DLP 3DプリンティングおよびPDMS膜膨張による狭窄を伴う円形断面マイクロチャネルの製造 マイクロ流体血管モデル用

サマリー

本記事では、デジタル光処理(DLP)3Dプリンティングおよびポリジメチルシロキサン(PDMS)膜膨張を用いて、円形マイクロチャネルを作成する簡単かつ低コストの製造方法を紹介します。この方法は、血管オンチップや臓器オンチップの応用に適した滑らかで制御可能なバイオミメティックチャネルを生成します。

要約

生物血管の複雑な構造を模倣するマイクロ流体モデルは、血行動態、せん断応力、細胞挙動を正確にシミュレートするために円形断面チャネルを必要とします。従来のソフトリソグラフィー技術では、長方形のチャネルが形成されることが多く、生理的な流れパターンや人間の循環系の模倣が不十分です。ここでは、デジタルライトプロセッシング(DLP)3Dプリントマスターモールドとポリジメチルシロキサン(PDMS)膜膨張技術を統合し、高精度な円形マイクロチャネルを生成する、アクセス可能なハイブリッド製造手法を提案します。このプロトコルの主な目的は、可変狭窄形状を持つ生体模倣血管モデルを作成するためのクリーンルームフリー戦略を提供することです。

提案されたプロトコルは、4つの重要な段階で構成されています:(1) 材料収縮を考慮した10%の高さ補償を含むマスター金型のコンピュータ支援設計(CAD)、(2) 樹脂型のDLP 3Dプリントおよび後処理、(3) 薄手弾性膜へのPDMS鋳造および酸素プラズマ支援接合、(4) 制御された空気膜膨張後、円形構造を密封するための2回目のPDMS鋳造。この手法により、内部膨張圧力を慎重に調整することで、300μmから1000μmの範囲のチャネル直径を正確に調整できることが示されました。得られたマイクロチャネルの性能は、断面円形解析、走査型電子顕微鏡(SEM)による表面粗さ測定、接合安定性を確保するための空気圧バースト試験など、構造特性評価によって評価されました。本研究結果は、この手法が円形マイクロチャネルの利用可能かつ再現可能な製造を支援し、血管生理学、血栓症モデリング、薬物スクリーニング分野の将来の研究に強力な基盤を提供することを示しています。

概要

生物血管を模倣したマイクロ流体システムは、将来の血管生理学、疾患メカニズム、薬物相互作用のin^vitro研究に^{不可欠です。}体内の多くの既存の構造の中で、円形断面形状は、自然の血管に見られるせん断応力や流路パターンなどの血行動態を正確に再現するために極めて^{重要です。}従来の製造方法、例えばソフトリソグラフィーやワイヤーやニードルを用いた犠牲成形は、長方形のチャネルや不完全な円形形状を生み出し、流れの歪みや生理学的関連性の低下を引き起こします(^4,5,6。さらに、これらの手法は時間がかかり、多層組立時のずれが起こりやすく、2つ以上の枝を持つ複雑な血管組立マイクロチャネルネットワークの設計時にはスケーラビリティが限定的^です7。しかし、特にデジタルライトプロセッシング(DLP)3Dプリントなどの付加製造技術の最近の進歩により、円形マイクロチャネルを含む複雑な構造物の迅速かつ精密なマイクロチャネル型製造の新たな機会が開かれ^ました。さらに、DLPはクリーンルーム設備を必要としないにもかかわらず、カスタマイズされた金型ジオメトリを卓越した解像度で印刷することを可能にします。

本研究では、DLP 3Dプリント型を統合し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)膜の膨張を伴う新しいクリーンルーム不要の製造戦略を提案します。簡単に言うと、このハイブリッドプロトコルは、(1) 半円形のPDMS層を生成する半チャネル型の設計・製造、(2) この層を薄いプラスチック膜に接着し、空気圧膨張と第二層鋳造を行い完全な円形マイクロチャネルを形成することから構成されます。この実験的手法は、多層マイクロ流体組立の他の技術よりも効率的で、低コストかつミスアライメントのないシンプルで低コストなアプローチを提供します。さらに、得られたチャネルの円形性は膨張圧力を調整することで正確に制御できます。

