LC-mateを用いた自動HPLC分離:マイクロスケール精製のための統合反復オートサンプラーおよびフラクションコレクター

サマリー

繰り返しのHPLC分離を自動化するために、統合型オートサンプラーおよびフラクションコレクター(LC-mate)が開発されました。アナログ信号を出力するHPLC検出器と互換性があり、LC-mateは手動操作システムの性能を向上させ、高性能液体クロマトグラフィーに依存する研究ワークフローを加速させます。

要約

高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、高価値化合物の精製において重要な役割を果たし、学術および産業の両分野で増加する化学および生物学の要求に応えています。しかし、マイクロスケール精製中の繰り返しの手動注入および分画採取は効率と再現性を大きく制限します。このボトルネックを克服するため、私たちは一時的にLC-mateと名付けられた統合型オートサンプラーおよびフラクションコレクターシステムを開発しました。これはHPLC検出器からのアナログ信号に直接応答することで、繰り返し分離を自動化します。この装置は、サンプル注入用の高圧6ポートスイッチングバルブと分率採取用のセレクターバルブを中心に構成されており、操作パラメータは直感的なタッチスクリーンインターフェース を通じて 制御されます。LC-mateはアナログ出力対応の商用HPLC検出器と互換性があり、同期信号トリガーによって勾配洗脱モードの繰り返し分離も実現可能です。実証実験により、自然生成物精製の安定した動作と再現可能な分離が確認され、手作業での取り扱い時間の明確な短縮が示されました。このシステムは、従来のHPLCワークフローにおける自動化を強化する実用的かつアクセスしやすいソリューションを提供し、手動と完全自動化の精製システムのギャップを埋めます。

概要

クロマトグラフィーは20世紀初頭にM.S.ツウェットによって先駆けられ、1960年代には機器^1、2、3の進歩により現代の高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)へと発展しました。

現在、HPLCは高価値化合物の精製において重要な役割を果たしており、学術および産業分野における生物医学、化学、生物学の増大する需要に応えています。学術研究において、天然生成物の微小規模精製とキラル分子の分解は、半準備的HPLC^技術4,5,6,7,8に大きく依存しています。ほとんどの実務では、予見できないサンプル損失やカラムサイズの制限により繰り返しの注入や分画採取が避けられないため、サンプル溶液の一部をHPLCカラムに注入します。優れた分離能力を持つにもかかわらず、HPLCのサンプル精製への利用は、現行の計測機器やワークフローの制約により制約が依然として存在しています。大きなボトルネックは、特にサンプル注入や分数採取において手作業への過度な依存にあります。これらのプロセスは時間と労力がかかるだけでなく、人為的ミスのリスクもあり、その結果、スループット、再現性、そして全体的な運用効率が損なわれます。^9,10。

Agilent、Shimadzu、Watersなどの主要HPLCメーカーの商用オートサンプラーやフラクションコレクターは信頼性が高く正確な自動化を提供しますが、通常は独自のハードウェアおよびソフトウェアエコシステム内に制約されます。例えば、Agilent 1260 Infinity IIオートサンプラーとG1364Fフラクションコレクターは、AgilentのHPLCシステムにシームレスに統合されており、優れた再現性を提供しますが、クロスプラットフォーム互換性は限定的です。同様に、島津のSIL-20A/40CオートサンプラーやFRC-40/FRC-10Aフラクションコレクターは高スループットと優れた機械的精度を提供しますが、島津のLC-20およびネクセラ制御アーキテクチャに依存しています。Waters AllianceのHPLCオートサンプラーおよびフラクションコレクターIIIモジュールも、堅牢な性能と柔軟な収集フォーマット(最大300 mL/min)を提供しますが、Waters独自のUHPLCおよびLC-MS環境に特化しています。さらに、注入針に依存する従来のオートサンプラーはサンプル回収を妨げる可能性があり、チューブ式のフラクションコレクターは大量の溶出液処理に不便になることがあります。他の多くのHPLC機器では、半調製分離は依然として面倒で繰り返しの手動操作に依存しています。

