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方法論記事

ラットモデルにおける放射線誘発皮膚損傷に対するAcorus calamus L.抽出物の治療効果

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DOI:

10.3791/69705

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2026年1月9日

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1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

この記事について

サマリー

放射線誘発性皮膚損傷は、がん患者における放射線治療の一般的かつ重篤な合併症です。効果的な臨床治療法はありません。本プロトコルは、放射線誘発性皮膚損傷に対するAcorus calamus L.抽出物の治療効果を評価し、その臨床予防および治療のための新薬候補および治療戦略の提供を目指しています。

要約

放射線による皮膚損傷はがん治療における一般的かつ衰弱させる合併症であり、しばしば創傷の治癒遅延や患者の不快感の増加を引き起こします。予防や治療のために利用できる治療薬はいくつかあります。伝統中国医学、特にアコルスカラマスL.は様々な皮膚疾患の治療に可能性を示してきましたが、放射線による皮膚損傷に対するその有効性はまだ十分に解明されていません。

この研究では、スプラグ・ドーリー・ラットモデルを45 Gy放射線に曝露させて皮膚損傷を誘発しました。ラットには10%、20%、40%のアコラスカラマスL.抽出物で45日間投与されました。創傷治癒、炎症、アポトーシス、血管新生は、創傷治癒率、組織病理学的解析、サイトカイン測定、TUNEL染色、免疫組織化学を用いて評価しました。Acorus calamus L.による治療は創傷治癒を加速させ、中用量群が最も治癒率が高く(45日で88.97%)しました。組織病理学的解析により、炎症の減少、コラーゲンの組織改善、新たな血管形成が示されました。炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α)の血清レベルは有意に減少し、アポトーシスは減少し、主要なアポトーシスタンパク質(P53、バックス、Bcl-2)の調節が行われました。VEGFおよびbFGFの発現はアップレギュレーションされ、血管新生と組織修復を促進しました。アコラスカラマスL.は、炎症を抑え、アポトーシスを抑制し、血管新生を促進することで放射線による皮膚損傷の治癒を促進します。これらの発見は、放射線による皮膚損傷の管理における治療薬としての可能性を示唆し、臨床腫瘍学における放射線誘発皮膚損傷の管理に有望な代替手段を提供します。その分子メカニズムを明らかにするためにはさらなる研究が必要です。

概要

放射線誘発性皮膚損傷は、原子力事故および腫瘍放射線治療の両方で頻繁に起こりやすい合併症です。放射線治療では、約95%の患者が何らかの皮膚損傷を発症し、紅斑、脱臼、再発性壊死性潰瘍、持続的な痛み、悪性進行のリスク増加などを発症します。これらの病変は治療に抵抗性が高く、患者の生活の質を大幅に低下させ、時には放射線治療の中断を余儀なくされるため、放射線腫瘍学における大きな臨床的課題となっています。放射線による皮膚損傷の根本的なメカニズムは複雑で、主に皮膚組織内での活性酸素の生成が細胞のプロセスを妨げ、治癒過程を悪化させるというものです。これにより、アポトーシス関連遺伝子の発現が長期化し、炎症反応が調節されず、シグナル伝達経路が変化し、放射線による創傷の持続性に寄与しています。

放射線による皮膚損傷に対する普遍的に認められたゴールドスタンダード療法は現在存在しません。臨床管理では抗炎症または抗酸化アプローチが強調されます。7、特に局所コルチコステロイドは抗炎症、免疫抑制、血管収縮効果により皮膚反応を軽減しますが、長期使用すると皮膚が薄くなることがあります8。FDA承認の放射線防護薬であるアミフォスチンは、重大な副作用のため臨床使用が制限されています。成長因子は細胞増殖、血管新生、肉芽組織形成を促進することで創傷治癒を促進しますが、その作用は狭く、深部組織の損傷や炎症に対する制御が限られており、過剰形成のリスクも伴います。そのため、伝統中国医学(TCM)はホリスティックな哲学、多様な治療効果を持つ複数の活性成分、そして良好な安全性プロファイルで注目を集めています。過去の研究では、リコリスエキス、アロエ多糖類、クルクミンなどの天然産物が、放射性炎症や組織損傷を軽減し、活性酸素を除去し、炎症促進因子(TNF-α、IL-6)を阻害し、線維芽細胞増殖を促進することが示されています。しかし、これらの研究の多くは単一有効化合物や単一標的を調査しており、多成分の相乗作用のメカニズムについて十分な洞察を提供していません。抗炎症、抗酸化、抗菌、創傷治癒の特性でよく知られる植物であるアコラスカラマスL.は、さまざまな皮膚疾患に可能性を示しています。

