無性両生アブラナ科植物Rorippa aquaticaの効率的な再生ベースのアグロバクテリア媒介形質転換

サマリー

我々は、資源を多く消費する無菌組織培養手技を用いず、無性生両生のアブラナ科植物Rorippa aquaticaのアグロバクテリア媒介型形質転換のための効率的かつ最適化されたプロトコルを提案します。視覚的形質転換マーカーと新梢再生パイプラインを活用し、近いクローナル型転換体を成功裏に生成し、植物の水中環境適応の今後の研究を前進させました。

要約

アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる植物の安定した遺伝的転換は、基礎的な植物生物学研究や作物改良に直接影響を与える植物バイオテクノロジーにとって強力なツールとなっています。シロイナズナの花浸し法のようなシンプルで効果的な形質転換パイプラインは、遺伝子機能の大規模解析を劇的に進めました。しかし、このようなパイプラインは有性生殖をしない植物種には適用できません。ロリッパ・アクアティカは、陸上または水中環境において葉や植物の形態が異葉性で劇的に変化する、両生類のアブラナ科モデル種です。R. aquaticaは無性繁殖のみを行います。ここで提示された最適化されたパイプラインは、無菌組織培養を必要としない効率的かつ信頼性の高いアグロバクテリウム媒介R. aquatica形質転換を提供します。葉切りは、構成プロモーターの下に視覚マーカーRUBYを発現する二元ベクターを含む形質転換バッファーに懸浮したアグロバクテリウムに短時間浸されます。その後、接種剤は水に浸したフィルターペーパーの上で成長チャンバーで培養されます。その後、RUBY赤色の色素を持つ再生苗を分離し、土に植え付けます。初期のT1再生剤(R1-T1)は赤いセクターを発現します。赤色セクターを切り取り再生工程を繰り返すことで、次のR2-T1世代で多数の遺伝子移行兄弟が生成され、その中にはほぼ均一に赤色を呈するものもあります。これはRUBYの発現を示しています。この単純な形換えパイプラインは、R. aquaticaや他の無性繁殖植物種に採用され、陸生と陸生への適応における機能を調べるための関心遺伝子を導入することが可能です。水生環境。

概要

安定した遺伝的形質転換、すなわち特定の植物種に関心のある遺伝子を導入し発現することは、基礎植物科学と植物バイオテクノロジーの中心的課題です。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス媒介型転換は、安定した転換株の確実な生成において、植物遺伝子工学の中で圧倒的に広く使われている手法です^。T-DNAクローニングベクターと解除されたvirヘルパープラスミドを2つの実体に分離するバイナリベクターシステムの開発は、アグロバクテリウム媒介型転換^1,2に革命をもたらしました。モデル植物であるシロイヌナナ(Arabidopsis thaliana)では、シンプルでコスト効率の良いフローラルディッピング形換形処理により、機能遺伝学およびゲ^ノミクスのためのクローナル(ヘミ接合体)トランスポリティクトの高スループット生成が可能となりました^3,4。しかし、主に無性繁殖または専念する植物種にはこの方法は現実的ではありません。

両生植物は陸上環境と水生(水中)環境の両方で繁栄する独特の能力^{を示します5.}ロリッパ・アクアティカは両生のアブラナ科の種で、異葉性を示します。陸上環境では、R. aquaticaは丸い葉を持ち、表皮は舗装細胞と気孔で構成されています。対照的に、水生葉は水中環境に非常に適応した形態を示します。すなわち、表皮にキューティクル状の舗装細胞や気孔を欠いた高度に解剖された針状葉^6,7。系統発生的には、R. aquaticaはシロイナズナ(Arabidopsis thaliana)と密接に関連しています。両者は同じ科、アブラスコ科⁶に属しています。全ゲノム配列データやR. aquaticaとA. thaliana間のコード遺伝子の高い保存性により、R. aquaticaは陸地^と水域への適応の分子基盤を研究するための新興の両生用モデル植物として機能しています。実際、最近の生理学的および遺伝子発現の研究は、光とホルモンシグナル伝達経路の再配線がR. aquatica ^7,8のヘテロフィルに不可欠であることを示唆しています。

