプの向きが実験用シリンジがバックライトの上に伸びるようにします。
3. 実験用注射器が設置されている領域をカバーするために、セットアップの上にカメラを設置してください。
4. 長さ75mm(直径3.4mm)のシリコンチューブを切断します。中央ノズルのシリコーンチューブを使って三方向タップをマノメーターに接続します。
5. マノメーターの側面からホーススプリングクランプを使い、三方向タップでチューブがしっかり締まっているか確認してください。
6. 注入ポンプの制御ユニットにある二重矢印のボタンを使い、速度を80 mm/m、持続時間を38秒に設定し、プランジャーの自動圧縮または減圧を行います。

4. キセノン麻酔の手順

1. 実験室の環境光を制限し、LEDライトテーブルを点灯し、明るさをレベル3に設定します。これにより動画のコントラストが高まります。
2. ポリカーボネート注射器のプランジャーを外します。シリンジの乳首に少量の綿を入れてハエが逃げないようにします。分かりやすくするために、本文の残りの部分ではポリカーボネート注射器を注射器#2と呼びます。
3. バイアルからシリンジ#2に40匹のハエを移すには、まずバイアルの蓋を外し、シリンジの樽をバイアルの上に垂直に置きます。バレルフランジはバイアルの上部と一体化し、フライが注射器のバレルに入るようにします。構造体を180度回転させてタップします。これでフライは注射器のバレルの底に置かれます。プランジャーを戻してください。フライの入った注射器を注入ポンプの中に置きます。
4. シリンジのバレルマークを側面に配置し、カメラの視点からハエをよりよく見ることができます。
5. 調整ネジを使って注射器をバレルとプランジャーヘッドから注入ポンプに固定します。
6. 注射器#2の先端から綿を取り出し、3ウェイタップに接続します。
7. ビデオ録画を始めてください。マノメーターをオンにして。ストップコックを回してマノメーターとシリンジ#2を接続し、マノメーターでシリンジ内の圧力が0kPaであることを確認します。
8. 実験前に3ウェイタップを横方向に回し、注射器との空気交換を可能にします。
9. 注射ポンプの手動操作オプションで、プランジャーを20から2 mLの位置に移動させることができます。これは最も速いオプションを容易に設計されています。
10. ガスバッグから注射器#1へ麻酔ガス18mLを吸引します。シリンジ#1を横のルアーロックポートの三方向タップに接続します。適切な体積を評価するために、20mLの混合物中に18 mLの麻酔ガスを含ませば、ガスの割合の90%が得られます。これは最終的なガスパーセンテージに応じて変更可能です。
11. 手動で注入ポンプを操作すれば、プランジャーを20mLラインに戻します。
12. ストップコックを回してマノメーターとシリンジ#2を接続します。通常、マノメーターは麻酔薬充填後の~-3 kPa圧力を示します。
13. プランジャーは自動的に動かし、速度と時間設定は80mm/sと38秒に設定されています。ポンプは38秒でバレルの5 mLバーに到達すると予想されています。プランジャーが停止するとき、最大圧力は~200 kPaでなければなりません。
14. プランジャーは5mLの位置に20秒置いてください。ピーク圧力に注目してください。
15. 注射器を軽く叩いて、プランジャーにくっついたハエを落とし、底に動かずに落ち着かせます。
16. 20秒の終わりに自動減圧を開始します。プランジャーが20mLバーに戻ったら実験を終了します。漏れ制御の最終圧力に注目してください。

5. データ分析

注:この実験では、麻酔創出をエンドポイントとして用いています。フライの動きはプランジャー減圧開始時刻から定量化されました。ピクセル解析とフライトラッキングの2つの異なる解析手法が開発されました。各解析手法には欠点があり、それは議論の中で説明されています。