これらの利点に加え、提案されたプロトコルは迅速な製造時間(4時間未満)も提供しています。得られた円形構造は、直径が小さいチャネル長(例:300μm)で非常に一貫しています。さらに、この研究の実験結果(表面粗さ測定、光学イメージング、接触角測定、圧力バースト試験)により、構造の完全性と流体適合性が確認され、驚異的な再現性と適応性を持つ複雑な血管マイクロチャネルネットワークの製造に有望な未来が期待されています。最後に、提案された方法はクリーンルームインフラへのアクセスが限られている研究所に特に適しており、将来の血管オンチップ、血栓症モデリング、薬物スクリーニングの応用に大きな可能性を秘めています。

プロトコル

1. マスターモールドの製作

1. マスターモールド設計
   注:マイクロチャネルマスターモールドの設計はFusion 360を使用して行われ、公式ウェブサイトからダウンロード可能です。
   1. 型のベースを設計しましょう。
      1. Fusion 360を開いて、Oxyプレーン上で新しいスケッチを作成します。
      2. オリジンベースの角の長方形輪郭(例:30 mm×30 mm)を型のプラットフォームとしてスケッチします。
      3. フィ レット ツールを使って、半径3mmのコーナーをすべてフィレットで切ります。
      4. オフセットツールを使って、ベース輪郭を内側に3mmずらして壁の輪郭を作成します。
      5. エクストルードツールを使って、ベースプラットフォームの表面全体を2mm上方に押し出してベースを作ります。壁のプラットフォームを4mm上に押し出します。
      6. Modifyセクションの「Two Distance」オプション付きの面取りツールを使って傾斜を作成します。
      7. 内側の壁の端を選択し、1回目と2回目のオフセット距離をそれぞれ0.5mmと4mmに設定します。
         注:この工程は後のPDMSチップ脱型プロセスを容易にします。
   2. 円形マイクロチャネルを設計する。
      1. Oyz面から5mmと15mm離れた2つのオフセット面を構築します。
      2. 5mmオフセット面に直径1mmの円を描き、中心は酸素面から2mmずれています。
         注意:円の中心は台座の上面と一致するべきです。
      3. 円形のプロファイルを基底の内側に8 mm押し出し、マイクロチャネルの正則断面の最初の側面を得る。
      4. 15 mmオフセット面に、直径0.5 mm(または希望の狭窄径)の円を描き、中心は酸素面から2 mmずれます。
      5. 円形狭窄プロファイルを規則断面に0.25 mm押し出し、マイクロチャネルの狭窄の半分を得る。
      6. 作成セクションのLoftツールを使って、通常の切片と狭窄切片を接続し、狭窄・規則的な円形マイクロチャネルの半分を取得できます。
      7. ミラー ツールを 使い、15mmオフセットプレーンをミラープレーンとして円形マイクロチャネルのもう半分を作成します。
      8. 得られた円形マイクロチャネル本体全体を選択し>右クリック> 移動/コピー オプションを選択してください。
      9. マイクロチャネル本体をZ軸に沿って0.05 mm上方(狭窄径の10%)移動させます。
         注:この工程は印刷公差の補正高さを提供し、円形のマイクロチャネルを改善します。
      10. 同じ方法でさらに4つの円形マイクロチャネルを作成し、狭窄を0.4mmから0.1mmに減らします。
      11. 作成セクションのパターンツールを使って、さらに4つの規則切片と4つの円形狭窄症プロファイルを複製してください。
      12. スケッチ内の狭窄径プロファイルを調整し、各マイクロチャネルごとに ロフト ツールを適用します。
      13. マイクロチャネルボディを10%の補正高さ位置に変換します。
   3. マイクロチャネルマスターモールド設計をエクスポートします。STLファイル。
2. DLP 3Dプリント
   1. 加工パラメータを設定してください。
      1. Chitubox Softwareを開き、ツールバーで 「Open 」を選択し、マスターモールドを選択します。STLファイル
      2. ソフトウェア印刷プラットフォームのデフォルトで型を水平に配置します。
         注意:Z距離=0、角度=0°を確認してください。
         注意:コピー 作成 オプションを使って、一度に複数の型を配置・印刷してください。
      3. ツールバーの 印刷 オプションを開き、 レイヤー厚 を25μmに設定します。
      4. ス ライス オプションを選択し、推定印刷時間でスライス処理が完了するのを待ちます。次に 「印刷」 を選択して進めてください。
   2. マスターモールドの後処理。
      注意:樹脂の残留物をすべて除去し、欠陥の少ないカビ表面にするためにアルコール洗浄には2つの工程があります:(1)エタノールで洗う、(2)イソプロピルアルコールで洗う。
      1. マスター型を3Dプリンターのベースから取り出します。
      2. 印刷された構造物をペーパータオルで拭き取り、その後70%エタノールをカップに入れて10分間洗います。
      3. 洗濯ステーションで99%エタノールで15分間微細洗浄します。
      4. カビは室温で少なくとも10分間乾燥させます。
         注意:内側の型の表面に白く不規則な斑点がないか確認してください。もしマイクロチャネルの周りにまだ白色の残留物が残っている場合は、微細洗浄の工程をさらに1〜2回繰り返します。
      5. モールドを20 mW/cm^の 強度で5分間UV光にさらし、表面を完全に硬化させます。
      6. 型を65°Cで少なくとも12時間乾燥させ、化学物質の残留物を蒸発させ、表面を安定させます。