候補遺伝子や経路の分子機能を検証するためには、遺伝子転換が絶対に不可欠です。R. aquaticaは自然界で栄養繁殖します^8,9。したがって、A. thalianaとは異なり、アグロバクテリウムのフローラルディップ変換はR. aquaticaには適用できません。驚くべきことに、R. aquaticaは外因性植物ホルモンの補助なしに、葉を取った葉から全小株を簡単に再生できます¹⁰。葉片が剥離してから数日以内に、切断面の近位端の維管管束組織で細胞増殖が活発になります。1週間以内に根と芽は再生し、最終的に若い小苗(ロゼット小苗)を実らせます。個々の植物は分離して成熟まで育てることができます¹⁰.この自然発生的な全苗再生プロセスは、R. aquaticaの遺伝的転換に容易に利用可能です。

ここで報告した最適化されたパイプラインは、葉の剥離後の自然再生能力を利用することで、R. aquaticaの効率的かつ信頼性の高いアグロバクテリウム媒介型転換を可能にします。高価な無菌培養プロセスを必要とせずにトランスポントを簡単に選択できるように、非侵襲的な視覚選択マーカーであるRUBYが採用されました。これは3つの遺伝子からなる合成ベクターで、ベタラン¹¹の生合成に至ります。細菌培養条件、接種手順、葉挿し木の培養プロセスを最適化することで、信頼性の高い遺伝子組み換えR. aquatica植物を成熟させることができました。R1-T1世代の初期トランスポルタントのほとんどは赤いセクターを示しており、異質な遺伝的モザイクであることを示しています。RUBY+の赤い葉セクターを切り取り再生プロセスを繰り返すことで、完全な赤いロゼット植物、つまりほぼクローンのR2-T1世代でR. aquaticaの変質株が生成可能となります。この形質転換パイプラインは、R. aquaticaに関心のある異物遺伝子を導入・発現させることで容易に適用でき、ヘテロフィリーや植物の極端環境への適応の分子遺伝学的研究を加速させます。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 植物材料の調製

1. 2か月齢の成熟母株から、完全に裂けた成熟した健康な葉を1〜2cmの片状に切り取る(図1A)。
2. 植物の繁殖トレイ(20×30cmのパーマネストトレイ)に、オートクレーブした折りたたみ紙タオルを2層敷きます。ペーパータオルに 滅菌水を浸し、薄い水の層を上にします。
3. 挿し木はアダシアル(方向側)を上向きに配置し、各エクスプラントの周囲に隙間を置いて重なり合わないようにします(図1A)。
4. 挿し木には軽く霧吹きし、トレイをラップでしっかり覆います。
5. トレイを25°C〜28°Cの成長室に置き、湿度の高い条件下で16時間の光と8時間の暗い時間、50μmol/^m²/sの光強で行います。
6. 週に2〜3回、清潔で湿った繁殖トレイを点検し維持してください。
   1. 滅菌水を加えて、飽和したペーパータオルの上に薄い水の層を保ちます。
   2. 接着力が失われているか、汚染の兆候(例:水の濁度が目に見える)があるラップは交換してください。
7. マイクロハサミまたはメスを使い、植え付け後14〜21日の間に新芽と根を持つ再生した健康なロゼット苗を慎重に切除します(図1B)。
   注意:枝と根が無傷の単一のロゼット苗を得るには慎重な切除が必要です。 ロリッパ ロゼットの小苗は葉の外側と中肋の交差部に密に増殖し、個々のロゼット小苗の識別を複雑にしています。ロゼット小株の枝は逆方向に成長しますが、根は葉の表面下から成長するため、ロゼット小株全体の視認性を複雑にしています(図1B)。
8. 個々のロゼット苗を、湿った土壌培地(培養土:バーミルキュライト:パーライトの比率)に徐効性肥料を補った鉢に移植します(図1B)。
9. 水道水に0.25g/Lの顆粒状NPK肥料を添加し、湿度ドームまたはラップで覆って湿度を維持します。
10. トレイを培養室に置き、事前条件(25°C〜28°C、16時間の光と8時間の暗い期間、湿度の高い条件下で50μmol/^m2/sの光強度)を行ってください。
    注意:湿った土壌の状態を維持することが非常に重要です。鉢植えの下に薄い水の層を保ちましょう。

