オプトフルイディクス解析によるキメラ抗原受容体T細胞のマルチモーダル機能評価

Summary

CAR-T細胞を用いた採用型T細胞療法は血液がん治療に有望ですが、持続的な反応は一貫していません。多機能T細胞は寛解耐久性と相関していますが、標準的なアッセイでは主要なサブポピレーションが不明瞭です。私たちは、オプトフルイディクスプラットフォームを用いて、高機能なCAR-T細胞を同定・分離し、さらなる研究のために単一細胞のワークフローを提案します。

Abstract

養子型T細胞療法は、自己T細胞を遺伝子改変して腫瘍標的キメラ抗原受容体(CAR)を発現させ、生 体外 増殖と再注入を行う新しい治療パラダイムです。進行した血液悪性腫瘍患者において抗腫瘍効果の顕著な示発が見られるにもかかわらず、長期的な効果が現れない症例のかなりの割合が見られません。臨床転帰のばらつきにはいくつかの特異な要因が寄与する可能性があるものの、注入前のCAR-T細胞産物に含まれる多機能T細胞の割合ががん寛解の持続性と強く相関しているという証拠が増えています。残念ながら、CAR-T細胞製品の標準評価は現在、バルク集団測定や末端アッセイに依存しており、機能特性の高いサブ集団の分離や研究が制限されています。ここでは、オプトフルイディクスプラットフォームを活用し、個々のCAR-T細胞のサイトカイン分泌プロファイルとCD137発現による活性化の両方を評価するワークフローを示し、これらは選択的に細胞毒性活性評価と組み合わせることも可能です。マルチモーダル機能が最も高い細胞を単離し、次世代CAR-T細胞療法の設計に資するさらなる解析に役立てることができます。

Introduction

キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞は、進行した血液悪性腫瘍患者において顕著な抗腫瘍効果を示している^1,2。しかし、治療を受けた患者のかなりの割合が最終的に再発し、より機能持続性の高いCAR-T細胞製品の開発の必要性が浮き彫りになります 3,4,5,6。臨床転帰のばらつきには多くの特異要因が寄与する可能性があるものの、注入前のCAR-T細胞産物に含まれる多機能T細胞の割合ががん寛解の持続性と強く相関しているという証拠が増えています。したがって、より高い多機能性を持つCAR-T細胞の濃縮や工学的構築戦略は、長期的な臨床反応を媒介する可能性を高める治療用製品を生み出す可能性があります(^6,7,8)。残念ながら、現在のCAR-T細胞機能を特徴づける方法は主に集団測定や末端アッセイに依存しています。これらは、高度な多機能特性を持つ特定のサブ集団を分離・研究する能力を制限します。例えば、サイトカイン分泌は通常、バルク上清液から評価されるか、細胞内染色によって評価されます。後者は単一細胞レベル⁹の情報と引き換えに細胞固定を必要とします。同様に、細胞毒性の可能性は、T細胞/標的細胞^{共培養後の}標的細胞生存率の喪失を定量化することで、バルクCAR-T細胞群に対して評価されることが多いです。生存可能なCAR-T細胞のサイトカイン分泌、活性化、細胞溶解活性を単一細胞分解レベルで評価する能力は、より持続的な抗腫瘍効果を持つ治療薬の開発を促進する可能性があります。

ここでは、オプトフルイディクスの単一セルプラットフォーム(図1)を用いて、個々のCAR-T細胞をマルチモーダル機能のために同時にプロファイリングする方法を提示します。このシステムは光電気的定位(OEP)を用いてサイトカイン捕獲ビーズと個々の細胞を空間的に分離されたペンに移動させ、単一のCAR-T細胞の機能評価を可能にします(図2A)。本プロトコルでは、非ウイルス性遺伝子移植を通じてCAR-T細胞を生成し、抗原発現および抗原陰性標的細胞との共培養中の個々のCAR-T細胞のCD137によるサイトカイン分泌および活性化を評価するワークフローを示します(図3 および 図4)¹¹。修飾細胞産物間でサイトカインおよび活性化プロファイルを区別する可能性は、標準的なCAR-T細胞とc-Jun細胞の過剰発現細胞を比較することで示されています^。単一標的細胞に対する細胞傷害活性は、オプトフルイディクスプラットフォーム上のカスパーゼまたは蛍光ベースの読み取り値を用いて評価することもできます(図2B)。しかし、相互作用の速度論を決定するにはタイムラプス解析が必要であり、これは各CAR構成体や実験によって大きく異なることがあります。同様に、慢性刺激を模倣した反復殺害アッセイは代替のワークフローを必要とします。したがって、本記事では細胞毒性評価の基本的な手順を説明しますが、その詳細な応用については論じません。

選択した評価およびターゲット特性に基づき、最も多モーダル機能を示す生きたCAR-T細胞を機器からアンロードし、96ウェルプレートの個別ウェルに移してさらなる研究を行うことができます(図2C)。

Protocol

注:バッファーおよび培地の準備は表1に記載 されています。

1. 白血球還元系錐体からのCD8 T細胞分離

注意:すべての工程は組織培養のバイオセーフティキャビネット内で無菌・無菌技術で実施してください。希釈、洗浄、再懸濁液のすべての媒体は、処置中ずっと4°Cに保つべきです。