アコラスカラマスL.は、アラネ科の多年生草本で、テルペン、フェニルプロパノイド、フラボノイド、ステロイド、アルカロイドなど複数の生物活性化合物を含んでいます。その多成分組成により複数の標的に対して同時に作用し、相乗効果を生み出す薬理学的効果13。研究によると、NF-κBやMAPKなどの炎症性シグナル伝達経路を阻害し、TNF-αやIL-6などの炎症促進因子のmRNA発現を用量依存的にダウンレギュレーションし、SODやGSH-Pxなどの抗酸化酵素の活性を高めることで、抗炎症、抗酸化、抗菌効果を発揮することが示されています14,15.感染症やアレルギーによる皮膚疾患の治療に効果があることが証明されているものの、放射線による皮膚損傷におけるアコラス・カラマスL.の役割はまだ十分に解明されていません。最近の研究では、放射線による損傷に対する保護効果が示され、創傷治癒を促進し炎症を軽減することが示されています13。しかし、放射線誘発性皮膚損傷におけるAcorus calamus L.の具体的な治療機序はまだ完全には解明されていません。

本研究の全体的な目的は、放射線誘発皮膚損傷の動物モデルにおけるAcorus calamus L.抽出物の治療効果を評価することです。創傷治癒、炎症反応、細胞の挙動を評価し、抽出物の作用機序を複数の視点から明らかにします。本研究結果は、がん放射線治療による皮膚病変の臨床管理におけるAcorus calamus L.の理論的根拠を確立することを目的としています。さらに、抽出物の機能的特徴、適切な介入シナリオ、コア効果データを提示し、読者がこの自然生成物ベースのアプローチが自身の研究や臨床ニーズに合致するかどうかを判断する手助けをします。最終的に、この研究は腫瘍放射線治療を受ける患者の生活の質を向上させるための効果的な治療法の提供を目指しています。

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プロトコル

本研究で記述された動物実験は、北部戦域指揮総合病院の動物医学研究倫理委員会(倫理承認番号:2018-03)によって承認されました。研究にはSPFグレードの雄スSDラット(生後6〜8週、体重190〜220g)が使用されました。使用された試薬や装置の詳細は 材料表に記載されています。

1. 実験動物の収容

  1. 生後6〜8週、体重190〜220gのSPFオスSDラットを108匹選別。
  2. 動物の室温は22 ± 2°C、相対湿度は50 ± 5%、12時間の明暗サイクルに保ちます。ラットが食べ物や水を自由に利用できるようにしましょう。1週間の順応期間の後、追跡実験に進みます。

2. 動物のグループ化

  1. ラットをランダムに5つの異なるグループに割り当てます:正常群(正常、n = 18)、モデル群(モデル、n = 18)、陽性薬物群(陽性、n = 18、ベタメタゾンクリーム)16、低用量実験群(実験L、n = 18)、中用量実験群(実験M、n = 18)、高用量実験群(実験H、n = 18)。正常群を除き、すべての群が放射線に曝露されました。