2. 転換のための アグロバクテリウム 培養

1. ストリークA. tumefaciens株GV3101は、TiプラスミドpMP90(pTiC58DT-DNA)を保有しており、これはリファンピシン(0.03 mg/mL)、ゲンタマイシン(0.025 mg/mL)、スペクティノマイシン(0.05 mg/mL)を含む30 mLのLBプレート上で、28°Cで48〜72時間増殖し、単一コロニーが現れるまで成長します。
2. 単一のコロニーを選び、ビオチンと事前選択的抗生物質を添加したMG/Lブロス5mLを接種し(表1)、28°Cの回転シェーカーで200rpmで16時間培養します。
3. 接種物を250 MG/Lのブロス入り円錐形フラスコに移し、28°Cの回転シェーカーで200 rpmで16時間培養します。
4. 分光光度計を用いて液体培養のOD₆₀₀ が最低1.2であることを確認しましょう。細菌を3396 x g の遠心分離で室温(約22°C)で10分間ペレット化します。接種ブロスに200μMのアセトシリンゴン(AS)を添加します。
   注:フィルター無菌ASのアリコットはDMSOで100 mMの作業濃度で調製し、-20°Cで保存されます。 接種スープは新鮮に作るべきです。劣化を最小限に抑えるため、遠心分離の直前にASが添加されます。メディアの説明と構成要素は 表1に記載されています。
5. 細菌ペレットを直接攪乱させないように、上清液を廃棄し、ペレットを接種液に再懸濁させます。
6. フラスコを手で回して溶液のOD₆₀₀ を約0.8にします。
7. 接種源をシェーカーで90回転/分で2.5時間、常温(約22°C)で培養します。
8. 関連する条件(培養および接種剤OD₆₀₀、AS濃度および界面活性剤の量、接種期間、変換効率に必要な実験単位数)を記録します。
   注:最適な細菌濃度と懸濁培養濃度は、形質転換効率を最大化しつつ過剰な細菌増殖を最小限に抑えるために不可欠です。遠心分離前に、細菌培養のOD600が最低1.2であることを確認し、接種量OD600000000000000000000000を0.8に再懸濁します。誘導ブロスの改良は、再生性を損なうことなく形質化を促進するよう最適化されています。推奨濃度はASで150〜225μM、界面活性剤が0.005%です。
   注意:すべての遺伝子組み換え細菌や植物は指定された生物有害廃棄物容器に処分してください。

3. R. アクアティカ の葉挿し木の変質

1. 接種物再懸濁培養が孵化されている間、葉が健康で縁が完全に残る2ヶ月の株をいくつか選びます。
2. 植物の繁殖トレイ(20×30cmのパーマネストトレイ)を用意し、2層のオートクレーブしたペーパータオルを用意します。ペーパータオルを折りたたみます。ペーパータオルに滅菌水を浸し、薄い水の層を上にします。
   注意:未接種のエクスプラントが同じ環境条件を受けるネガティブコントロールトレイを設置してください。
3. 実験台には100〜500 mLのddH_2O、再懸留接種量に適した滅菌容器、マイクロピペット、チップが設置されていることを確認してください。
4. 孵化期終了前に、選んだ家畜植物の葉柄基部から10枚の葉を素早く切り取ります。エクスプラントをペトリ皿に無菌水を入れて置いてください。
   注意:葉の乾燥を防ぐために、葉の接種には新鮮に切除した組織を使用することが非常に重要です。
5. 2.5時間後、界面活性剤50μLを1リットの懸濁液(界面活性剤濃度0.005%)にピペットで注ぎ、フラスコを優しく渦巻きして混合します(図2A)。接種後にエクスプラントを置くための増殖トレイのアクセスを確保してください(図2B)。
6. 葉の背面を上に置き、メスで中肋に沿って1cmの長さの小片に切る(図2C)。
7. 新鮮に切り取った葉をすぐに50mLのチューブに入れ、回転チューブミキサーに適した接種用エクスプラントとして使います。
8. 接種剤を排出チューブに一定量で注ぎ、すべての材料を飽和させた後、室温で回転ミキサーで10分間攪拌して接種を行います(図2D,E)。
9. 接種済みの葉はすべて鉗子で溶液から取り出し、準備済みの繁殖トレイに直接置きます。
10. 浸したエクスプラントを分けて広げ、飽和したペーパータオルの薄い水の層に部分的に浸けないようにしてください(図2F)。
    注意:無菌状態を維持し、ア グロバクテリウム 処置中に使用された表面や道具との接触を避けて消毒してください。
11. 各トレイをラップで密封し、暗い環境(22°C)で3日間培養します。
12. 暗水期間終了後は、トレイを透明なラップで密封し、湿度を維持するためにddH_2Oでトレイを改良してください。
13. 接種トレイを植生繁殖条件下の成長室に移します。
    注意:接種廃棄物は廃棄物容器にまとめ、10%漂白剤溶液で処理し、バイオセーフティガイドラインに従って処分してください。