1. 細胞分離培地(密度1.077 g/mL)を2本の50 mL円錐形チューブ(分離チューブ)2本ずつに加えます。
2. 白血球還元系(LRS)の円錐体(円錐形)をキャップのない50 mL円錐形チューブの上にかざします。滅菌されたハサミを使って、LRSコーンの下に伸びているプラスチックチューブを切ります。LRSコーンを開いた50mLの円錐管の上に乗せ、上のプラスチック管を切ります。50mLの円錐形チューブに約8〜10mLの血液を採取してください。
3. 50 mLの円錐形チューブにPBS+EDTA(培地およびバッファーリストに記載された方法で調製)を充填し、ピペットで希釈した血液を混合します。薄めた血液を2つの分離管で均等に分けます。
4. 希釈された血液を750 x g で室温(RT)で15分間遠心分離し、9分を加速、2分を減速にします。
5. 10 mLの血清学的ピペットを使い、各分離チューブからバフィーコートを慎重に採取し、新しい50 mLの円錐形チューブに移します。
6. 各50 mLの円錐形チューブをPBS+EDTAで40 mLに充填し、再懸浮して単細胞懸濁液を得る。単一セル懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清液を吸引してください。
7. 細胞ペレットを再懸浮し、PBS+EDTA40mLに混ぜ合わせます。単一セル懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清液を吸引してください。
8. 細胞ペレットをPBS+EDTAで再懸浮させ、トリパンブルー染色により末梢血単核細胞(PBMC)懸濁液の生存細胞密度を測定します。
   注:トリパンブルーはDNAを染色する生細胞不透過染料です。したがって、生体PBMCも非核細胞(赤血球)も染色されずに残ります。生存可能なPBMC密度を決定する際には、小細胞(例:赤血球)を除外することが重要です。
9. CD8⁺ T細胞の磁気濃縮のために、希望数のPBMCを新しい50mL円錐形チューブに移します。磁気増強に必要なPBMCの開始量として、目的のCD8⁺ T細胞数の10倍を推定します。処置中は試薬を冷たく保ちましょう。
10. PBMCセル懸液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清液を吸引してください。細胞ペレットを1×^{10 7} セルごとに40μLのMACSバッファー(培地およびバッファーリストに示されたもの)で再懸濁します。
11. 1 x 10^{7細胞ごとに}10 μLのCD8⁺ T細胞ビオチン-Abカクテルを追加します。ピペッティングで混ぜ、4°Cで5分間培養します。
12. 1×^{10 7}セルごとに30μLのMACSバッファを追加します。1×^10個の7細胞ごとに20μLの^CD8+T細胞マイクロビーズを追加します。ピペッティングで混ぜ、4°Cで10分間培養します。
13. 事前に冷却されたLSカラムを磁石に置きます。液体の流れを下に15mLの円錐形チューブを置きます。各LSカラムを3 mLのMACSバッファーで平衡させます。
14. 採取チューブと同じ15 mLの円錐形チューブを使用し、細胞懸濁液を平衡状態のLSカラムに塗布します。1 mLのMACSバッファーでカラムを3回洗浄します。1mLの洗浄液がLSカラムを通過するまで待ってから次の洗浄液を塗布します。
15. 収集した細胞を慎重に再懸浮させ、トリパンブルー染色によって濃縮されたCD8⁺ T細胞懸濁液の生存細胞密度を測定します。

2. CD8⁺ T細胞のビーズベースの活性化

1. T細胞とビーズの比率が1:1になるために必要なヒトCD3/CD28ビーズの数を計算します。活性化ビーズストックには1×10⁶ ビーズが25 μLあたり含まれています。
2. 活性化ビーズを少なくとも30秒間優しく渦巻かせてから、計算されたビーズ懸浮液の体積を15 mLの円錐形チューブに移します。ビーズを洗うために同量のメディウムを加え、少なくとも5秒ほど渦を巻きます。
3. 15mLの円錐形チューブをそれぞれの磁石に1分間入れ、チューブの側面のビーズを集めます。吸引して上清液を捨てます。
4. 最終的なT細胞濃度を1×10⁶ T細胞/mLにするために必要な培地の体積を計算します。磁石から15 mLの円錐形チューブを取り出し、計算された培養液の容量に再懸浮します。組換えヒトIL-2を最終濃度50 U/mLに加えます。
5. 完全に補完された培地をT細胞を含むチューブに移し、再懸浮します。細胞懸濁液を適切な細胞培養形式(例:48ウェルプレートに1 mL、24ウェルプレートで2 mL)にシードし、40時間インキュベートします。