これらの課題は、HPLCワークフローにおけるサンプル精製の自動化に革新的なアプローチが必要であることを示しています。このニーズに応えるため、私たちはLC-mateというコンパクトで多用途な機器を開発しました。これはオートサンプラーと分画収集モジュールを一つのプラットフォームに統合したものです。LC-mateの流体コアは2つの主要コンポーネントで構成されています。1つはSUS 316ステンレススチール製の高圧6ポートスイッチングバルブ(SKVA-3130-S)で、流量は0.4mmで最大45MPaの運転圧力を支持し、精密なサンプル注入制御が可能で、もう10チャンネルの多位置セレクターバルブはデッドボリュームが最小(ポート間27.5μL)です。 効率的な分画収集のために直径1.2mmのフローチャネルを持つ5μLローター溝。この構成によりデッドボリュームが最小限に抑えられ、交差汚染のリスクが低減されます。詳細な機器仕様については表 1をご参照ください。LC-mateはHPLC検出器からのアナログ出力を受け取り、同期信号 で HPLC機器をトリガーすることで、試料注入と分画収集の両方を独立して制御することが可能です。

表1:LC-mate関連の計測器パラメータ。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

この機器は使いやすい制御ソフトウェアと直感的なタッチスクリーンインターフェースを備えており、アナログクロマトグラフィー信号のリアルタイム可視化が可能です。LC-mateは等角分解モードと勾配分離モードの両方をサポートし、注入体積、繰り返し回数、各注入の間隔時間、収集モード(閾値ベース、時間ベース、またはCollect All(閾値上・下の分数を収集))などの主要パラメータを設定し、単一のコマンドで完全自動化作業を開始できます。これにより、繰り返しの手作業が不要となり、HPLC浄化の効率が大幅に向上します。

図1 は、HPLCシステムと統合されたLC-mateの全体的な外観、動作原理、構成を示しています。

図1:LC-mateシステムの設計とセットアップ。 (A) 回路図レイアウト。(B)計器図。(C)実用セットアップの写真。(D) UV検出器とLCmate間の信号伝送線路の接続。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

1. 接続の確認

1. HPLC、LC-mate、クロマトグラフィーカラム間の溶媒配管接続を確認し、適切な流れ経路を確保してください(図1A)。
2. 図1Dに示すように、UV検出器とLC-mate間の信号伝送線路の接続を確認してください。
   1. 黒線を赤い端子に、白線を黒端子に接続してアナログ信号出力の極性に合わせます。
   2. LCメイトのディスプレイを観察してください。アナログ信号の波形が現れれば、接続は正しいです。
      注意:波形が見えない場合は、接続を逆にしてください:黒い線を黒い端子に、白い線を赤い端子に接続してください。
3. UV検知器とLC-mateのトリガー接続を確認してください。
   1. データケーブルの一端をUV検知器の出力ポートに接続します。
   2. 反対側の黒線と白線を、それぞれLC-mateの青と黒のトリガー端子に接続します。
   3. 端子とトリガーをしっかり締めてしっかり接続してください。

2. 統合分離システムの開始

1. HPLCの適切な起動を確実にしてください。
2. LCメイトの適切な起動を確実にしてください。
   1. LC-mateシステム起動後、インターフェースの LC-mate アイコンをクリックすると、システム自己テストプログラムが自動的に実行され、主要なハードウェアモジュールが初期化されます。
   2. 自己テスト完了後に画面上の「自己テスト」プロンプトが消える短いDiプロンプト音(約0.5秒)を待ちます。これらは初期化完了を示します。

3. 条件最適化

1. HPLC分離条件を設定し、カラム平衡を実現するために洗脱を開始します。
2. LC-mateの画面左側にあるテストアイコンをクリックすると、以下のインターフェースが表示されます(図2A)。入力注入量、溶出時間、繰り返し時間パラメータを入力し、スタートアイコンを押します。オートサンプラー、フラクションコレクター、HPLCの稼働が開始されます。この場合、溶出液はセレクターバルブのポート10からのみ流れ出し、手動で回収するか廃棄することができます。
3. 解像度、稼働時間、保持時間、注入体積、紫外線波長などの実現可能な分離条件を特定し、適切なモードでの分離および分画採取を容易にします。