4. ロゼット小株の再生とR1-T1世代の確立

1. 接種トレイを週に2〜3回点検し、清潔で湿った環境を確保しましょう。
   1. 搾りボトルでddH_2Oを加えます。可能であれば、トレイを再封する前にスプレーボトルでミストで抜き取ります。
   2. 接着力が失われたり、汚染の兆候(例:水の濁度)が見られるラップは交換して高湿度を維持しましょう。
2. 再生したロゼットの苗を目視で検査し、移植適性の特徴を判断してください。理想的な再生体は、複数の葉と根が少なくとも2〜3 mmの長さを持つ無傷の新芽を示します(図2G)。
   注:遺伝子組み換えロゼットの苗は通常、成長室に入れてから21〜28日で移植に適した状態に達します。
3. WTクローン再生株と同じ条件下で、完全なトランスジェニックロゼットの苗を切除・移植します。
4. (任意)再生トランスフォーマントの数を記録し、その変換条件と相関させて効率を評価します。
   注意:選考時には特に注意してください。遺伝子組み換え再生体はしばしば小さく、見落とされがちです。鉗子を使ってアダキアルとアバクシャルの両方の葉面を慎重に検査し、収量を最大化しダメージを最小限に抑えましょう。
5. ロゼットの苗を切除しつつ、遺伝子軸移りの葉には触れないようにしてください。遺伝子組み換えの葉のすぐ周囲の余分な葉は切り落とします。1鉢に1株ずつ植え替えましょう。
6. 素早く肥料を与え、水やりをして霧吹きし、プラスチックドームの下に置いて湿度を保ちます(図2G,H)。
7. 各遺伝子組み換え苗にラベルを付けて記録してください。
8. 芽や根が欠けている、または繁殖トレイに移植するには小さすぎるように見える移植株を含む移植株は返品します。成長が十分になったら追加のトランスポントを移植します。
9. 最初の1週間は毎日霧と水を植え替えています。トレイには常に水が入っていることを確認してください。
10. 老化した、またはRUBY色素発現がなくなった移植品は除去・廃棄してください。
    注意:すべての遺伝子組み換え物質は、機関のバイオセーフティ規則に従って廃棄してください。

5. その後の再生と近クローナルR2-T1世代の確立

1. ロゼットの小苗が大きく健康な植物に成長したら(2か月)、1本の苗から拡大した RUBY表現葉を切除します(図2H)。
   注: ルビーを表現する葉は均一に赤く見えることがありますが、実際にはキメラ状であることが一般的です。両方の表現型は伝播に適しています。次のステップでは標準的な栄養繁殖法を用いてください。
2. 変わった葉片を分けて、繁殖トレイに入れます。各繁殖トレイには対応する苗提供者IDを明確にラベル付けしてください。
   注意:複数の苗の葉を同じトレイに混ぜないでください。各苗は独自のトランスジェニックイベントを表し、別々の世代として追跡しなければなりません。
3. 移植はR2-T1株を再生しました(繁殖後14〜28日)。各プラントにその2つ目のステータスを反映した新しい識別子を割り当てます。前述の標準移植後ケアを継続します(図2I,J)。