3. 非ウイルス性遺伝子移動による核分離によるCAR-T細胞の生成

注:培地(37°C)、試薬(RT)、遠心分離機(RT)の予備加熱は、高い遺伝子移転効率を提供するために不可欠です。

1. 各核分離条件に応じて1mLの細胞培養培地を48ウェルプレートで準備し、標識します。培地を少なくとも30分間孵育し、温かく_CO2調整済みの培地と生理的なpHを提供します。
2. ヌクレオフェクターを起動し、16ウェルストリップ内で核反応する位置を選択します。適切なプログラムを選択してください(例:高効率を重視するFI-115、より高い生存可能性を求めるEO-115)。
3. 培養盤からT細胞の培養皿を取り出し、顕微鏡で細胞の視覚的外観を確認し、活性化が成功したかどうかの最初の印象を得ます。活性化に成功したT細胞は均一なクラスタリングと細胞形状の拡大を示すべきです。新鮮培地と異なるメディウムの色がややオレンジ色に変わる場合は、活性化がより活発な代謝状態をもたらしたことを示し、良い兆候と考えられています。現時点で、早期活性化マーカーCD25およびCD69のフローサイトメトリー解析により活性化の検証が可能です。
4. 活性化されたT細胞を再懸存、収穫、カウントします。1.2から2×10個^の6T 細胞を条件に考慮して必要なT細胞数を計算します。計算された体積を新しい15 mLの円錐形チューブに移し、200 x g で遠心分離機で10分間RTで投与します。
5. 上清液を吸引して捨て、T細胞を温かいPBS10mLで洗浄します。200 x g で10分間RTで遠心分離機にします。遠心分離時間を利用して、通常1 μg/μL濃度のCARコードDNAプラスミドを解凍します。トランスポザーゼエンコード(SB100x)プラスミド(1.0 μg)またはミニサークル(0.5 μg)と、CARエンコードプラスミド(1.0 μg)またはミニサークル(0.6 μg)を、DNAseフリーの1.5 mLマイクロ遠心分離管ごとに個別に組立します。
6. 十分な量のP3ヌクレオフェクター溶液をサプリメントを加えて準備します(条件ごとに16.4 μLのニュークレオフェクター溶液+3.6 μLのサプリメント)。
7. T細胞を含む15mLの円錐形チューブを遠心分離機から取り出し、上清液を吸引し、200 x gの圧力で1分間遠心分離機で残留液を採取します。200μLピペットを使って、細胞ペレットに触れずにできるだけ多くのバッファーを慎重に除去します。
8. 直ちに、各条件ごとにT細胞ペレットを20μLのP3バッファー(材料リストに記載)で再懸濁を続けてください。P3バッファー中の細胞懸浮液20μLを、それぞれの構成要素を含む1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、空気を導入せずに優しく混ぜ、細胞懸濁液を16ウェルの核分離ストリップに移します。井戸の底から空気を軽く叩いて取り除く。
9. 16ウェルストリップを4次元ヌクレオフェクター系に置き、ニュークレオフェクション手順を開始します。核解析に成功した後、選択した各井戸ごとに画面に緑色の十字が表示されるはずです。
10. すぐに準備済みの48ウェルプレートから予熱された培地100μLを加え、16ウェルストリップをインキュベーターで10分間インキュベートします。
11. 慎重に2回から3回にかけて再懸濁し、細胞懸濁液を準備済みの48ウェルプレートに移し、インキュベーターに戻します。
12. 4〜5時間後、各ウェルから慎重に500μLを取り出し、新鮮かつ予温化された培地500μLを50 U/mLの組換えヒトIL-2を補足して慎重に加えます。
13. 培地交換を一日おきに行い、細胞を増殖させ、細胞密度を0.5から2 x 10⁶ T細胞/mLの間に保ちます。
14. 6日目にCD3/CD28の活性化ビーズを外します。T細胞を10回優しく再懸浮させ、細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移して採取します。15mLの円錐形チューブをそれぞれの磁石に1分間置きます。
15. 細胞懸濁液を吸引し、新鮮な培養皿に移し、IL-2を添加した新鮮な培養培地を最終濃度50 U/mLまで細胞に投与します。15mL円錐管の側面壁にビーズが残っているはずです。
16. 7日目にCARまたは代理マーカー発現のフローサイトメトリー解析で遺伝子移転効率を解析し、8日目にトランスジーン陽性CAR T細胞の磁気選別に進みます( 補足図1のゲート戦略)。

4. トランスジーン陽性T細胞の磁気富集

注意:すべての工程は組織培養のバイオセーフティキャビネット内で無菌・無菌技術で実施してください。希釈、洗浄、再懸濁液のすべての媒体は、処置中ずっと4°Cに保つべきです。

1. T細胞は優しく再懸浮させ、15 mLの円錐形チューブに移して採取します。Tセルを数え、磁気的に濃縮するセルの数を取って、300 x gで10分間遠心分離します。
2. 吸引して上清液を排出し、10mLのMACSバッファーに再懸濁して洗浄します。遠心分離機で300×gで10分間加熱します。吸引して上清液を捨てる。
3. 代理マーカー(例:tEGFR)に対して向けられたビオチニル化抗体の量を計算します。通常、抗体は1×^{10 x 6} 細胞あたり1μLまで減量されるべきです。
4. T細胞を1 x 10^7細胞/ mLの密度で再懸浮し、計算された量のビオチニル化抗体を加えます。4°Cで20分間培養します。
5. 10mLのMACSバッファーを加え、遠心分離機で300 x gで10分間洗浄します。吸引して上清液を捨てる。
6. T細胞を1×10^7細胞/ 80 μLのMACSバッファーで再懸濁します。抗ビオチンマイクロビーズを1×10⁷ 細胞あたり20μLの量で添加します。よく混ぜて4°Cで15分間孵育します。
7. 10mLのMACSバッファーを加え、遠心分離機で300 x gで10分間洗浄します。吸引して上清液を捨てる。細胞を500μLのMACSバッファーに再懸濁させます。
8. 事前に冷却されたLSカラムを磁石に置きます。液体の流れを下に15mLの円錐形チューブを置きます。
9. 各LSカラムを3 mLのMACSバッファーで平衡させます。採取チューブと同じ15 mLの円錐形チューブを使用し、細胞懸濁液を平衡状態のLSカラムに塗布します。
10. 1 mLのMACSバッファーでカラムを3回洗浄します。1mLの洗浄液がLSカラムを通過するまで待ってから次の洗浄液を塗布します。
11. トランスジーン陽性細胞を採取するには、磁石からLSカラムを取り出し、新しい15 mLの円錐形チューブに入れます。MACSバッファー5mLを加え、液体を優しくカラムから押し出します。
12. 分離した細胞と遠心分離機を300 x gで10分間数えます。トランスジーン陽性細胞を適切な量の培地に再懸浮させ、IL-2を補足して機能的および/または表現型評価を行うまで培養します。ワークフロー開始前に、CARまたは代替トランスダクションマーカーの染色で純度チェックを行います(補足図2参照)。