2. PDMS鋳造および型組立

注:PDMSベースのマイクロチャネル製造は主に3段階で構成されます:(1)前半円形マイクロチャネルのPDMS鋳造、(2)膜膨張、(3)後半の円形マイクロチャネルのPDMS鋳造。

1. PDMS準備
   1. PDMSのベースと硬化剤(例:SYLGARD 184)を10:1の重量比で混ぜます。
   2. 混合気を真空チャンバーで10分間、またはすべての気泡が除去されるまで脱ガスします。
2. 最初の半円形PDMSチップの鋳造
   1. 3Dプリントされた型をペトリ皿内の平らな面に置きます。
   2. 脱気されたPDMS混合物を型にかけ、半円形チャネルの厚さ4mmまで完全に浸します。
   3. PDMSを90°Cで40分9秒硬化^{させます。}
   4. 硬化したPDMS層を慎重に型から取り出し、必要に応じて端をトリミングしてください。
      注:PDMSチップには現在、凹型の半円形マイクロチャネルが含まれています。
3. 膜結合
   1. 厚さ25μmのプラスチック膜を5mm×25mmの長方形に切り取り、膜の上層を取り除く。
   2. PDMSチップの表面は透明テープで何度も清掃してください。
   3. 1mmの生検パンチャーを使ってマイクロチャネルの先端近くに入口を作ります。
   4. PDMSチップと膜をアルミホイルで覆われたプラットフォームの前方を向いて配置します。プラットフォームをプラズマクリーナーの中に入れます。
   5. 真空ポンプを60秒稼働させ、その後酸素プラズマレベルを30W、圧力レベル0.3 Torrで75秒間設定します。
   6. プラズマレベルと真空ポンプを止めて。
      注意:急激な圧力変化によるこぼれを防ぐため、真空ポンプを慎重に取り外してください。
   7. すぐにPDMSチップのマイクロチャネルと処理済み膜の面を整列させます。
      注意:2つの部品を適切に位置合わせるために慎重に配置してください。
   8. PDMSチップと膜を優しく押し付けます。
      注意:マイクロチャネルが膜の下で完全に密閉されていることを確認してください。ピンセットや印を使って手動で揃えましょう。プラズマから60秒以上遅れてはいけません。そうしないと結合効率が低下する恐れがあります
   9. 接着装置を90°Cのオーブンに20分間置き、表面を安定させて接着強度を高めます。
4. 膜の膨張
   1. 圧力記録システムを設置してください。
      注:圧力記録システムは3つのコンポーネントで構成されています:(1) 電動シリンジポンプ、(2) ノートパソコン、(3) Arduino Mega 2560。注射器は50mLのルアーロックです。
      1. 補足ファイル1にあるセンサー読み取りコードをダウンロードし、Arduinoボードにアップロードしてください。
         注意:コードが正常にコンパイルされているか確認してください。
      2. Tera Termソフトウェアを開いて圧力記録を記録してください。 セットアップ>シリアルポート>速度>115200。
      3. ファイルから「ログ」を選択して、時間経過による圧力の記録を開始します。
      4. 新しいログを記録するには 「New/Overwrite 」を選択し、タイムマーク付きの圧力ログを書き込むにはタイム スタンプ のチェックを入れます。
      5. 「 ブラウズ 」を選択して圧力ログを保存するフォルダを選択します。
      6. 電動シリンジポンプの オン/オフ ボタンを押し続けると起動し、 << を押すと圧力レベルの設定を始めます。
      7. 直径1.1mmの針をPDMSチップの入口に接続し、シリンジポンプの出口には柔軟なシリコーンチューブを接続します。
      8. 圧力レベルを30 mL/hに設定し、<<を押して膨張を開始します。
   2. 後半の円形マイクロチャネルの膜膨張およびPDMS鋳造を行います。
      1. インフレーションを開始し、 テラターム ログを使ってマイクロチャネル内の圧力レベルを監視します。
      2. 内部圧力が望ましいレベルに達したら膨張を止めます。
         注意:膨張圧力範囲は0.0〜17.5 kPaが推奨されます。圧力レベルが20 kPaを超えると膜破裂を引き起こす可能性があるためです。
      3. 膨張した膜PDMS構造の上に2〜3mm厚のPDMS層を鋳造します。
      4. 膨張した構造を安定させるために、90°Cで40分間連続加熱を行います。
      5. 2層目のPDMSが完全に硬化した時点で圧力レベルの記録を停止するには 、「Stop Logging on Tera Term」を選択してください。
      6. 圧力ログファイルは実験記録やさらなる調査用に保存してください。