結果

A. tumefaciensの形質転換パラメータは最適化され、RUBY発現型トランスジェニックのR. aquatica植物を成功裏に生成し、不稔による制限を回避しつつ、急速な無性生殖速度を活かしました(図1および図2)。葉片のエクスプラントに接種し、その後72時間のダーク処理を受けた後、再生苗は記載された条件下で2週間以内に成長を始めました。移植可能な十分な大きさを持つ再生小株は接種後3〜5週間で発見され(図3)、発現しないロゼット小株よりやや小さかった。対照の野生型トレイではRUBY再生小株は見つからず、この現象がR. aquaticaの生理とは異なることが確認されました。細菌培養ブロスの種類、再懸濁接種ブロスタイプ、浸透方法、接種期間は、変換体生成能力や速度に有意な差はありませんでした(表2および表3)。転換効率にプラスに影響を与えた処理因子には、葉外移植接種前のAS濃度の増加とオーキシン曝露処理が含まれていました。界面活性剤濃度の増加は収率に悪影響を及ぼし、不適切と判断されました。

Rバージョン4.4.2 12,13,14,15はロゼットの苗数データのポアソン一般線形混合モデル(Poisson GLMM)解析に使用されました。しかし、実験D(表2D)では、RUBY発現再生物質を15分間接種し、150μM ASまたは225μM ASで修正した結果、分散不足による仮定に反し、代わりに負の二項GLMMが適用されました。

異なる細菌ブロスおよび培養条件が形質変換効率に与える影響を慎重に検討しました。5つの実験複製のうち、ミラーのLBブロスまたは形質転換特異的MG/Lブロスを用いた結果、ほぼ同一パラメータで RUBY を発現するトランスポルマントが得られ、その効果に有意な差はありませんでした(表2A)。1回の処理で15〜60個のエクスプラントからなる個々の葉片から再生されたロゼット苗を発現した RUBY の方法は、LBおよび非MSベースの培養液を用いた実験(対照誘導ブロス、 表1)から生成された再生剤が1.6±1から0.71で、MG/Lおよび最適化誘導ブロスを用いた実験では3.23 ± 1.13 レジェネラントが生成されました。有意な差はないものの、主観的な観察により、MG/L培養と最適化誘導ブロス(表1)が今後の最適化実験のために選ばれました。

次に、細菌負荷や分裂組織組織へのアクセス能力に影響を与える要因を検証しました。8回の複製(表2B)では、界面活性剤濃度が0.01%増加した接種済みエクスプラントは1か月後に極度のストレスを示し、小規模でほとんど生存不可能な再生株が現れました。これらの複製体には再生トランスポンタントは見られませんでしたが、エクスプラントのストレスを受けた再生体表現型はマルーン色、茶色、黄色色素であったため、潜在的なトランスポンタントが存在した可能性があります。いずれにせよ、再生剤の生存可能性の低さは界面活性剤濃度0.005%を維持することを裏付けました。

目的のDNAを宿主植物に導入するための効果、攪拌法と真空浸透法という2つの機構的手法が比較されました。対照浸透法では、エクスプラントを50mLの再懸濁接種物に浸し、チューブミキサー内で回転させる方法が、記載された処理全体でRUBY発現再生剤の生成に成功しました。真空浸透を施したことでRUBY発現再生剤も生成されましたが、対照法と比較して変換効率に差はありませんでした(p = 0.478、表2D)。真空浸透または物理的攪拌による接種を経て、1つの伝播トレイあたり約2〜5個のRUBY発現再生剤が観察されました。

改良後の細菌接種物のアセトシリンゴン(AS)濃度は、形質転換効率に対する効果が明確に異なっていました。AS濃度を150μMから225μMに増加させることで、 RUBY 発現トランスジェニックエクスプラントの産生が大幅に向上しました(p = 0.000309, 0.000458; 表3C、D)。4つの実験のうち、各処理は40個の同一処理されたエクスプラントをトレイに並べるものでした。高濃度で接種された者は、対照ASトレイあたり1個に対し、平均して約5個の RUBY 発現再生剤を摂取していました(表3C)。さらに、AS効果は接種期間とは別のものであるように見えました。

15分接種期間の3つの実験で、225μM ASを修正したエクスプラントを用いたものでは、平均7.28 ±4.13 RUBY発現再生物質が認められ、これは150 μM処理の2.03±1.32再生率を明らかに上回っています(表3D)。150μM抗圧対照処理(p = 0.676)間で、平均10分接種率は1.48±0.954で、15分接種で再生剤は1.84±1.230であった(表3B)。同様に、10分、225μM処理された接種剤は、1回の処理で約5個の RUBY 発現ロゼット小株を再生し、これは15分接種で6〜7種類の再生剤を処理トレイに示したのと明確な違いはありませんでした(表3A)。