5. システム準備

1. 機器の電源を入れ、 セル分析スイート(CAS)ソフトウェアを開きます。廃棄物収集容器が空であることを確認しましょう。加湿器の柱に水があるか確認してください。
2. ワークフローパネルに移動します。システムインストール時にプリロードされた フルクリーン ワークフローを開きます。
   注意:実験開始から72時間以内に フルクリーン ワークフローを実行することが推奨されます。
3. すべてのチェックを実行し、 開始をクリックして進めてください。指示があれば、各試薬ベイスロットの円錐形チューブや試薬瓶を、BLI洗浄液入りの新しい容器に交換してください。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
4. 指示があれば、各試薬ベイスロットの円錐形のチューブと試薬瓶を、滅菌水の入った新しい容器に交換してください。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
5. プリ フライトチェック のワークフロー(システムインストール時にプリロード)を開きます。すべてのチェックを実行し、 開始をクリックして進めてください。
6. 50 mLの円錐形チューブに2 mLのウェッティング溶液を準備します。1xDPBSを39.6mL、ウェッティング添加剤400μLを入れた別の50mL円錐形チューブを準備します。
7. 指示があれば、フラッシュチップをオプトフルイディクスチップに置き換えてください。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。ネストを閉じる前に、オプトフルイディクスチップとネストフェルールの表面を70%エタノールで丁寧に清掃してください。
8. 指示があれば、各試薬ベイスロットの円錐形チューブと試薬瓶を、適切な溶液入りの新しい容器に交換してください。

6. アッセイワークフローの作成

1. ワークフローパネルに移動します。「 新しいワークフローを作成(+)」を選び、 Opto Tセルプロファイリングを選択し、ドロップダウンメニューから 「MCAおよび細胞毒性アッセイ 」を選択してください。
2. 「 マルチプレックス・サイトカインビーズロード 」をダブルクリックすると、ビーズロードリストを展開できます。アッセイ対象が3未満の場合は、 X ボタンをクリックしてビードロードリストからサイトカインビーズを削除してください。
3. 各フィールドに適切なビーズタイプ、サイトカインターゲット、インポート場所を更新してください。
   注意:CASソフトウェアは、ビーズのローディングエントリの配置に関わらず、Cy5の明るさが下がる順に各サイトカインキャプチャビーズを自動的に読み込みます。
4. 「 優先されたAPCロード(Priorityed APC Load w/ Control) 」をダブルクリックすると、ターゲットセルの負荷リストを展開できます。複数の対照標的細胞株と1つの標的細胞株をアッセイする場合は、追加の細胞負荷ステップを追加してください。
5. 各フィールドに、目標のターゲットセルライン名、望ましい視野角(FOV)をペンに、APC選択基準(ターゲットペン選択(TPS)テンプレートファイルを指定して更新します。
6. T セル負荷構成 を選択し、 複数セルラインを選択します。優先 されたTセル負荷 をダブルクリックすると、Tセル負荷リストを展開できます。
7. 各フィールドに希望するTセル系統名、望むFOV(ペン)、Tセル選択基準(TPSテンプレートファイルを指定して)を更新します。
8. 細胞 毒性アッセイ をダブルクリックすると、細胞毒性アッセイの設定を展開できます。ワークフロー固有のイメージング設定フィールドを希望のアッセイ時間(h)で更新してください。
9. 表現 型およびサイトカインアッセイ をダブルクリックして、サイトカイン分泌アッセイの染色プロトコルを拡張してください。
10. 一次・二次ステインのインポート場所をオンチップステイン欄に更新してください。
11. T セルアンロード をダブルクリックするとアンロードリストを展開できます。#チップあたりのエクスポート数(空白を含む)フィールドを希望のエクスポート数に更新してください。新しく作成したワークフローを保存して開いてください。

7. サイトカイン捕獲ビーズロード

1. 各ビーズバイアルにソニック処理やボルテックスをかけてキャプチャービーズを完全に再浮下させます。セルカウンターでビーズ濃度を測定します。
2. ビーズ密度を30μLのビード希釈バッファーで4.5×10⁶ ビーズ/mL(タイプAビーズ)または4×10⁶ ビーズ/mL(タイプBビーズ)に調整します。
3. ビーズ懸濁液は4°Cの温度で保管し、試料積み込みベイへの投入指示が出るまで保管します。すべてのチェックを実行し、 開始をクリックして進めてください。
4. 指示があれば、サイトカインビーズ懸濁液を20μLピペットと混ぜ、適切な輸入場所に注入します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
5. 指示があれば、複数のFOVを目視で点検し、キャプチャビーズが流体チャネル全体に均等に分布し適切な密度で積み重ねられているか確認します。もし負荷分布や密度が最適でない場合は、 フラッシュを選択してインポート してビーズローディングを再挑戦してください。荷重分布と密度が十分であれば、「 進行 」を選択してビーズのペンニングを開始します。
6. 各サイトカインキャプチャビーズごとにステップ7.3を繰り返します。