3. 放射性皮膚損傷の動物モデルを確立する

  1. 1%のペントバルビタールナトリウム溶液(40 mg/kg)腹腔内注射で、正確かつ最小限の不快感で麻酔を投与します。角膜反射の欠如とつま先のつまみへの反応の欠如を観察して、麻酔の深さを確認してください。乾燥を防ぐためにラットの目に軟膏を塗りましょう。
  2. 電動シェーバーでネズミの背中の毛を取り除く。その後、背中をヨウ素と75%アルコールで消毒します。
  3. それぞれのラットをうつ伏せの姿勢に置きます。 32P-β照射器(表面線量率:0.9 Gy/min)を両側脊椎領域(2 cm× 2 cm)に固定し、正中線から外側1cmの中心に固定し、露出源が表皮に隙間なく接触するようにします。照射時のずれを防ぐため、無菌医療用テープでアプリケーターを固定してください。対象皮膚部を50分間照射し、合計吸収量45 Gy17を達成します。
  4. 放射線照射後に意識を取り戻したら、個別のケージに戻し、水や食べ物を 自由に提供し、温度を22±2°C、相対湿度50±5%、12時間の明暗サイクルで保ちます。
    注:実験過程は生物的および放射性職業保護の確立された原則に厳守しなければなりません。さらに、すべての運用手順は医療廃棄物および放射性廃棄物の適切かつコンプライアンスに準拠した処分に関するガイドラインに従い、関係するすべての人員の安全と健康を確保しなければなりません。

4. アコラスカラマスL.抽出物の調製および薬剤投与

  1. アコルスカラマスL.の根茎を計量し、徹底的に洗浄し、自然乾燥させて粗い粉末(40メッシュ)に挽いてください。50%エタノールを10〜20巻混ぜて室温で24時間均質化します
  2. 抽出物を30分間沈殿させた後、上清液をデカントし、粗い不純物を除去するために4〜8層のガーゼで予備ろ過を行います。その後、ろ紙でろ過し、50〜60°Cのロータリー蒸発器で低圧でろ過液を蒸発させ、溶媒を回収します。これにより溶剤を含まない固体残留物(AE、含水率<5%)が得られます。
  3. AE軟膏調製18
    注意:中国薬典2020年版(一般章0109)に従い、アコラス・カラマスL.抽出軟膏を10%(実験用L、w/w)、20%(実験用M、w/w)、40%(実験用H、w/w)を配合してください。
    1. AE(例:20%軟膏は20g)と対応する医薬品グレードのペトロラタム(例:20%軟膏は80g)を正確に計量してください。
    2. 全石油の10%をAEに加え、5分間強く研磨して均質なペースト状にします(幾何学的希釈法で、AEが脂溶性基底に均等に分散するようにします)。
    3. 残ったペトロラタムを60°Cで溶かし、55°Cまで冷やし、ゆっくりとAEペトロラタムペーストに加えます。
    4. 55°Cで250rpmで30分間磁石でかき混ぜ、その後室温まで冷やしながら連続攪拌すると、滑らかで粒子のない軟膏が得られます。
    5. ブランクコントロールの準備:60°Cでペトロラタムを溶かし、250rpmで30分間かき混ぜ、室温まで冷やします(AE軟膏のベースと同じです)。
    6. 軟膏と空のペトロラタムは密封された滅菌容器で4°Cで保管してください。
  4. すべてのグループは放射線照射後45日間、1日9時と17時に1日2回局所投与されました(放射線照射なしの正常グループは同期的に同じ投与スケジュールを受けました)。投与量は0.2 g/cm²で、背側皮膚の2 cm×面積に均等に分布していました。通常グループは車両(ペトロラタム)、モデルグループは車両(ペトロラタム)を受け取りました。陽性対照群にはベタメタゾンクリームが投与されました。実験群L、M、HはそれぞれAE含有量10%、20%、40%(水/水)のクリームを受け取りました。各塗布後、処理部位を10秒間優しくマッサージして吸収を促し、舐めを防ぐためにラットを5分間拘束しました。

5. ラットの皮膚組織と血液の採取

  1. ラットには1%のペントバルビタールナトリウム溶液(40 mg/kg、単位)で麻酔します。手術器具を消毒し、傷口の皮膚を切除してください。
  2. 組織の一部を4%パラホルムアルデヒド(10 mL)に固定し、もう一部をグルターアルデヒド/四酸化オスミウム(5 mL、2.5%)に固定し、残りは液体窒素で保存してさらなる分析を行います(材料 表を参照)。
  3. ラットの腹部大動脈から血液サンプルを採取してください。遠心分離機で3,000 × g 、4°Cで15分間;上清液をEPチューブに吸引します。分割して-80°Cで保存します。