3. 得られたPDMS血管マイクロ流体チップの特性評価

1. 表面粗さ特性評価
   1. 型型およびチャネル表面のデジタル3D顕微鏡を実施
      1. 3Dデジタル顕微鏡システムを用いて、製造されたPDMSチップおよび対応するDLP 3Dプリント型の表面地形を特徴付けます。
      2. 各サンプルごとに3つの特定の分析領域を特定し、マークしてください。
         注:マイクロチャネルの狭窄断面(A1)、通常のチャネル断面(A2)、およびチップの外部平面(制御)。
      3. 試料を顕微鏡ステージに取り付け、各位置で高解像度の3D地形を捉えるためにフォーカスを調整します。
      4. 内蔵ソフトウェアを使って表面プロファイルデータを取得し、粗さマップを作成し、平均表面粗さ(Sa)およびピークから谷までの高さ変動(Sz)を抽出します。
      5. 地形データと3D可視化をエクスポートし、異なる印刷条件(例:向きや層厚)で比較できます。
         注意:狭窄領域内の傾斜壁に注意してください。このゾーンの表面特徴は下流の流れ挙動やせん断応力分布に大きな影響を与える可能性があります。
   2. 走査型電子顕微鏡(SEM)を実施します。
      1. SEMを用いて、PDMSベースのマイクロチャネルの詳細な表面形態や微細構造の忠実度を解析します。
      2. 鋭い刃でマイクロチャネル領域を慎重に切断し、試料を導電性テープでアルミニウムのスタブに取り付けます。
      3. 金またはプラチナで60秒スパッターコートを施してチャージアーティファクトを減らしましょう。
      4. 狭窄領域をターゲットに、複数の倍率(例:200×および400×倍率)でSEM画像を撮影します。
      5. 縦方向と水平方向の型由来チップ間で、レイヤーラインの可視性、壁の滑らかさ、輪郭の移行を比較してください。
         注:水平印刷サンプルの階段状アーティファクトや垂直印刷型の方向性リッジは、製造品質とフロー忠実度の重要な指標です。
2. 半円および全円マイクロチャネルの幾何学的特徴付け
   1. カミソリの刃を使ってPDMSチップをマイクロチャネル軸に垂直にきれいにスライスして断面試料を準備します。
   2. 蛍光顕微鏡を使ってマイクロチャネルの断面図を捉えます。
   3. 画像をImageJソフトウェアに読み込み、線ツールを使ってH1、H2、Woを手動で測定します。
      注:H₁:成形された半円形溝の高さ(下部);H₂:膜の膨張高さ(上)。_Wo:基部のチャネル幅。
   4. 幾何学的比(H₁ +_{H 2}≈ Wo)を計算し、円環性を評価し、型設計と膨張挙動の検証を行います。
      注意:理想的には_H1 と_H2 は等しく、その和は完全な円形プロファイルでW_o に近似されるべきです。偏移は膨張不全、または膜の過剰伸展を示します。
3. 空気圧接合強度試験を行う
   注意:空気圧バーストテストは5つのコンポーネントで構成されています:(1) 電動シリンジポンプ、(2) 圧力センサー、(3) Arduino Mega 2560 マイクロコントローラ、(4) シリアル通信ケーブル、(5) ノートパソコン。
   1. 圧力センサーを柔軟なシリコーンチューブを介してPDMSマイクロチャネル入口に接続します。
   2. シリアルデータ読み取りスクリプトをアップロードしてArduinoを初期化します。
   3. 圧力監視用のTera Termソフトウェアを起動してください。
   4. シリンジポンプを運転して(例:40 mL/h)徐々に圧力をかけ始めます。
   5. リアルタイムで圧力データを記録できます。剥離、破裂、または目に見える漏れが起こるまで続けてください。
   6. 破裂圧力を構造破壊前の最終記録圧力値として定義します。この値は膜と成形されたPDMSチップ間の結合強度を表します。
4. 接触角を測ってください。
   1. デジタルサイドマウントカメラ、リングLED光源、ノートパソコンを使って接触角測定セットアップを組み立てて画像撮影を行います。
   2. 硬化したPDMSチップをカメラ下の水平なガラス台に置きます。
   3. マイクロピペットを使って2μLの脱イオン水滴をPDMS表面に分散します。
   4. カメラですぐに水滴のプロファイルを撮影してください。画像をエクスポートして分析してください。
   5. ImageJソフトウェアで画像を開き、「Analyze」セクションで「Drop Analysis - LB-ADSAプラグイン」を選択してください。
   6. 曲線フィッティングを調整して接触角を決めます。