8. ターゲットセル負荷

1. 各標的細胞株の生細胞密度をトリパンブルー染色で測定します。
   注意:このワークフローは、ターゲット細胞がアクティブ培養から得られることを前提としています。クリオ保存細胞を使用する場合は、解凍後に少なくとも1回は培養され、生存率が90%以上であることを確認しましょう。
2. 1.7mLのマイクロフュージチューブに1×10個^の6個標的細胞を採取します。遠心分離機で300 x gで5分間RTで投与。上清液を吸引します。
3. 各ターゲット細胞ペレットを100μLのAnnexin V染色液に再懸浮させます。光を遮って30分間RTで孵化させます。
4. 1xアンネキシンV結合バッファーを400μL追加し、ピペッティングで再懸留します。遠心分離機で300 x g で5分間RTで投与。上清液を吸引します。
5. 各ターゲットセルペレットを250μLのローディングメディア+_CaCl2に再懸浮させます。標的セル懸濁液は4°Cの温度で保管し、サンプルローディングベイへの投入指示が出るまで保管します。
6. 指示があれば、200 μLピペットでターゲットセルを再懸濁し、適切なインポート場所にターゲットセルの懸濁液を装填します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
7. 指示があれば、複数の視野角を目視で点検し、ターゲットセルが流体チャネル全体に適切な密度で均等に積み重なっているか確認します。負荷分布や密度が最適でない場合は、 フラッシュとインポート を選択してターゲットセル負荷を再挑戦してください。荷重分布と密度が十分であれば、「 進行 」を選択してTPSゲーティングを開始します。
8. 指示が表示されたら、 手動操作に移動し、 TPSをクリックして要求されたTPSテンプレートを読み込みます。
9. TPSゲートを定義するために画像化する光学フィルターとFOVを指定し、「 キャプチャのみ 」をクリックして画像取得を開始します。
10. ゲート設定エディターを開き、Annexinのチェックボックスをクリックし、XパラメータのAnnexin V染色に適したチャネルを選択します。ドロップダウンメニューから「Log(Delta Median Brightness)」を選択してください。YパラメータはOEPを選択してください。ドロップダウンメニューから「最近傍」を選択します。
11. 結果として得られたゲートの角をドラッグしてAnnexin V^のハイ セルとNearest Neighborの^低 セルを除外し、ファイル名を変えずにTPSテンプレートを保存します。
12. ワークフローに戻り、「続ける」をクリックしてペンディングを進めてください。各標的細胞株についてステップ8.7-8.11を繰り返します。

9. Tセル負荷

1. トリパンブルー染色法で各T細胞株の生細胞密度を測定します。
   注意:このワークフローは、T細胞が活性培養から採取されていることを前提としています。クライオ保存細胞を使用する場合は、解凍後に一晩培養し、少なくとも90%の生存率を持つ細胞であることを確認しましょう。
2. 1.7mLのマイクロフュージチューブに1×10個の^6T細胞を採取します。遠心分離機で300 x gで5分間RTで投与。上清液を吸引します。
3. 各ターゲット細胞ペレットを100μLのAnnexin V染色液に再懸浮させます。光を遮って30分間RTで孵化させます。
4. 1xアンネキシンV結合バッファーを400μL追加し、ピペッティングで再懸留します。遠心分離機で300 x g で5分間RTで投与。上清液を吸引します。
5. 各T細胞ペレットを250μLのローディングメディア+_CaCl2に再懸浮させます。Tセル懸濁液は4°Cの温度で保管し、サンプルローディングベイへの投入を促すまで保管します。
6. 指示があれば、200μLピペットでターゲットセルを再懸浮させ、適切なインポート位置にTセル懸濁液を装填します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
7. 指示があれば、複数の視野角を目視で点検し、T細胞が流体チャネル全体に適切な密度で均等に分布しているか確認します。負荷分布や密度が最適でない場合は、 フラッシュとインポート を選択してTセル負荷を再挑戦してください。荷重分布と密度が十分であれば、「 進行 」を選択してTPSゲーティングを開始します。
8. 指示が表示されたら、 手動操作に移動し、 TPSをクリックして要求されたTPSテンプレートを読み込みます。
9. TPSゲートを定義するために画像化する光学フィルターとFOVを指定し、「 キャプチャのみ 」をクリックして画像取得を開始します。
10. ゲート設定エディターを開き、Annexinのチェックボックスをクリックし、XパラメータのAnnexin V染色に適したチャネルを選択します。ドロップダウンメニューから「Log(Delta Median Brightness)」を選択してください。YパラメータはOEPを選択してください。ドロップダウンメニューから「最近傍」を選択します。
11. 結果として得られたゲートの角をドラッグしてAnnexin V^のハイ セルとNearest Neighborの^低 セルを除外し、ファイル名を変えずにTPSテンプレートを保存します。
12. ワークフローに戻り、「続ける」をクリックしてペンディングを進めてください。各T細胞株ごとに9.7-9.11のステップを繰り返します。

10. 細胞毒性アッセイ

1. 50 mL円錐形チューブ内の灌流培地を、解凍前のNucView 530カスパーゼ-3試薬100 μLをT細胞培地20 mL(ストック濃度1 mM、最終濃度5 μM)に加えて調製します。
2. 指示があれば、試薬ベイスロット内の適切な円錐管を、灌流媒体を含む準備済みの円錐管と交換します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
   注:20mLのパーフュージョンメディアは、単一のオプトフルイディクスチップを24時間灌流するのに十分です。細胞毒性アッセイが24時間以上続く場合は、追加の灌流培地を準備してください。
3. 希望すれば、14時間経過後に残った細胞毒性アッセイのイメージングステップを「 TPSの残りをスキップ」をクリックして終了し、ワークフローを進めることができます。

