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方法論記事

経皮カプサイシン送達および脂肪組織還元のためのα-ラクトアルブミンナノミセルを充填した溶解可能なマイクロニードルパッチの製作

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DOI:

10.3791/69716

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Ludong University, 2Collaborative Innovation Center for the Pet Infectious Diseases and Public Health in the Middle and Lower Stream Regions of the Yellow River, Ludong University, 3Shandong Engineering Research Center for Aquaculture Environment Control, Ludong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、カプサイシンを充填したα-ラクトアルブミンナノミセルを用いて溶解可能なマイクロニードルパッチの製造を説明しています。この方法は、疎水性バイオアクティブ成分を脂肪組織に標的的に経皮送達するための再現可能かつ低侵襲的なアプローチを提供し、効率的な局所脂肪削減を促進し、肥満管理への応用拡大を可能にします。

要約

本プロトコルは、カプサイシンを脂肪組織への標的経皮送達のために、α-ラクトアルブミンナノミセルを含む溶解性マイクロニードル(MN)パッチの製作および適用を概説しています。この過程はα-ラクトアルブミンの部分的な酵素的加水分解から始まり、疎水性化合物カプサイシンを包むナノミセルに自己組み立てたアンフィフィル性ペプチドが生成されます。カプサイシンを含んだナノミセルはヒアルロン酸(HA)およびポリビニルアルコール(PVA)マトリックスと混合され、ポリジメチルシロキサン(PDMS)型に鋳造され、遠心分離して10個×10個のMNアレイを生成します。真空乾燥後、MNは皮膚に浸透するのに十分な機械的強度を示し、塗布から約30分以内に溶解します。代表的な成果としては、走査型電子顕微鏡によるMNの均一な形態、共焦点顕微鏡による皮膚浸透と薬物放出の検証、高脂肪食マウス(HFD)を用いたin vivo実験で脂肪量減少、代謝活動の促進、脂肪褐変の誘導が示されました。このプロトコルは、疎水性バイオアクティブ成分の経皮送達において再現可能かつ低侵襲的な方法を提供し、肥満管理における有望な治療アプローチを提供します。このプロトコルは再現性に最適化されており、他の疎水性バイオアクティブへの適応に適しています。

概要

肥満は先進国と発展途上国の両方で着実に増加している、最も差し迫った世界的に重要な健康課題の一つとなっています。世界保健機関によると、2016年には6億5,000万人以上の成人が肥満と分類され、2022年には≥18歳の成人の約43%が過体重、16%が肥満と共に生活していました。肥満は代謝症候群、心血管疾患、2型糖尿病、いくつかのがんと密接に関連しており、社会経済的および医療的負担が大きい 2,3。食事制限、運動、薬物療法、肥満手術などの現在の治療戦略は、部分的かつしばしば一時的な効果しかもたらしません。これらのアプローチは、患者の遵守率の低さ、長期的な有効性の限定、高侵襲性、望ましくない副作用を抱えることが多い4,5。したがって、肥満管理のための安全で効果的かつ患者に適合した局所的な治療法が緊急に求められています。

天然バイオアクティブ化合物は、その多標的作用と一般的に良好な安全性プロファイルから、肥満対策薬としてますます注目を集めています。例えば、フラボノイド糖体であるルチンは、脂肪生成転写因子を抑制しミトコンドリア生合成を促進することで、リポゲンおよび代謝調節の効果を示します。唐辛子の刺激成分であるカプサイシンは、エネルギー消費を促進し、白い脂肪組織の褐色化を誘発し、一時的な受容体ポテンシャルバニロイド1(TRPV1)シグナル伝達を活性化することで脂質蓄積を抑制すると報告されています7,8。しかし、これらの化合物の臨床的翻訳は、水溶液の低さ、経口での低い生体利用能、急速な代謝、そしてカプサイシンの場合は摂取時の消化管刺激により妨げられています。

ナノテクノロジーを基盤とした薬物送達システムは、これらの制約に対する有望な解決策を提供します。リポソーム、高分子ナノ粒子、タンパク質ベースのナノキャリアは、薬物の溶解度、安定性、細胞の取り込みを著しく改善できます10。特に、食品由来の乳タンパク質であるα-ラクトアルブミンは部分的に加水分解され、アンフィフィリン性ペプチドに変換され、自己組み立てされてナノミセルとなり、カプサイシン11のような疎水分子を封じ込めることができます。これらのα-ラクトアルブミンナノ構造は、食品および医薬品マトリックスにおける多様な疎水性バイオアクティブの溶解度、安定性、バイオ利用能を高めることが示されています(12,13)。それでもなお、ナノキャリアの全身投与は依然として標的外の組織分布や潜在的な全身毒性を引き起こす可能性があります14。