4. 自動走行

注:実現可能な分離条件のクロマトグラムに基づき、インターフェース左側の 閾値、タイミング収集、 全集の オプションから適切な分数収集方法を選択できます。

1. 閾値に基づく分数収集
   1. インターフェースの左側にある 閾値 機能モジュールを選択すると、 図2Bに示されるパラメータ設定インターフェースが表示されます。
   2. 注入量、繰り返し時間、しきい値、洗脱時間を入力し、スタートボタンを押します。HPLCとLC-mateは自動的に動作します。閾値を超えるクロマトグラフィーピークを持つ画分は、異なる収集瓶に収束されます。
   3. ディスプレイ上に縦に配置されたステータスインジケーターを監視してください:注入進行中を 観察して、 サンプル導入が開始されたことを確認します。クロマトグラフィー分離が進行中かどうかを確認するために、分離 進行 中を確認してください。「シリンジの排出」に注意して、残留液体を排出している時を特定してください。対応するテキストの青色ハイライトで、現在どの運用状態が有効かを確認してください。
      注意:分離過程中、「クロマトグラム」アイコンを押すと新しいインターフェースにクロマトグラムとしきい値線が表示され、そのクロマトグラムはHPLCを制御するコンピュータの画面に表示されるものと同一です。
2. 時代別の分数収集
   1. インターフェースの左側から タイミング収集 モジュールを選択してパラメータ設定メニューを開きます(図2C)。
   2. 必要なパラメータを入力してください: 注入量、繰り返し時間、洗脱時間、そして必要な採取時間の連続。
   3. スタートボタンを押して自動手順を開始し、HPLCシステムとLC-mateは設定されたパラメータに従って繰り返し動作します。
3. 「Collect All」モードによる分数収集
   1. インターフェースの左側にある 「全集」 機能モジュールを選択すると、システムは 図2Dに示されるパラメータ設定インターフェースを表示します。
   2. 収集閾値を設定すると、閾値を超えているか下くいないクロマトピークはすべて別々に収集されるため、混合物中の化合物が失われない可能性が保証されます。
      注:アセトニトリルは可燃性かつ有毒な溶媒です。アセトニトリルやその他の有機溶媒を用いるすべての処置は、換気の良い実験室で行われなければなりません。職員は常に適切な個人用防護具(PPE)を着用し、化学防波用ゴーグルや溶剤耐性手袋を着用しなければなりません。廃棄物アセトニトリルやその他の有機溶媒は、有害化学廃棄物用に指定された適切にラベル付けされた容器に収集されなければなりません。これらの廃棄物は、当機関の環境衛生・安全プロトコルに従い、認可を受けた処分サービスによって処理されました。

5. パイプライン清掃

注意:パイプラインを清掃することで、次回オートサンプラーを使用する際にサンプルがパイプライン内に残らないようにします。

1. 清潔な溶媒の小さなボトルを用意し、オートサンプラーの注入パイプラインを溶媒に挿入します。
2. 左側のインターフェースから クレンジング モジュールを選択してパラメータ設定メニューを開きます(図2E)。
3. インジェクターパイプラインの洗浄
   1. 注入量を0〜1000の間に設定し、繰り返し時間(制限なし)を設定します。
   2. 「清掃完了」の下の クレンジ ングをクリックすると、インジェクターパイプラインのクレンジングを開始します。
   3. 「サイクル」カウントを監視して、完了した洗車サイクルの数を追跡しましょう。
4. 収集パイプラインの浄化
   1. 浄化時間を設定する(制限なし)。
   2. 「現在のパイプライン」下の クレンジ ングをクリックすると、収集パイプラインのクレンジングを開始します。
   3. システムがパイプライン0からパイプライン10まで順に処理している間、 現在のパイプライン 表示を監視してどのパイプラインが清掃されているか確認してください。