11. 表現型およびサイトカインアッセイ

1. 1.7 mLのマイクロフージチューブで、76 μLの多重ヒトCD8/NKパネル検出抗体と4 μLの抗CD137_BV421を混合して一次染色溶液を準備します。
2. ピペッティングで混合し、4°Cで保存し、装填指示が出るまで保存します。指示があれば、一次染色液と20μLピペットを混ぜ、適切なインポート場所に注入します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。
3. 二次染色液は、1.7mLマイクロフュージチューブで72μLの1x DPBSと8μLのマルチプレックスキットSA-PEを混合して準備します。
   注意:二次染色液は事前に準備し、一次染色が完了するとすぐに装填できる状態にしてください。
4. ピペッティングで混合し、4°Cで保存し、装填指示が出るまで保存します。指示があれば、二次染色液と20μLピペットを混ぜ、適切なインポート場所に注入します。「 走る 」アイコンをクリックして進めてください。

12. アッセイ分析

1. デスクトップに移動して Assay Analyzer ソフトウェアを開きます。 Assay Analyzerを選択し、 ワークフローを選択し、解析するワークフロータイプを選択します。
2. 荷降ろし対象のペンを定義するために、任意の基準を使用してください。望ましい条件に従ってアンロードリストを作成し、CASソフトウェアに戻って 「選択したワークフローを続ける」を選択します。
3. Assay Analyzerでエクスポートリストを作成(Optofluidics Chip ID)のチェックボックスがチェックされていることを確認してください。

13. 荷降ろし

1. 96ウェルの丸底プレートを準備し、1ウェルあたり50μLのT細胞培地を用意します。セルのアンロードを進めるには 「続ける」 をクリックしてください。
2. 指示があれば、チップのローディングベイを開け、ネストの蓋を開けてオプトフルイディクスチップを取り外します。細胞がペンから転がり出ないように、オプトフルイディクスチップの上端を>1°持ち上げて、チップを無菌ペトリ皿に入れます。次のフラッシュ工程中に無菌組織培養インキュベーターで保存します。
3. 空の巣に滅菌フラッシュチップを置き、巣の蓋を閉めてからチップベイを閉じます。 「完了」 をクリックしてから 「続けてください」と言います。
4. 促されたら、チップのローディングベイを開け、ネストの蓋を開けてフラッシュチップを取り出します。オプトフルイディクスチップを空のネストに入れ替え、ネストの蓋を閉めてからチップベイを閉じます。ランアイコンをクリックして先に進めてください。
5. 指示が出たら「 開く 」を選択して「 ウェルプレートのロード/アンロード 」メニューを表示します。前のプレートを外すには 「アンロード 」をクリックしてください。ウェルプレートIDとウェルプレートタイプを更新し、「 ロード」を選択し、「 完了」を選択します。
6. セルのアンロードを進めるには 「続ける」 をクリックしてください。すべての希望のペンが降ろされたら、 手動操作 に移動し、チップベイを開いて興味のあるセルを含むプレートを取り出します。

Results

記載されたプロトコルを用いて、模擬核発現、CAR、C-Jun過剰発現した個々のCAR T細胞に対し、抗原陰性または抗原陽性のFigure 3 K562腫瘍細胞を照射するか、刺激せずに放置(T細胞のみ)しました。標的細胞は、再現性のある結果を得るために抗原の均一発現を評価しました(補足図3)。単一ナノペン内で分離されたため、これらの細胞のサイトカイン発現プロファイルは、試験条件に応じて単一、二重、三重生成として特徴付けられました(図3)。これらの結果は、サイトカイン検出の確立された手法としてELISAを用いて検証されました(補足図4)。

予想通り、模核系T細胞の大多数は、測定された3つのサイトカイン(TNF-α、IFN-γ、IL-2)すべてで陰性でした。標準的なCAR T細胞では、二重、三重、単一陽性IFN-γサイトカイン産生者およびTNF-αおよびIL-2分泌細胞のごく一部が抗原挑戦時に検出されましたが、抗原陰性腫瘍細胞への曝露は多細胞サイトカイン分泌を誘導しませんでした。興味深いことに、c-Junの過剰発現は標的遭遇時に二重および三重サイトカイン産生細胞、ならびに単一サイトカイン分泌細胞の割合を増加させ、これにより標準的なCAR T細胞と比べてサイトカイン陰性細胞の割合を減少させました。これらの結果は、転写因子⁶の強制発現によるCAR T細胞の表現型調節を記述した以前の報告と一致しています。特筆すべきは、T細胞のみのグループで抗原陰性腫瘍細胞群よりもIFN γ陽性細胞の割合が高いことが観察されたことです。これは、その条件下で解析された細胞数が少なかったことが原因と考えられます。

T細胞活性化をさらに調査するため、上記の処理を施した個々のモック核作用細胞、CAR、およびc-Jun過剰発現細胞におけるCD137の発現を評価しました(図4および補足表1)。抗原発現するK562標的細胞によるCAR T細胞の挑戦は、模核細胞と比べてCD137発現が増加しました。さらに、標準的なCAR産物と比べて、c-Jun過剰発現のCAR T細胞においてCD137陽性細胞の割合がやや高い傾向が観察されました。

結論として、このプロトコルは単一細胞レベルでのCAR T細胞のサイトカイン分泌と活性化の評価を可能にし、単細胞および多細胞のサイトカイン産生者の同定や、バルクレベル⁶で以前に記述された表現型傾向の再現を可能にしました。