6. 治癒評価

  1. 照射後7日目、15日目、30日目、45日目に傷口を観察し、高精細カメラで傷口表面の画像を撮影してください。画像をImageJにインポートし、傷の縁に沿って傷の部分を描きます。画像の面積を計算します。測定誤差を避けるために、各操作が一貫していることを確認しましょう。傷の治癒時間と治癒速度を計算してください。
    注:創傷治癒率(%) = (初期照射面積 - 未治癒創傷部位) / 初期照射面積。創傷治癒基準:完全治癒とは、傷の面積の5%<かさぶた状の部分、または95%>治癒した部分のいずれかと定義されます。初期被曝面積:被照射動物が安定した創傷(基準値)を示した時点で測定された創傷面積。

7. 電子顕微鏡検査

  1. 迅速な組織サンプリングと固定
    1. 鋭い刃を使って、表皮と真皮層を覆う1 mm³の皮膚組織ブロックを切除します。
    2. 直ちに標本を事前に冷却した2.5%グルターアルデヒドリン酸緩衝液(0.1 M、pH 7.4)に4°Cで24時間浸けて固定します。
  2. バッファー洗浄
    1. 0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4)を用いて3回の洗浄を行い、1回の洗浄に15分の時間を確保します。
  3. 固定後
    1. 試料を4°Cの1%四酸化オスミウム溶液に遷移させ、1.5時間の固定を行います。
  4. 勾配脱水
    1. アセトン濃度は50%、70%、80%、90%、100%ずつ段階的に通過し、各ステップに15分を割り当てます。
    2. 100%アセトンで3回繰り返し、各浸漬は10分間続けます。
  5. エポキシ樹脂埋め込み
    1. 試料をアセトンとエポキシ樹脂の2:1の混合液に2時間浸け、その後純粋なエポキシ樹脂に一晩浸けます。
    2. 試料を60°Cで48時間重合し、固体ブロックを形成します。
  6. 断面と染色
    1. ウルトラミクロトームを使って70nmの超薄片を作ってください。
    2. 酢酸ウランで15分間染色し、その後60°Cで5分間クエン酸鉛で染色します。

8. ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色

  1. パラフィン埋め込みを行う
    1. 皮膚標本を切除し、アルコール勾配(例:70%、80%、95%エタノールをそれぞれ15分間)で脱水し、その後100%エタノールを2回交換し、それぞれ15分間)、その後キシレンに移し、組織が半透明状態になるまで移動します。
    2. パラフィンに浸して埋め込みを確実にし、その後固化させます。
  2. 脱毛と水潤の実行
    1. パラフィン断片をキシレンI/IIにそれぞれ10分間浸します。
    2. キシレンを100%エタノールですすぐ後、95%エタノールに3分、80%エタノールに3分、70%エタノールに3分浸し、最後に蒸留水で洗い流します。
  3. ヘマトキシリン核染色の実施
    1. ハリスのヘマトキシリン溶液に室温で7分間浸します。
    2. 流水で10分間すすいで青みが出るまで続けます。
  4. 差別化とカウンターステインの実装
    1. エタノール中の1%塩酸を用いて3秒分異します(顕微鏡で核の透明度を観察)。
    2. 0.5%アンモニア溶液で30秒間カウンターステインを施します。
  5. エオシンカウンターステインを行う
    1. 0.5%のエオシン溶液(1%氷河酢酸を含む)で90秒染色します。
    2. 蒸留水で素早く5秒ほど洗い流して余分なシミを落とします。
  6. 脱水とクリアリングの実行
    1. 70%、80%、95%、100%エタノールI/IIを順次通過します(それぞれ1分)。
    2. キシレンI/IIでそれぞれ2分間クリアします。
  7. シールと観察を適用してください
    1. ニュートラルレジンをドロップごとに塗り、カバースリップで覆います。
    2. 顕微鏡検査前に60°Cのオーブンで30分間乾燥させます。