マイクロニードル(MN)技術は、経皮薬物送達のための低侵襲で患者に優しいプラットフォームとして登場しました。ヒアルロン酸(HA)やポリビニルアルコール(PVA)などの生体適合性高分子から調製された溶解性MNは、角質層に痛みなく浸透し、挿入後に溶解し、標的組織内で正確な局所薬物沈着を可能にします15,16。ナノキャリアとMNを組み合わせることで、皮下脂肪組織での薬物蓄積がさらに増加し、全身への曝露や副作用が減少します17。重要なのは、HAおよびPVAベースのMNパッチの溶解が、ワクチンやバイオ医薬品の経皮送達への臨床利用に向けて進められており、スケール18での安全性、患者受容率、製造可能性が良好であることを示しています。

これらの進展を基に、本研究ではカプサイシンを封じ込めたα-ラクトアルブミンナノミセルを充填した溶解性MNパッチの製造方法を記述します。このプロトコルでは、α-ラクトアルブミンを6 mg/mLで溶解し、酵素的加水分解して両親性ペプチドを生成し、カプサイシンを含んだナノミセルとして自己組み立てます。ナノミセルはHA/PVAマトリックス(それぞれ5% w/v)に組み込まれ、ポリジメチルシロキサン(PDMS)型に鋳造されて、針高600 μmの10 ×10 MNアレイを形成します。この構成は標準的なマイクロモールディングプロセスに対応し、より大きな人間サイズのパッチにも容易に拡張可能です。この統合設計は、カプサイシンの溶解性と安定性を向上させ、脂肪組織内でpH応答性の放出を提供し、脂肪組織の褐変化を促進し、脂質生成を抑制し、全身代謝パラメータ を改善することで局 所的な抗肥満効果を高めることが期待されています。食品グレードのαラクトアルブミンと臨床的に先進的な溶解性MN材料を活用することで、このプラットフォームは自己投与型局所的な肥満治療のための人間規模パッチに適応可能な翻訳関連の低侵襲戦略を提供します。

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プロトコル

すべての動物実験は『実験動物のケアと利用に関するガイド』に従って実施され、北京の実験動物倫理委員会によって承認されました。検査機関/研究者に割り当てられた承認番号はAW03019102-3です。使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. カプサイシン12を包むα-ラクトアルブミンナノミセルの製剤

  1. α-ラクトアルブミンを脱イオン水に6 mg/mLの濃度で溶解し、pHを7.4に調整します。磁気攪拌器で8〜28 × gで溶液をかき混ぜ、α-ラクトアルブミンが完全に溶けるまで(通常20〜30分)します。
  2. 菌類地衣類プロテアーゼ(BLP)を酵素と基質の比率1:100(w/w)で添加します。
  3. 混合物を50°Cで30分間培養し、両親性ペプチドを生成します。
  4. 反応を終えるために溶液を95°Cまで5分間加熱し、その後室温まで冷却し、0.22μmの膜を通してろ過します。
  5. カプサイシンをエタノールに溶けて1 mg/mLの濃度にします。カプサイシン溶液をペプチド溶液に滴ずつ加え、優しくかき混ぜます。
  6. ナノミセルの自己組織化を促すために2時間かき混ぜ続けます。
  7. 混合液(MWCO 3.5 kDa)を脱イオン水に対して12時間透析し、4時間ごとに水を補充して遊離カプサイシンを除去します。
  8. 準備されたαラクトアルブミンナノミセルを凍結乾燥(凍結乾燥)します。
  9. TEM、DLS、ゼータ電位解析を用いてナノミセルを特性評価します。