図1:オプト流体プラットフォームを用いたマルチモーダルプロファイリングの回路図ワークフロー。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2: 異なるオプト流体プラットフォームの特徴の代表画像。(A) OEPを通じて個々のペンに単一粒子の配列をインポートする。画像の左側のペンは前のシーケンスで読み込まれています。(B) 3つの個別ペンで時間をかけて殺菌イベントを行い、GFP発現抗原発現腫瘍細胞を示す。(C) OEPを通じて1つのペンから個別セルをエクスポートすること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:単細胞レベルでのサイトカイン分泌プロファイルの代表的な解析。 個々のモック核系T細胞またはCAR-T細胞は、抗原陰性または抗原陽性のK562腫瘍細胞の有無を条件に、TNF-α、IL-2、IFN-γのサイトカインキャプチャビーズを含むナノペン内で培養されました。円グラフは、24時間の共培養(エンドポイント解析)後に示されたサイトカイン分泌プロファイルを持つ個別に解析されたCAR-T細胞の割合を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:CD137発現の代表的な分析を単細胞レベルで示す。個々のモック核系T細胞(CAR-T細胞)は、培養後24時間後にオプトフルイディクスチップ上でCD137表面発現を染色し、抗原陰性または抗原陽性のK562腫瘍細胞の有無にかかわらず照射しました。バイオリンプロットは、24時間培養後の模核細胞分離T細胞およびCAR-T細胞におけるCD137発現の蛍光強度を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

T細胞培地成分(0.22μM真空ろ過ユニットによる滅菌ろ過)	体積(最終濃度)
RPMI-1640(グルタマックス1回、25mM HEPES)	500 mL
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	5 mL(90 U/mL)
β-メルカプトエタノール(50mM)	0.5 mL(45μM)
ヒト血清(熱で不活化)	50 mL(9%)
グルタMAXサプリメント(100倍)	5mL(0.9倍)
腫瘍細胞培地成分	体積(最終濃度)
RPMI-1640(グルタマックス1回、25mM HEPES)	500 mL
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	5 mL(90 U/mL)
胎児の子乳血清(熱不活化)	50 mL(9%)
MACSバッファコンポーネント	体積(最終濃度)
DPBS(Mg2+フリー、Ca2+フリー)	500 mL
胎児の子乳血清(熱不活化)	2.5 mL(0.5%)
EDTA(0.5 M)	2 mL(2 mM)
PBS/EDTAバッファコンポーネント	体積(最終濃度)
DPBS	500 mL
EDTA(0.5 M)	2 mL(2 mM)
ローディングメディア構成要素	体積(最終濃度)
T細胞培地	18mL
荷込み試薬	2 mL
装填媒体+CaCl2 成分	体積(最終濃度)
ローディングメディア	499 μL
CaCl2	1.25 μL
灌流媒体+カスパーゼ基質	体積(最終濃度)
T細胞培地	20 mL
NucView 530 カスパーゼ-3基板(DMSOで1 mM)	100μL
ビーズ希釈バッファ成分	体積(最終濃度)
DPBS	800μL
BSA(2% w/v)	100 μL(0.2% w/v)
トゥイーン-20(10%無制限)	10 μL(0.1% w/v)

表1:培地およびバッファーの準備。

補足図1。 磁気濃縮前の遺伝子移転効率を評価する例例的なゲーティング戦略。 例的な輪郭線およびヒストグラムプロットは、遺伝子移転後にCAR発現(tEGFR陽性)CAR T細胞を特定するためのゲーティング戦略を示しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2。 仕分け後の純度管理。 例的な輪郭図は、磁気ソーティング後のCAR発現(tEGFR陽性)CAR T細胞の割合を示しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3。 標的腫瘍細胞の抗原発現。 代表的なヒストグラムプロットは、WT K562腫瘍細胞を描くか、フローサイトメトリーによってアイソタイプまたはROR1標的抗体で染色したROR1を発現させるよう設計されたものです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図4。標準ELISAを用いたサイトカイン検出。上清液中のIL-2およびIFN-γ濃度は、CARとCAR+cJ T細胞のE:TでE:Tを4:1でELISAで測定した。統計的有意性は、ペアなしt検定によるもので、*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001、****P≤0.0001。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表1:解析した細胞。表は各条件ごとに分析された個々のセル数を示しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

Discussion

実証されたワークフローにより、抗原陽性および抗原陰性標的細胞との共培養中の個々のCAR-T細胞のサイトカイン分泌および活性化プロファイルの評価が可能となり、これらは必要に応じて細胞解析活性評価と組み合わせることが可能です。マルチモーダル関数データを単一セル解像度で取得する能力は、CAR Tセル性能を前例のない精度で解析する方法を提供しますが、測定の定量性は、同じ数のサイトカインキャプチャビーズ、ターゲットセル、CAR-Tセルを各ペンに装填するOEP技術の精度に大きく依存します。したがって、各試薬やセルサンプルの負荷密度およびTPS基準を最適化し、各ペンで単一ビーズおよび/または単一セルの負荷を可能にすることが重要です。流体チャネル内のビーズやセルの濃度を調整することで十分なペンロードが可能になりますが、プラットフォームのフラッシュおよびインポートオプションはロードプロセスの再挑戦のための追加戦略として機能します。

オプトフルイディクスチップ設計の利点の一つは、ペンのレイアウトを22の異なるFOVに分離していることです。異なるCAR構成要素で設計されたTセルをオプト流体チップ内の異なるFOVに搭載することで、c-Junの過剰発現を強制する代替構造が標準的なCAR構成要素と比較してマルチモーダル機能を持つCAR-T細胞の生成を強化できるかどうかも評価できました(図3 および 図4).このようにして、オプトフルイディクスプラットフォームは、CAR-T細胞によるがん寛解の耐久性を高める可能性のある候補CAR構造物を迅速に特定する手段を提供します。注目すべきは、単一細胞レベルでの標的細胞とエフェクター細胞の相互作用の解析には、腫瘍細胞における標的抗原発現の異質性やCAR-T細胞群の純度など、重要なパラメータの制御が求められます(補足図2 および 補足図3)。

IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌の評価に注力しましたが、市販の多重性サイトカインキャプチャパネルで検出可能な幅広い可溶性分析物により、ワークフローのカスタマイズが大幅に可能となります。最近の進展は、この分野が高次元フローサイトメトリーの方向にも進展していることを示しており、異なる免疫細胞タイプの機能プロファイリングとの相乗効果の新たな可能性を開いています^12,13。例えば、将来の応用には、多機能CAR発現調節T細胞(Treg)を特定するスクリーニングキャンペーンが含まれる可能性があります。これらはTGF-βやIL-10などの複数の抗炎症サイトカインを分泌^します。したがって、オプトフルイディクスシステムの適応性は、細胞免疫療法が非悪性疾患治療の新たなフロンティアへと拡大する中で重要な洞察の道を開く可能性があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4次元核核法器	ロンザ
抗ビオチンマイクロビーズ	ミルテニ・バイオテック	130-090-485
CD3/CD28ダイナビーズ	サーモ・フィッシャー	11131D
CD8+ T細胞分離キット	ミルテニ・バイオテック	130-096-495
CELLSTAR 15ml円錐形チューブ(PP)	グライナー・バイオ・ワン	188271-N
CELLSTAR 50ml円錐形チューブ(PP)	グライナー・バイオ・ワン	227261
コーニング 75cm²プラグシールキャップ付きのU字型傾斜首細胞培養フラスコ	コーニング	430720U
Costar 24ウェルクリアTC処理済みの複数ウェルプレート、個別包装、滅菌済み	コーニング	3526
Costar 48ウェルクリアTC処理済み複数ウェルプレート、個別包装、滅菌済み	コーニング	3548
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし	サーモ・フィッシャー	14190169
DynaMag-15マグネット	サーモ・フィッシャー	12301D
EGFR(エルビタックス、セトゥキシマブ)	イーライ・リリー	NDC 66733-948-23	社内接起(ビオチン)用
EGFR抗体(C225(セツキシマブ))[Alexa Fluor 647]	ノバス・バイオロジカルズ	NBP2-75903AF647
胎児用牛血清、バリュー	サーモ・フィッシャー	A5256801
グルタMAXサプリメント(100倍)	サーモ・フィッシャー	35050038
人間のIL-2 IS、プレミアムグレード	ミルテニ・バイオテック	130-097-748
ヒト血清	ドイツ赤十字(DRK)/ドイツ赤十字(GRC)	該当なし
MACSセル分離カラム、LS	ミルテニ・バイオテック	130-042-401
MACS マルチスタンド	ミルテニ・バイオテック	130-042-303
P3一次細胞4D-ヌクレオフェクターXキット	ロンザ	V4XP-3032
パンコールヒト、密度:1.077 g/ml	パンバイオテック	P04-60500
PE付録V アポトーシス検出キットI	BDバイオサイエンス	559763
ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/ml)	サーモ・フィッシャー	15140122
Pierce細胞表面ビオチニル化および分離キット	サーモ・フィッシャー	A44390
QuadroMACS スターティングキット(LS)	ミルテニ・バイオテック	130-091-051
RPMI 1640 ミディアム、グルタマックスサプリメント、HEPES	サーモ・フィッシャー	72400054
血清学用ピペット2、5、10、25、50 ml	グライナー・バイオ・ワン	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
トライパンブルーステイン(0.4%)	サーモ・フィッシャー	15250-061
ウルトラピュア 0,5 M EDTA、pH 8,0	サーモ・フィッシャー	15575020
&β;-メルカプトエタノール(50mM)	サーモ・フィッシャー	31350010
ビーコン試薬
96ウェルプレートラウンドボトム	コーニング	3799
ビーコンプラスチックフラッシュチップ		500-00030
BLIクリーニング液、ナトリウム・ハイポクロイト、0.825%	ブルーカー	520-08000
牛血清アルブミン(BSA)	シグマ・オルドリッチ	A4161
ブリリアント・バイオレット421 抗ヒトCD137(4-1BB)抗体	バイオレジェンド	309820
塩化カルシウム(CaCl2)	シグマ・オルドリッチ	C5670
LEGENDplex ヒトIFN&ガンマ線;キャプチャビーズB3、13X	バイオレジェンド	740545
LEGENDplex ヒューマンIL-2キャプチャビーズA5、13X	バイオレジェンド	740934
LEGENDplexヒトThパネル検出抗体V02	バイオレジェンド	741041
LEGENDplex ヒトTNF&α;キャプチャービードB7、13X	バイオレジェンド	740711
レジェンドプレックス SA-PE	バイオレジェンド	740452
NucView 530 Caspase-3 基質、DMSO で 1 mM	H&Wooml;イゼル	B-10406
OptoSelect チップ 3500	ブルーカー	500-12001
アジ化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S2002
20時	シグマ・オルドリッチ	P1379
ヴィーガン輸出バッファ	ブルーカー	520-00040
VWRメディアボトル、スクエア、PETG、125ml	VWR	216-2265
VWRメディアボトル、スクエア、PETG、500ml	VWR	216-2267
濡れ加法	ブルーカー	520-08016
ウェッティング溶液	ブルーカー	520-00009