9. マッソンのトリクロム染色

  1. HE染色前のレアックス除去と同様に、ルーチンの脱ワックスを行ってください。
  2. 核染色
    1. ヘマトキシリン溶液に10分間浸します。
    2. 流水で5分間すすいで青みが戻るまで洗い流してください。
  3. コラーゲン繊維染色
    1. アリザリンレッドとアシッドフクシンの混合物に5分間浸けてください。
  4. リンホモリブ酸分化
    1. 1%ホスホモリブ酸水溶液に1分間移します。
  5. 筋繊維の染色処理
    1. 2.5%のアニリンブルー溶液に直接5分間移します。
    2. 0.5%氷河酢酸水溶液で素早く5秒洗い流します。
  6. 脱水と取り付け
    1. 勾配エタノール脱水を実施:95%エタノールI、100%エタノールII(それぞれ30秒)。
    2. キシレンでクリア。
    3. 中性樹脂を使い、60°Cで乾燥させてから顕微鏡で観察します。

10. IL-1β、IL-6、TNF-αレベルのELISA検出

注:IL-1β、IL-6、TNF-αは炎症の有無と強度を評価するために一般的に用いられる重要な炎症促進サイトカインです。そのレベルを監視することは、炎症過程の理解や抗炎症治療の効果を評価するために非常に重要です。

  1. 血清サンプルを準備する
    1. ステップ5.3に記載されたプロトコルに従って血清サンプルを採取してください。
  2. 希釈標準と試料
    1. 試料希釈剤を用いて標準の勾配希釈を作成し、血清サンプルを1:4の比率で希釈します。
  3. サンプルを追加して培養します
    1. 各井戸に100μLの標準/試料を注入します。井戸を膜で覆い、37°Cで90分間培養;その後、液体を捨て、井戸を拭き取って乾かします。
  4. 抗体-酵素反応を検出する
    1. 各ウェルにIL-1β、IL-6、TNF-α特異的な酵素標識試薬100 μLを投与します。37°Cで60分間孵化します。液体を取り除き、吸い取って乾かします。プレートを200μLのウォッシュバッファーで4回洗います。
    2. 各ウェルに100μLのストレプタビジン-HRP作業液(1:100希釈)を加え、暗闇で37°Cで30分間孵化します。プレートを200μLのウォッシュバッファーで4回洗います。
  5. 色を現して終了させる
    1. 各井戸に100μLのTMB基板溶液を導入します。室温の暗闇で10分間孵化します。その後、各井戸に50μLの停止溶液を加えます。
  6. データの読み取り
    1. 酵素結合免疫吸着アッセイリーダーを用いて450 nm(校正波長630 nm)での吸収を30分以内に測定します。標準曲線を用いて濃度(PG/mL)を計算します。

11. チューネルアッセイ

  1. セクション前処理
    1. パラフィンの断片は脱ワクと脱水で蒸留水に到達します。
    2. 20 μg/mL濃度の作動液を導入し、37°Cで20分間培養します。
    3. PBSで3回洗い、各洗いは2分間続けます。
  2. ラベル付け反応
    1. TdT酵素とフルオレセイン標識dUTPを含むTUNEL反応混合物を適用します。
    2. 加湿室で37°Cの暗闇で60分間孵化させます。
  3. 信号変換
    1. PBSで3回洗い、1回5分の洗濯時間を確保します。
    2. HRP標識された抗フルオレセイン抗体を1:500の希釈で導入します。
    3. 37°Cで30分間孵育します。
  4. DAB染色発生
    1. PBS洗浄後、DABクロモジェニック溶液を塗布し、顕微鏡で1〜3分間現像を観察します。
    2. 蒸留水で反応を止めます。
  5. カウンターステインと取り付け
    1. 核をヘマトキシリンで1分間カウンターステインします。
    2. グレーディングエタノールで脱水し、キシレンで透明化し、中性樹脂でマウントします。
  6. 結果解釈
    1. アポトーシス核は茶黄色で識別し、正常核は青色で見えます。
    2. スライドごとに5つの高出力フィールド(400×)をランダムに選び、アポトーシス率を計算します。