1. ピクセル解析
   1. ScreenFlowを使って動画を編集してください。各動画を関心領域(ROI)、すなわち注射器のバレルの最初の5mLにトリミングします。
   2. シリンジ減圧後の最初の20秒に映像をトリミングしてください。編集した動画をGIFとしてエクスポートします。GIFを複製してください。
   3. Fijiを使って、1つの重複から最初のフレームを削除し、もう1つの重複から最後のフレームを削除します。これを実現するには、「 画像>ビデオ編集>フレーム削除」を選択してください。
   4. フィジーの各GIFバイナリを黒い背景に白く見せるようにしてください。これを実現するには、 Process > Binary > Make binary を選択します。
   5. 両方のGIFをフィジーで開いてください。GIF間のピクセル差を計算してください。これを実現するには、 画像計算機>プロセスを選択します。この操作はピクセル差GIFを作成します。
   6. ピクセル差のGIFを保存してください。さまざまなGIFの粒子を分析してください。これを行うには、「Analyze( 分析)」>「Analyze particles in Fiji(フィジーの粒子解析)」を選択してください。ピクセルサイズのしきい値を調整して、信号対雑音比を上げます。
   7. パーティクルを解析した後、Fijiはフレームあたりのピクセル差を持つCSVを出力します。CSVを保存してください。CSVデータを使ってフレームごとの動きをプロットできます。フレーム間の累積移動を使って実験間に統計的な差を割り当てます。
2. ハエ追跡
   注:ハエ追跡法では、実験動画内の各ハエの重心を検出・追跡するためにAI技術が用いられました。このために2つのモデルが統合されました:YOLO(You Only Look Once)は検出用、MASA(Matching Anything by Segmenting Anything)はトラッキング用です。モデルはTesla T4 GPUを用いてGoogle Colab上で実行されました。
   1. ColabにUltralyticsのYOLOライブラリをインストールし、yolo11n.pt モデルを読み込みます。CVAT(Computer Vision Annotation Tool)を使って、動画から抽出したフレーム内のハエに注釈を付け、そのデータセットをYOLO形式でエクスポートしてトレーニングします。詳細な設置およびトレーニング手順はオンラインリポジトリで説明されています。
   2. Google ColabにMASAリポジトリをインストールし、Kalmanフィルターを組み込んで連続したフレーム間でオブジェクトトラッキングを行います。訓練済みのYOLO検出モデルをMASAトラッキングフレームワークと統合します。
   3. FixTrackを使って、MASA+YOLOのパイプラインで生成されたトラックレットを手動で確認してください。誤った断片化されたトラックレットや同一性の不一致を特定し、個々の飛行の連続軌道を取得します。詳細なインストールおよびトレーニング手順はFixTrackリポジトリに記載されています。

結果

本論文で述べた方法は、高圧酸素条件下での飛行の運動活動のタイミングと範囲の両方を監視することを可能にします。この構成により、通常の条件下では麻酔特性を持たないキセノンや亜酸化窒素のような気体がショ ウジョウバエメラノガスターで麻酔を生じることが可能になります。これを示すために、異なる濃度のキセノンと空気で実験を行いました。私たちは90%キセノン、10%空気でプロセスを確立し始めました。次に、麻酔ガスの量を5%増減した際の差を比較することで、この方法の感度を示しました。 図1 は90%キセノン麻酔プロトコルを示しています。

図1:実験セットアップと高気圧麻酔曝露におけるステップ。

ディスカッション

このシンプルで低コストなセットアップにより、ショウジョウバエにおける高気圧挙動アッセイが広く利用可能となり、特殊な圧力容器を使わずに迅速かつ再現性の高い実験が可能になります。しかし、いくつかの制約もあります。その重要な妥協点の一つは、既存の設備に比べて最大圧力が低いことです。この仕組みで誘導できる最大圧力は~4気圧ですが、ショウジョウバエ用の圧力容器はその約2倍に達すると報告されており、マウス用のシステムは最大100気圧まで達^します。これらの高圧容器の欠点は、しばしば高価で労働集約的、そして大量のガスを必要とすることです。

方法開発の過程で、私たちにとって大きな課題は二つありました。最初の方法では、注射器内で数分間高圧を維持すること。特に設定点が高いところで圧力が低下し、原因として2つを特定しました。1つは、緩んだプランジャーガスケットのシールによるシリンジからの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
気密ガスバッグ(0.5L)	テクインストロ	7440440
カメラ	アップル	iPhone 15
ダブルワイヤースプリングホースクランプ	ソースマップ	a24120200ux2109
ショウジョウバエの餌ミックス	アドバンスド・ハズマリー	DM900
ショウジョウバエ メラノガスター	ダーウィン・バイオロジカル	LZ-210
インジェクションパイプ	アイトセルレア	B09M8G5BQ8
LEDライトテーブル	ライリ	M1-3878368
マノメーター	ドワイヤーオメガ	477AV-8
金属製の三方向圧縮ナットストップコック	シグマ・オルドリッチ	Z182184
ポリカーボネート注射器(20 mL)	DMCメディカル	FD-1031NS
ポリプロピレン注射器(20 mL)	BD	301031
シリコーンチューブ
キセノンガス	成都太裕工業ガス