さらに、植物の再生を助けるホルモンであるオーキシンも試験されました。新たに切除した葉片を接種前にパルスオーキシン処理に曝露すると、ddH₂Oと比較してRUBY再生が明確に増加しました(p = 0.00969、表2C)。285μMのインドール3-酢酸(IAA)を修飾したddH_2.0に置いたところ、エクスプラントは1処理あたり平均6.67±1.490のトランスポルタント率を示し、オーキシンフリー処理は平均2.00±0.816再生率でした。

直後に再生されたトランスジェニック系統はR1-T1世代(図2)と呼ばれ、個々の再生体が系統として割り当てられました。すべての初期R1-T1ロゼット小苗は、キメラ状の葉の形で RUBY 発現を示し、多様なキメラ模様を示しました。最も一般的には、1〜3枚の小苗葉が明確なキメラを発現し、 RUBY発現組織と未発現組織が中脈で分岐します。生後1か月のR1-T1実生の大半はキメラ発現を維持していました(図3A)が、完全に RUBY発現した実生はごく少数見つかりました。

R1-T1の苗葉片から無性繁殖したルビー色素付きキメラセクター(図3B)は、摘出後2〜4週間以内に完全なRUBYまたはキメラR1-T1ロゼットの小苗を再生しました(図3C)。1か月後、ほとんどのR2-T1実生は主にRUBYの葉を示し、一部は未発現のキメラ領域がわずかに残っていました(図3D,E)。

図1:栄養繁殖プロトコルとタイムライン。 代表的な画像は、無性ロゼットの苗を再生するために用いられた生産パイプラインを示しています。(A) 確立した母株から成熟し健康な葉を丸ごと切り出し、2〜3つに切り分けること。(B) エクスプラントを増殖トレイに配置し、指定された条件下で維持すること。3週間後、ロゼットの小苗はエクスプラントから切り取られ、土壌培地に移植されました。下は再生したロゼットが母葉の切り取りにまだついている(ピンクの矢印)の実際の写真です。これらの小苗は移植に最適な段階にあります。スケールバー:10 mm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図2: R. aquatica の葉切りの形質変換と RUBY 転写産物を発現するトランスポジェントの再生。 形質転換過程と形質変換再生剤の生成の図解的概要。(A) 細菌接種の取得。(B)滅菌フィルターペーパーと水で増殖トレイを準備すること。(C)葉を切り出した部分にする。(D) エクスプラントを接種剤に浸すこと。(E) ロータリーミキサーで20r/1分10分間攪拌する。(F) 飽和したエクスプラントをトレイ内に広げ、プラスチックドームで覆い、暗い環境で72時間培養する。(G,H) 1か月後、 アグロバクテリウム曝露されたエクスプラントから完全な形質転換再生体を切除し、成熟植物を植え付けるために移植する。(I,J)伝播ステップ(G,H)を繰り返し、ほぼクローナルなR2-T1生成を生成します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3: RUBY トランスジェニック系統の無性繁殖世代。 (A) RUBY 発現を示すキメラ葉を持つ成熟したR1-T1の苗。スケールバー:1 cm。(B) (A)に示された3か月齢の苗から新たに繁殖トレイに植え付けられた20本のエクスプラントのうち2本。エクスプラントは中央脈で分離したRUBYのキメラ模様を示します。スケールバー:1 cm。(C) 移植前、切除後1か月後にキメラ性 RUBY 発現の異なる再生R2-T1ロゼット小株。再生されたRUBY正根(マロンアロー)。スケールバー:移植1か月後に見られたR2-T1苗木、2 cm(D)で、 RUBY 発現を示す。スケールバー:2 cm(E) 移植後3か月の成熟R2-T1苗で小さな扇形(緑の矢印)。スケールバー:2cm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:最適化されたパイプラインのフローチャート。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:メディアの定式化 この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表2:R. aquaticaの変換効率に対する4つの最適化パラメータの影響。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3:接種物アセトシリンゴン濃度がR. aquaticaの形質転換効率に与える影響。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、アブラナ科の両生植物で無性繁殖のみを行うR. aquaticaの、直接再生ベースのアグロバクテリウム媒介安定形態を確立しました^10,16。無生繁殖の両生類植物の徹底的な転換パイプラインは確立されておらず、R. aquaticaの実用的な形質化能力を視覚的マーカーで活用したこともありません。特筆すべきは、このパイプラインには手間のかかる無菌植物組織培養プロセスや専門的な植物成長インキュベーターを必要としない点です。そのため、このプロトコルは科学研究室から教室まで、多様な実験環境に広く採用可能です。