12. 免疫組織化学的染色

  1. 脱垢と抗原回収
    1. パラフィン断片をキシレンIに10分間浸し、その後キシレンIIに移してさらに10分浸します。その後、勾配エタノール系列を用いて脱水します。まず100%エタノールIに5分、続いて100%エタノールIIで5分、95%、80%、70%エタノールでそれぞれ3分ずつ、最後に蒸留水で2分間すすぎます。
    2. pH6.0で0.01 Mのクエン酸ナトリウム緩衝剤を用いて高圧熱修復を行い、温度を121°Cの3分間維持します。
  2. 内因性干渉をブロックする
    1. 室温で3%のH-2-O2溶液を10分間導入し、内因性酵素を不活性化します。
    2. 5%BSAブロッキング溶液を組織に塗布し、37°Cの加湿チャンバーで45分間培養します。余分なブロッキング溶液はすすいでいずに吸引してください。
  3. 抗体インキュベーション
    1. 5%のBSAブロッキング溶液を投与し、37°Cで30分間培養します。
    2. 最適化濃度(例:P53、Bax、Bcl-2、VEGF、bFGF)で一次抗体作動液を加え、4°Cの加湿チャンバーで一晩培養します。0.1%トゥイーン-20を含むPBS-Tバッファーで3回、各5分間洗浄します。
    3. HRP標識された二次抗体を1:200希釈したものを導入します。37°Cの加湿室で60分間孵化します。PBS-Tバッファーで3回、それぞれ5分間洗います。次にABC共役液を加え、37°Cで30分間インキュベートし、その後PBSバッファーを使った3回の洗浄をそれぞれ5分間行います。
  4. DABカラー現像
    1. 0.02%のH₂O₂を含むDAB現像液を加え、常温の顕微鏡下で1〜4分間現像を観察します。
    2. すぐに蒸留水で反応を止めてください。
  5. カウンターステインと取り付け
    1. サンプルをハリスのヘマトキシリン溶液に1分間浸し、流水で10分間すすいで青色回復を図ります。
    2. 次の溶液に順次浸します:70%エタノールを30秒浸かせ、80%エタノール30秒浸かす、95%エタノールを30秒浸す、100%エタノールIを1分間、100%エタノールIIを1分間浸します。
    3. 完全なクリアリングと固定のために、キシレンIに2分間浸け、その後キシレンIIに2分間移します。中性樹脂のマウントをメディウムごとに落とし、カバースリップで覆い、60°Cのオーブンで30分間乾燥させます。
  6. 結果の定量化
    1. 茶色は肯定的な反応を示します。正の信号(茶色がかった黄色)は負の背景と対比させるべきです。
    2. Image-Pro Plusソフトウェアを使って、少なくとも5つの視野で陽性セルの割合を計算してください。