図2:方法操作用のLC-mateタッチスクリーンインターフェース。 (A) 最適化画面。(B) しきい値モード。(C)タイミングモード。(D) コレクト・オールモード。(E) パイプライン浄化。(F) 設定。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. データ保存指令

1. 自動保存を有効にしてください。システムは各洗脱サイクル終了後に自動的にクロマトグラムを保存します。
2. 手動保存を実行してください。溶出完了後に 保存 ボタンをクリックしてください。必要なメタデータをダイアログボックスに入力してファイルを保存してください。
3. 保管場所を選択します。ファイルをデバイスのローカルストレージ、SDカード、または外付けUSBドライブに保存するかを選べます。
   注意:容量制限を避け、簡単にデータにアクセスできるように、すべてのデータ保存には外付けUSBドライブを使用してください。

結果

2インチ-O-ガロイル-ハイパーロシドの精製
2"-O-ガロイル-ハイペロシド(2-GH)は、痰や湿気の解決に長い歴史を持つ伝統的な中国医学である Euphorbia helioscopia L.の主要な水溶性成分^です。その化学構造は 図3に示されています。2-GHは最近、動物モデル¹²で抗線維化効果を持つことが確認されました。さらなる薬理学的調査のために十分な純粋な2-GHサンプルを準備するため、LC-mateを用いて半準備的HPLC分離が行われました。詳細な分離パラメータは以下の通りです。

柱:シャープシルC18、150×30mm、10μm;移動相:等管的25%アセトニトリル水、流量15 mL/分;...

ディスカッション

これらの結果は、LC-mateシステムが設定されたパラメータに従って連続的なサンプル注入および分画採取を自律的に行えることを示しており、これにより手動介入を大幅に最小限に抑え、分離効率を高めることができます。このシステムは使いやすいインターフェースを特徴としており、初期のハードウェアセットアップと直感的なタッチスクリーン操作だけで済みます。

実験の成功を確実にするためには、3つの重要な側面に注意を払う必要があります。まず、アナログ信号ケーブルとトリガーケーブルをHPLC検出器とLC-mate間で正しく接続しなければならず(プロトコルステップ1.2.2で詳細に説明)、正確な信号表示と信頼性の高いピークベースの分数収集が可能になります。次に、クロマトグラフィー条件(プロトコルステップ3)を満足のいく解像度、保持時間、ピーク形状、信号強度に最適化する必要があります。最後に、最適化されたクロマトグラムに従って適切な分数収集モードを選択する必要があります。「しきい値」モードは、顕著な吸収信号を示す化合物の集合に適用できます。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高性能液体クロマトグラフ - EasySep-1050	上海通威分析技術有限公司。EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm のウェブページ	1009992	プロトコルで使用されるモジュラー製製HPLCシステムです。溶剤供給ポンプ、UV/VIS検知器、手動注入バルブを備えています。このシステムはLC-mateが自動化するコア分離ユニットを形成します。
(液体クロマトグラフィーカラム)シャープシル-U C18 150mm(長)および時間;30mm(識別)S-10およびマイクロ;m、100A	上海宣美工業発展有限公司	U180110-300150	逆 - 10 & μのC18相クロマトグラフィーカラム;m、孔径は100 & Aring;。これは小分子(薬物や有機化合物など)の分離を目的に設計されており、再現性と安定性が良好です。カラムの寸法(長さ150mm、内径30mm)により、準備または半準備クロマトグラフィーに適しています。
LCメイト	上海ベターレン医療技術有限公司。お問い合わせは on 機器LC-mateについては、対応著者へのご連絡をE-mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	液体クロマトグラフィーシステム用の補助装置で、試料注入、移動相管理、データ取得に使用される可能性があります。HPLCシステムと統合することで、実験プロセスの自動化と効率性を向上させることができます