2. 溶解性マイクロニードルパッチの製造 11

  1. ポリマー溶液は、HA(5% w/v)とPVA(5% w/v)を60°Cの脱イオン水に溶かし、溶液が透明になるまでかき混ぜて準備します。
  2. ポリマー溶液を室温まで冷却し、カプサイシンを含んだナノミセル(M(Cap))と4:1の比率で混合します。
  3. 混合気を真空下で真空ポンプに接続した乾燥器(約−80 kPa)で10分間脱気し、気泡を除去した後、PDMS金型に鋳造します。
  4. 混合液200μLをPDMS金型(10×10針アレイ、高さ600μm)に装填します。
  5. マイクロニードルの空洞が完全に満たされるように、1800 g× g で10分間遠心分離してマイクロニードルの空洞を完全に満たします。
  6. 充填を一度繰り返し、その後ステップ2.5と同じ条件で2回目の遠心分離を行い、その後、常温で真空(約−80 kPa)で12時間乾燥させます。
  7. マイクロニードルパッチを型から慎重に剥がしてください。
  8. SEMによるマイクロニードルの形態を調べてください。

3. マイクロニードルの機械的試験 19

  1. マイクロニードルパッチをテクスチャアナライザーのステージに、針を上に向けて置きます。
  2. プローブで20 μm/sの速度でパッチを圧縮し、変位0.7 mmに達するまで続けます。
  3. 破砕力を記録し、針あたり≥0.15Nであることを確認して皮膚の貫通能力を確保してください。

4. 体外 挿入および溶解試験 11

  1. マウスの腹部皮膚を剃り、皮膚を切除して 体外 検査を行います。
  2. 切除した皮膚をアガロースジェルのサポート材の上に置きます。
  3. マイクロニードルパッチを30秒間しっかりと皮膚に押し当てます。
  4. パッチと皮膚の接触を30分間保ちます。
  5. 針の溶解を観察してください。
  6. 皮膚をH&E染色で染色し、CLSMの挿入部位を可視化します。

5. 体外 放出試験 11

  1. マイクロニードルパッチをPBSバッファー(pH6.5または7.4)に37°Cで浸します。
  2. 一定の間隔でバッファーサンプルを採取し、すぐに同量の新しいバッファーを補充します。
  3. HPLCを用いて採取したサンプル中のカプサイシン濃度を測定します。
  4. HPLCを用いて異なるpH条件下での放出プロファイルを比較します。

6. HFD誘発肥満マウスにおける in vivo 適用 11

  1. C57BL/6Nマウスに高脂肪食(HFD、脂肪から60kcal)を8週間与えることで肥満を誘発します。
  2. マウスをランダムに5つのグループに分けます:正常対照群、HFD対照群、空白ミセルマイクロニードルパッチ(MP-M)、カプサイシン満載ナノミセル注入(InJ-M(Cap))、およびカプサイシン満点ナノミセルマイクロニードルパッチ群(MP-M(Cap))群です。
  3. 各マウスの鼠径部を脱毛してください。
  4. 脱毛部位に2日ごとにマイクロニードルパッチを1枚塗り、28日間、パッチを30分間固定してください。
  5. 治療期間中は2日に一度体重と食事量を記録してください。
  6. 治療終了時にMRIで全身脂肪と脂肪の脂肪組成を分析します。
  7. 製造元の指示に従い、代謝ケージ内で身体活動量、酸素消費量、CO₂生成、呼吸率(RQ)を評価してください。
  8. iWAT、sBAT、主要臓器を採取し、H&Eで組織を固定、埋め込み、切断し、染色し、光顕微鏡で組織学的変化を評価する。
  9. TRPV1、PPARγ、C/EBPα、UCP1、Cyt Cに対して標準手順でウェスタンブロットを行います。

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結果

ナノミセルの形態と特徴付け
透過電子顕微鏡(TEM)では、α-ラクトアルブミンナノミセルが均一に分散し、狭いサイズ分布を持つ球状粒子であることが示されました(図1)。カプサイシンカプセル化後、平均粒子径は~22nmから~30nmに増加し、ミセラーコアへの薬物負荷が成功したことを示しています。一貫して、ゼータ電位は−16.8 mVから−20.3 mVへわずかにシフトし、効率的なカプセル化と表面特性の変化をさらに裏付けました。

3T3-L1脂肪細胞における細胞取り込みおよび抗脂肪生成効果
Cy3標識ミセルを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)により、ナノミセルが3T3-L1前細胞に2時間以内に迅速かつ効率的に取り込まれることが明らかになりました(図2A)。BODIPY染色では、M(Cap)が未処理対照群および遊離カプ...