13. ウェスタンブロッティング検出

  1. 組織溶解製剤
    1. 液体窒素で凍結した皮膚組織を、-80°Cで予備冷却されたステンレス製モルタルに注入します。蒸発を抑えるために液体窒素を3段階ずつ徐々に添加します。すべての粒子が見えなくなるまで垂直に研ぎます。できた粉末を溶解バッファーを含むEPチューブに移します。
    2. プロテアーゼ阻害剤(1:100)とリン酸酵素阻害剤(1:50)を取り入れます。氷上ボルテックス30秒;超音波破壊を導き、振動式インキュベーターで4°Cで2時間培養します。遠心分離機は4°C、14,000 g × 20分間;上澄液を慎重に吸引してください。
  2. タンパク質の定量化と処理
    1. 上清液5μLを96ウェルプレートに分散します。BCA作動液200μLを追加し、暗闇で37°Cで30分間孵化します。マイクロプレートリーダーを用いて562 nmでの吸収を測定し、濃度は標準曲線に従って決定します。
    2. 5×の低減タンパク質ローディングバッファーをタンパク質溶液と4:1の比率で組み合わせます。沸騰したお湯に15分間浸して変性させる。将来の使用のために-20°Cで保存してください。
  3. SDS-PAGE電気泳動
    1. 12%アクリルアミド分離ゲルを準備します。ジェルをコーム歯の1cm下まで注ぎます。空気の侵入を防ぐためにイソプロパノールで覆い、固化後、イソプロパノールを除去します。4%濃縮ゲルを注ぎます。15ウェルの櫛を挿入します。室温で30分間固化させ、ローディングウェルに5μLのあらかじめ染色済みタンパク質マーカーを加える。2井戸に20μLの空白溶解液を加えます。3から14のウェルに40μgタンパク質を含むサンプル10μLを加えます。
    2. 80 Vで電気泳動を開始します。ブロモフェノールブルーが分離ゲルに移動する際に120Vに切り替え、氷水循環で10〜15°Cの温度を維持し、ブロモフェノールブルーがゲルの底から0.5cmまで伸ばします。
  4. ウェットブロッティング手順
    1. 20%メタノールを含むトランスファーバッファーを準備します。4°Cまで予備冷却します。 PVDF膜をメタノールに1分間浸すことで活性化します。緩衝材でNC膜を平衡させます。転写クランプを次の順番で組み立てます:「カソードプレート - スポンジパッド - フィルターペーパー - ジェル - 膜 - フィルターペーパー - スポンジパッド - アノードプレート」;ローラーで気泡をしっかり取り除き、ターゲットタンパク質の分子量に応じてパラメータを設定する:50 kDa<タンパク質の場合は、100 Vの定電圧伝達を60分間使用します。50〜100 kDaのタンパク質については、250 mAで定流電流を90分間流します。100 kDa>タンパク質の場合は、300 mAで120分間定流を導入します。4°Cの循環水浴に接続してください。
  5. 免疫検出手技
    1. 移膜後、PVDF膜をメタノールに1分間浸します。TBSTで3回、それぞれ5分間洗う。膜表面に3%のH₂O₂/TBSTを塗ります。室温の暗闇で15分間孵化します。液体を吸引し、5%のBSA/TBSTブロッキングソリューションを追加し、37°Cの揺れインキュベーターで1時間ブロック;膜をTBSTで3回、それぞれ5分間洗います。
    2. 一次抗体の作動液(P53、Bax、Bcl-2、VEGF、bFGFなど)を加えます。振動式インキュベーターで4°Cで一晩孵化します。膜をTBSTで4回、それぞれ10分間洗浄します。HRP標識された二次抗体を追加し、室温の揺れるインキュベーターで90分間培養します。膜をTBST + 0.5% SDSで6回、各8分間洗浄します。
  6. 化学発光イメージング
    1. ECL A溶液とB溶液を等量混合します。膜表面を均一にコーティングし、暗闇の中で60秒反応を起こすこと;余分な液体を吸引し、強いシグナルタンパク質については1〜5秒の単回曝露時間を設定し、弱いシグナルタンパク質に対して5つのセグメント(10/30/60/120/300秒)で累積曝露を行います。化学発光イメージャーを用いて画像を撮影します。
  7. データ分析ワークフロー
    1. ImageJソフトウェアを用いてタンパク質を定量化;一様な背景減算閾値を確立すること;標的タンパク質と参照タンパク質(βアクチンまたはGAPDH)のグレースケール比を計算します。
    2. データをGraphPad Prismにインポートして解析します。

14. 統計分析

  1. 平均±平均でデータを提示します。2つのグループ間の比較には独立した標本t検定を用い、複数グループ間の比較には一方向ANOVAを用いましょう。
  2. SPSS 26.0およびGraphPad Prism 8.0.2を使用してデータを解析します。
  3. P<0.05を統計的に有意な差を示す指標と考えてください。