結果

本研究は、DLP 3Dプリント型と膜膨張を用いてフル円形PDMSマイクロチャネルを製造するためのクリーンルームフリープロトコルを提示します。狭窄直径の異なる半円形マイクロチャネル金型の設計は 図1に示されており、印刷の向きが金型解像度に与える影響は 図2に示されています。金型印刷から膨張、第二層PDMS鋳造までの完全な製造ワークフローは 図3に示されています。

製造されたチップの表面濡れ性は静的接触角測定を用いて評価され、 図4に示されています。ImageJのLB-ADSAプラグインを用いて曲率フィッティングと角度抽出を行いました。SEMによる表面形態解析により、特に狭窄部で垂直印刷と水平印刷の型の違いが明らかになりました(図5)。定量的な粗さデータもこれらの観察を裏付け、垂直印刷の薄層...

ディスカッション

この研究では、DLP 3Dプリンティングと膜インフレーションを用いた円形PDMSマイクロチャネルのクリーンルームフリー製造プロトコルを開発しました。このプロトコルの重要なステップとして、熱硬化中のPDMSの等方性収縮を考慮し、CAD金型設計に10%の高さ補償を統合します。さらに、印刷向き、特に垂直方向の選択は、積層製造でよく見られる「階段状」のアーティファクトを最小限に抑えるために不可欠です。垂直印刷により、内面(Sa ≈ 5.7 μm)を大幅に滑らかに得ることができ、これは高精度の血管模倣に必要な半円形プロファイルの正確な再現に不可欠です。

この技術は実験的要件に応じて、いくつかの修正やトラブルシューティングの道を提供します。例えば、縦型印刷は滑らかさを最適化しますが、水平型印刷は表面の粗さを増加させることが観察でき、これは接合不良のトラブルシューティングに戦略的に活用できます。粗さの増加により、PDMSと膜界面のプラズマ支援結合時に機械的相互ロックが促進され、優れた構造安定性と最大390 kPaの破裂圧力の上昇...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dプリンター	エレグー・サターン3	該当なし	DLPベースの型印刷
3Dプリンティング樹脂	JAMG HE、韓国	該当なし	一般的なDLP印刷用の樹脂
Arduino マイコン	Arduino Mega 2560	該当なし	バーストテスト圧力監視に使用
デジタル3D顕微鏡	キーエンス、アメリカ	VHX-7100	表面粗さ特性評価
デジタルカメラシステム	カスタムメイド	該当なし	接触角イメージングに使用
電動シリンジポンプ	フレゼニウスSE&ドイツ、キガイア中隊	パイロットA2 CE2RS232	膜成形時の膨張に使用
蛍光顕微鏡	ニコン エクリプス Ti、アメリカ	該当なし	マイクロチャネルの幾何学的測定
Fusion 360ソフトウェア	オートデスク、アメリカ	https://www.autodesk.com/asean/products/fusion-360	設計ソフトウェア
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所	https://imagej.net/ij/	画像解析
PDMSの塩基および硬化剤	ドホワイトチ、韓国	https://www.dow.com/en-us/pdp.sylgard-184-silicone-elastomer-kit.01064291z	チップ鋳造に使用
ポリジメチルシロキサン	SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	1330-20-7	チップ製造に使用
圧力センサー	NXP	MPX5700AP	破裂試験中の内部圧力測定
ラピッドレジン	エレグー、中国	—	マスターモールド製造に使用
走査型電子顕微鏡(SEM)	全、日本	JSM T-100	表面形態イメージング
シリコーン膜(25 & micro;m)	—	—	膜膨張に使用