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ディスカッション

本研究は、カプサイシン(M(Cap))を封じたα-ラクトアルブミンナノミセルを豊富に含んだ溶解性マイクロニードル(MN)パッチが局所的で低侵襲の抗肥満効果を達成できることを示しています。α-ラクトアルブミンナノミセルは疎水性カプサイシンを効率的にカプセル化し、水による分散性を向上させ、細胞の取り込みを促進し、3T3-L1脂肪細胞において自由カプサイシンよりも強力な脂肪形成の阻害とより顕著なミトコンドリア生合成をもたらしました。これらの結果は、タンパク質ベースのナノキャリアが脂溶性ニュートラシューティカルの生体利用能と細胞浸透性を向上させるという以前の研究と一致しています11。

溶解性MNは堅牢な経皮送達を提供しました。HA/PVAベースの針は均一な錐形の形状と十分な機械的強度を示し、皮膚貫通に適しており、約30分以内に溶解し、患者に優しい適用の重要な要件を満たしました。pH反応性の放出プロファイルは、pH ~6.5でpH7.4よりも速いカプサイシン放出を示し、脂肪組織...

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謝辞

このプロジェクトは、中国国家自然科学基金若手科学者基金(第32202024号)、山東省自然科学基金若手科学者基金(第4号)の支援を受けました。ZR2024QC103)、山東省の主要研究開発計画(2025CXGC010803、2022CXPT022)、山東省家禽産業技術システム(SDAIT-11-10)、および中国煙台市教育局が資金提供する大学・産業協力プログラム(ペット用次世代ワクチンプラットフォームの開発)などが含まれます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3T3-L1前細胞ATCCCL-173脂肪形成研究のための細胞株
バチルス・リケニフォーム・プロテアーゼ(BLP)シグマ・オルドリッチP5380&α;-ラクトアルブミンの酵素的加水分解
カプサイシン(≥98%)シグマ・オルドリッチM2028カプセル化する有効化合物
遠心分離機(≥4000 rpm)エッペンドルフ5810R型を詰めるために
共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)ツァイスLSM 900ミセルの分布と浸透を可視化するために
Cy3蛍光染料GEヘルスケアPA23001ナノミセルの標識化のために
Cy5またはCy7蛍光染料ファンボ生化学、北京、中国該当なしバイオディストリビューションイメージング用
ダルベッコ改良イーグルs中型(DMEM)Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)11965-092細胞培養用
エタノール(≥99.7%)シノファーム化学試薬100092683カプサイシンの溶媒
胎児用牛血清(FBS)Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)16000-044細胞培養用
高脂肪食(60% kcal脂肪、D12492)リサーチダイエット、アメリカD12492マウスに肥満を誘発するために
ヒアルロン酸
(HA、Mw 100–300 kDa)		アラジン生化学技術株式会社、中国H108124マイクロニードル製造用のポリマー
イソフルランRWD、中国R510-22-10麻酔
代謝ケージシステムパンラブ、アメリカ該当なし活動量、酸素消費量、RQの評価
ミリQ 脱イオン水ミリポール該当なし溶媒
MRIシステムニウマグ、中国メソQMR23-060H-I脂肪・赤身の体組成を測定するために
PDMSマイクロニードル型(10 & times; 10, 600 & mu;身長はm)ブルーエーカー技術かカスタムか該当なしマイクロニードル製造
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシンGibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)15140-122細胞培養用
リン酸緩衝塩水
 (PBS、pH 7.4)		サーモフィッシャー・サイエンティフィック10010023in vitroおよびin vivo試験のバッファー
ポリビニルアルコール
(PVA、Mw 30–70 kDa)		アラジン生化学技術株式会社、中国P109389マイクロニードル製造用のポリマー
走査型電子顕微鏡(SEM)FEIテクナイG2 F30マイクロニードルの形態を特徴づけるために
テクスチャアナライザーBosinTech、上海、中国ありがとう。XTC-20マイクロニードルの強度をテストするために
トリパンブルー溶液(0.4%)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15250061マイクロニードル挿入部位の可視化
UV–可視分光光度計パーキンエルマーラムダ35薬物放出アッセイ
真空オーブン/乾燥機サーモフィッシャー・サイエンティフィック該当なしマイクロニードルを乾かすために
ウェスタンブロッティング装置バイオ・ラッドミニプロテアン・テトラタンパク質解析
&α;-ラクトアルブミン(≥95%)シグマ・オルドリッチL6010ナノミセル形成のためのタンパク質源

参考文献

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