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結果

Acorus calamus L.の放射線誘発皮膚損傷に対する治療効果
照射から15日後、すべてのラット群で乾燥剥皮、局所的な赤み、腫れ、潰瘍、かさぶたが見られました。照射後30日目、モデル群は最も重度の皮膚損傷を示し、照射部位のかさぶたや潰瘍がピークに達しました。45日目には、モデル群ではかさぶたの剥落が最小限で、傷には収縮が見られました。対照的に、Acorus calamus L.および陽性の薬物治療群は、皮膚損傷の有意な減少、潰瘍の軽度化、創傷治癒の促進、上皮の被覆の迅速さを示しました( 図1A参照)。照射後45日時点で、中用量のアコラスカラマスL.群が最も高い傷の治癒率を88.97%で示し、高用量のアコラスカラマスL.群が72.88%、陽性対照群が64.75%で続きました( 図1B参照)。実験群の中で、中用量のAcorus calamus L.群が最も創傷治癒が速かった( 表1参照)。

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ディスカッション

放射線による皮膚損傷は、臨床がん放射線治療における最も一般的かつ困難な合併症の一つとして依然として存在しています。最大の臓器であり、放射線の最初の標的である皮膚は、放射線によって生成される活性酸素や活性酸素による損傷を受けやすく、細胞分裂、移動、分化などの細胞機能を損なう可能性があり、最終的には創傷治癒の遅れや組織損傷を引き起こすことがある20,21。これらの損傷はしばしば紅斑、浮腫、再発性潰瘍、壊死として現れ、重症の場合は患者の生命を脅かすこともあります20,21放射線による皮膚損傷の現在の治療法は特異性に欠けているため、効果的な治療薬の発見が医学研究の重要な課題となっています。伝統的な中国薬用であるアコルスカラマスL.は、抗炎症作用、抗酸化作用、抗菌活性、フリーラジカル除去など多面的な薬理学的特性により創傷治癒促進の可能性

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この作業は遼寧省科学技術計画共同計画(技術対策プロジェクト)(2024JH2/102600273)および北方戦区総合病院独立研究プロジェクト(ZZKY2024001、ZZKY2024002、ZZKY2024003)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4%パラホルムアルデヒド固定溶液Beyotime Biotech Inc(Beyotime)、中国P0099
アコラスカラマスL.抽出物社内で準備該当なし; 詳細な準備プロトコルはプロトコルの第4節に記載されています。
抗バックス抗体  武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)GB11690
抗Bcl-2抗体武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)GB113375
抗bFGF抗体プロテテックグループ株式会社(中国湖北省武漢市)11234-1-AP
抗P53抗体 武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)GB111740
抗VEGF抗体およびnbsp;武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)GB111971
BCAタンパク質アッセイキット 武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)G2026-200T
ベタメタゾンクリーム ユナイテッド・ファーマシューティカル株式会社(中国)該当なし;濃度:0.1% w/ 国家医薬品承認番号:H19994057
エタノール上海アラジン生化学技術有限公司E111991アコラス・カラマスL.抽出の抽出溶媒として使用されました。
ゲル・ブロットイメージングシステムBio-Rad Laboratories, Inc.(カリフォルニア州ハーキュリーズ、アメリカ)ケミドック議員
ヘマトキシリン・イオシン染色キット北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社(中国、北京)およびnbsp; G1120
HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(H+L)武漢サービスバイオテクノロジー株式会社(中国湖北省武漢市)GB23303
逆形蛍光顕微鏡オリンパス・コーポレーション(東京、日本)IX83  
マッソンSトリクロームステインキット北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社(中国、北京)およびnbsp; G1340
マイクロプレートリーダー(吸収、蛍光、発光検出用)Molecular Devices(サンノゼ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国)スペクトラマックス iD3
ペトロラタム中諾薬化学試薬有限公司(中国、上海)該当なし; 医薬品グレードのホワイトペトロラタム;融点:45-60 & デグ;Cünbsp;国家医薬品承認番号:H31022350
ラットIL-1&β;ELISA キット  Beyotime Biotech Inc(Beyotime)、中国PI303
ラットIL-6 ELISAキット  Beyotime Biotech Inc(Beyotime)、中国PI328
ラットTNF-&α;ELISA キット  Beyotime Biotech Inc(Beyotime)、中国PT516
TUNEL細胞アポトーシス検出キット(DAB)Beyotime Biotech Inc(Beyotime)、中国C1091

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