試験されたさまざまな接種および培養条件の中で、いくつかの要因が形質変換効率の大幅な改善をもたらしました。特に、やや高いアセトシリンゴン(AS)濃度およびインドール3-酢酸(IAA)濃度が転換効率に良い影響を与えました(表1 および表2)。ASは アグロバクテリウムを引き寄せるフェノール化合物であり、シロイナズナ¹⁷では植物の形質転換効率を向上させることが示されています。植物ホルモンのオーキシンは植物細胞の再プログラミングにおいて中心的な役割を果たします。創傷誘導再生の際にオーキシン関連遺伝子発現の急増が観察されました¹⁰。このため、植外接種時に外因性的に添加されたオーキシン(IAA)は再生効率を高めると考えられます。しかし、3件の試験で観察された再生苗の個体数の差は観察されませんでした(対照群57、7.55、59.67、5.51)。したがって、オーキシン処理は再生自体よりも変化過程を助ける可能性が高いです。

非イオン性界面活性剤であるアルコキシル化トリシラン(Silwet L-77として知られる)は、フローラルディップ法3を通じてシロイナナズナの形質転換効率を大幅に向上させ、そのため植物生物学の分野で広く利用されています。Silwet L-77を改良したエクスプラントでは、フローラルディップに推奨される濃度0.005%で植物ストレスは最小限に観察されました。この投与量を2倍(0.01%)にした際、R. aquaticaの葉挿し木は深刻な損傷を受け、ほとんどトランスポルマントの回収は見られませんでした(表2B)。シロイナズナの花浸しでは、界面活性剤の使用により接種剤の表面張力が低下し、花芽へのアクセスが促進されます。対照的に、両生植物であるR. aquaticaは、トリコームや厚い表皮を持たない滑らかな葉を発達させます⁵。界面活性剤の増加は葉組織に損傷をもたらし、非萌芽の葉組織における形態変化効率のために界面活性剤以外の要因を優先すべきであることを示しています。界面活性剤は、組織の浸透を促進する陰毛の表現型により関連性が高いです。すべてのテストパラメータを積分した後、最も最適な条件を持つパイプラインがフローチャートとして提供されます(図4)。

視覚的マーカーであるRUBYの活用は、この変革パイプラインにおいて重要な役割を果たします。RUBYは、鮮やかな赤色色素であるベタラン¹¹を合成する3つのコード遺伝子(CYP76AD1、DODA、グルコシルトランスフェラーゼ)をコードする合成レポーターです。R1-T1再生体でRUBY発現が観察された際、赤いセクターとして発現し、キメラである可能性が高いことを示しています(図2および図3)。以前の研究では、R. aquaticaの再生は切断葉セクション¹⁰の維管束カンビウムに起源を持つことが明らかになりました。注目すべきは、R1-T1再生体が中脈に沿ってキメラ境界を示すことがあり、葉の葉片の半分は赤色、もう半分は緑色です(図3A,B)。RUBYセクターからの再生により、時折赤い根を持つ完全な赤色の小苗が現れました(図3C、マルーンの矢印)、それらは均一な赤色のR2-T1植物に育てられました(図3D)。RUBYの過剰発現がR. aquaticaの成長および発生に悪影響を及ぼすことは認められませんでした(図3)。支持として、RUBYセクターを持つR1-T1ロゼットの葉の大きさや形状に明確な違いは観察されませんでした(例:図3B)。強力で構成的なプロモーター駆動型トランスジーンは、正常な植物の成長や生理的応答を妨げる可能性があります。

場合によっては、これらの「ほぼクローン」の RUBY 植物が緑色のセクター(図3E、緑色の矢印)を発達させ、逆転や遺伝子転換の沈黙を示唆しました。これは、 RUBY のような目に見えるマーカーを持つことが、将来の分子・機構研究において関心遺伝子の異所性発現やサイレンシング(例:RNAi)に不可欠であることを示しています。興味のあるトランス遺伝子を RUBY カセットに導入すると、赤色の RUBY セクターで表現型を観察できます。結論として、葉の切断による直接的な再プログラミングと非侵襲的な可視マーカーを活用し、栄養繁殖性のアブラナ科である R. aquaticaに対して最適化されたシンプルで効率的な変換パイプラインが実現しました。このプロトコルの範囲外ですが、変換された R. aquatica の再生の正確な起源を将来的に理解することで、植物の細胞再プログラミングに関する洞察が得られる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1000 & micro;L 低保持率LTSフィルター付きピペットチップ	レイニン	30389213
アセトシリンゴン	シグマ・オルドリッチ	D134406-1G
バクト酵母エキス、技術	フィッシャー・サイエンティフィック	DF0886-17-0
BDバクト・アガー	フィッシャー・サイエンティフィック	214030
BD ディフコ LB ブロス、ミラー	ミッドランド・サイエンティフィック	DIFCO 244610
BD Bacto 脱水トリプトン	フィッシャー・サイエンティフィック	DF0123-17-3
ビオチン冷凍乾燥粉末	シグマ・オルドリッチ	B4501-100MG
パーマネストトレイ用のクリアドーム	グロワーズ・ソリューション	GD221
クリアラップ	トーマス・サイエンティフィック	22-305654
粗いバーミキュライト	ベクチン
二カリウムリン酸塩無水	シグマ・オルドリッチ	105109
使い捨てペトリ皿 100 x 15 mm	VWRインターナショナル	25384-342
D-マンニトール	シグマ・オルドリッチ	M9546-250G
エタノール、200プルーフ	フィッシャー・サイエンティフィック	04-355-720
ファルコン50 mL円錐遠心分離機管	フィッシャー・サイエンティフィック	14-432-22
折りたたみ式ペーパータオル 9.3インチ×10.5インチ	キンバリー・クラーク	2920
GENESYS 30可視光分光光度計	サーモ・サイエンティフィック	840-277000
ゲンタミシン溶液	シグマ・オルドリッチ	G1272-100ML
L-グルタミン酸 一ナトリウム塩 ハイドレート	シグマ・オルドリッチ	G1626-100G
塩化マグネシウム	シグマ・オルドリッチ	M8266-100G
硫酸マグネシウム、ヘプタハイドレート	シグマ・オルドリッチ	M9546-250G
MaxQ 6000 インキュベーターシェーカー	サーモ・サイエンティフィック	SHKE6000
MESハイドレート	シグマ・オルドリッチ	M8250-100G
ムラシゲ&スクーグ基底塩混合物(MS)、粉末	シグマ・オルドリッチ	M5524-50L
MX-RL-pro:ロティサリーチューブローテーター	シロゲックス	824222019999
ミオイノシトール	シグマ・オルドリッチ	I7508-100G
パーシバル成長室	パーシヴァル	AR36L3
パーライト植え土添加物	PVPインダストリーズ	PVP105408
パーマネスト植物トレイ 8'''x12''	VWRインターナショナル	470150-476
pHメーター セブン・コンパクト 5220	メトラー・トレド	30019028
保護メス	フィッシャー・サイエンティフィック	02-688-79
リファンピシン	シグマ・オルドリッチ	R3501-5G
スマートリリース肥料	オスモコート	B0071CZTBA
塩化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S271-3
スペクチノマイシンジヒドロ塩五水化物	シグマ・オルドリッチ	S4014-5G
ポンプ蒸気化器付きのスプレーボトル	トーマス・サイエンティフィック	1141V43
スクエア3.5インチGAUGEポット	グロワーズ・ナーサリー・サプライ社	03GA-0350S
ショ糖	シグマ・オルドリッチ	S0389-5KG
サンシャイン #4 プロフェッショナル栽培ミックスソイル	サンGRO園芸	1341CFL0028P S
界面活性剤 - シルウェット L-77	フィッシャー・サイエンティフィック	NC1791615
真空乾燥器	ラボ・デポ	55207
水溶性オールパーパスフード	ミラクル・グロ	160101